18 riarrangiamento

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  • 1Argomento della lezione

    Riarrangiamento genico

  • 2Gli immunologi per spiegare la struttura gli anticorpi si sono trovati davanti ad almeno tre grossi problemi:

    lesistenza della enorme variabilit (diversit) del sito combinatorio; il repertorio anticorpale dato da tutte le specificit anticorpali disponibili in un individuo. Nelluomo, il loro numero totale almeno maggiore di 1011.

    lesistenza nello stesso anticorpo di una parte variabile ed una costante;

    lesistenza di diversi isotipi con la stessa specificitnella regione variabile.

  • 3Gli immunologi per dare una spiegazione alla struttura particolare

    degli anticorpi elaborarono due teorie:

    1. La teoria della linea germinale (un gene per ciascuna diversa catena immunoglobulinica, repertorio in gran parte ereditato).

    2. La teoria della variabilit somatica (modificazioni durante la vita di un individuo, partendo da un numero limitato di geni).

  • 4La clonazione dei geni delle Ig ha rivelato che entrambe le teorie erano corrette:

    - Sequenza di DNA codificante generata dal riarrangiamento di un numero relativamente piccolo di segmenti genici ereditati.

    - Diversificazione aumentata attraverso processo di ipermutazione somatica che avviene nelle cellule B mature attivate

  • 5Nella configurazione germinale (nel DNA) le catene pesanti e leggeresono codificate da famiglie multigeniche distinte, localizzate su cromosomi differenti.

    Organizzazione multigenica dei geni delle immunoglobuline

    Ciascuna famiglia multigenica contiene molteplici sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da sequenze non codificanti.

  • 6La famiglia delle catene pesanti si trova su un singolo cromosoma (14) e contiene i segmenti genici V, D, J (regione variabile) e C (regione costante).

    Le famiglie delle catene leggere e si trovano su due cromosomi differenti (2 e 22 rispettivamente) e contengono i segmenti genici V e J (regione variabile) e C (regione costante).

  • 7I diversi segmenti genici nelluomo

    40

    25

    Chromosoma 2 22 14

    Regione Variabile

  • 8Organizzazione germinale dei loci delle catene leggere e pesanti delle Ig

    Locus