18 riarrangiamento
TRANSCRIPT
-
1Argomento della lezione
Riarrangiamento genico
-
2Gli immunologi per spiegare la struttura gli anticorpi si sono trovati davanti ad almeno tre grossi problemi:
lesistenza della enorme variabilit (diversit) del sito combinatorio; il repertorio anticorpale dato da tutte le specificit anticorpali disponibili in un individuo. Nelluomo, il loro numero totale almeno maggiore di 1011.
lesistenza nello stesso anticorpo di una parte variabile ed una costante;
lesistenza di diversi isotipi con la stessa specificitnella regione variabile.
-
3Gli immunologi per dare una spiegazione alla struttura particolare
degli anticorpi elaborarono due teorie:
1. La teoria della linea germinale (un gene per ciascuna diversa catena immunoglobulinica, repertorio in gran parte ereditato).
2. La teoria della variabilit somatica (modificazioni durante la vita di un individuo, partendo da un numero limitato di geni).
-
4La clonazione dei geni delle Ig ha rivelato che entrambe le teorie erano corrette:
- Sequenza di DNA codificante generata dal riarrangiamento di un numero relativamente piccolo di segmenti genici ereditati.
- Diversificazione aumentata attraverso processo di ipermutazione somatica che avviene nelle cellule B mature attivate
-
5Nella configurazione germinale (nel DNA) le catene pesanti e leggeresono codificate da famiglie multigeniche distinte, localizzate su cromosomi differenti.
Organizzazione multigenica dei geni delle immunoglobuline
Ciascuna famiglia multigenica contiene molteplici sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da sequenze non codificanti.
-
6La famiglia delle catene pesanti si trova su un singolo cromosoma (14) e contiene i segmenti genici V, D, J (regione variabile) e C (regione costante).
Le famiglie delle catene leggere e si trovano su due cromosomi differenti (2 e 22 rispettivamente) e contengono i segmenti genici V e J (regione variabile) e C (regione costante).
-
7I diversi segmenti genici nelluomo
40
25
Chromosoma 2 22 14
Regione Variabile
-
8Organizzazione germinale dei loci delle catene leggere e pesanti delle Ig
Locus catena (1050 Kb, cromosoma 22)
Locus catena (1820 Kb, cromosoma 2)
Locus catena H (1250 Kb, cromosoma 14)
-
9
-
10
Dimostrazione sperimentale della teoria di Bennett e Dreyer (modello a due geni) ad opera di Tonegawa e Hozumi (1976)
RE= enzimi di restrizione
Nelle cellule B, i geni delle Ig sono riarrangiatiSouthern
-
11
Meccanismi per determinare la diversit del repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
-
12
Riarrangiamento della catena pesante
LH1 VH1 LH2 VH2 LH VH~40JH 1-6
DNA germinale
DH1-25C
Ricombinazione DJEs: DH25-JH4
LH1 VH1 LH2 VH2 LH VH~40 CJH4 JH5 JH6DH25
VH2LH2Ricombinazione V-DJEs: VH2-DJ
CJH4 JH5 JH6DH25
RNA trascritto primario
CVH2LH2 JH4 JH5 JH6DH25
AAA
mRNADJVL C
AAA
Splicing
Trascrizione
-
13
Riarrangiamento genico o ricombinazione somatica della catena leggera K
DNA riarrangiato della catena K
JVL C
LK1 VK1 LK2 VK2 LK3 VK3 CKLK VK~40 JK 1-5
DNA germinale
Ricombinazione VJVK1LK1 CKJK3JK3 JK4 Jk5
JVL C
AAA RNA Trascritto primario
JVL C
AAA
Trascrizione
SplicingmRNA
-
14
Sequenza nucleotidica delle RSS (sequenze segnale di ricombinazione dallinglese Recombination Signal Sequence)
RSS a due giri RSS a un giro
eptamero eptamerononamero nonamero
RSS= eptameri e nonameri palindromici conservati Sequenze spaziatrici= 12 o 23 paia di basi
Sequenze spaziatrici a 12 paia di basi= un giro dellelica del DNA
Sequenze spaziatrici a 23 paia di basi= due giri dellelica del DNA
Meccanismi della ricombinazione somatica
-
15
Localizzazione delle RSS nel DNA germinale delle Ig
Regola 12/23
-
16
-
17
I segmenti genici della regione V sono riuniti grazie alla ricombinazione
Gli enzimi che catalizzano la giunzione tra i vari segmenti V-(D) J sono detti ricombinasi. Sono codificati da due geni, chiamati RAG-1 e RAG-2(dallinglese: Recombination Activating Genes: geni attivanti la ricombinazione).
SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency)
Altri geni implicati nella recombinazione VDJ: Ku70:Ku80, DNA-PK, Cernunnos, Arthemis la cui inattivazione responsabile di SCID nelluomo
Orientamento trascrizionale in direzioni opposte
Esoni V
e J:Stesso orientamento trascrizionale
-
18
Meccanismi per determinare la diversit del repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
-
19
1
2
3
4
5
6
-
20
-
21
Aggiunta dei nucleotidi P ad opera degli enzimi riparatori
Aggiunta dei nucleotidi N ad opera dell enzima TdT
TdT= enzima desossinucleotidil transferasi terminale
-
22
Riarrangiamento produttivo
Riarrangiamento non produttivo
Flessibilitgiunzionale
Flessibilit giunzionale
Due su tre riarrangiamenti non sono produttivi
-
23
-
24
-
25
-
26
Meccanismi per determinare la diversit del repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
-
27
Fattori che contribuiscono alla generazione della diversit del repertorio anticorpale
catene
N geni della linea germinale H V 40 40 30D 25 0 0J 6 5 4
Ricombinazione 40 x 25 x 6 = 6000 40 x 5 = 200 30 x 4 = 120
Associazione catene H e L 6000 x (200 + 120) = 1,9 x 106
-
28
Meccanismi per determinare la diversit del repertorio
1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversit giunzionale
3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di maturazione, negli organi linfatici centrali
Organi linfatici periferici
-
29
-
30
-
31
Lipermutazione somatica introduce diversificazione nella regione variabile riarrangiata
Mancanza di Citidina Deaminasi Indotta dallAttivazione (AID) blocca laccumulo di mutazioni somatiche
-
32
40
25
1,9 X 106
5 X 1013
3 X 1011
-
33
Immunoglobulina di membrana
-
34
Ig di membrana e secretoria
-
35
-
36
Co-espressione di IgM ed IgD
-
37
Isotype switch = Scambio di isotipo = Generazione di Ac con la stessa specificit antigenica ma funzioni effettrici diverse
-
38
Isotype switch = Scambio di isotipo
Mancanza di AIDblocca completamente lo scambio isotipico ed associato a immunodeficienza: sindrome da iper IgM di tipo 2.
Locus murino
-
39
-
40
SommarioLe catene pesanti e leggere sono codificate da famiglie multigeniche distinte, localizzate su cromosomi differenti.
Ciascuna famiglia multigenica contiene molteplici sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da sequenze non codificanti.
Le famiglie delle catene leggere e si trovano su due cromosomi differenti (2- 22 respettivamente) e contengono i segmenti genici V e J (regione variabile) e C (regione costante).
La famiglia delle catene pesanti si trova su un singolo cromosoma (14) e contiene i segmenti genici V, D, J (regione variabile) e C (regione costante).
-
41
La specificit del sito combinatorio determinata da:
ricombinazione dei vari segmenti genici,
diversit giunzionale (e aggiunta dei nucleotidi N, P),
associazione tra la catena pesante e quella leggera,
ipermutazione somatica
La stessa regione V pu essere associata con diverse regioni C, grazie allo scambio di isotipo che permette la produzione di Accon la stessa specificit antigenica ma funzioni effettrici diverse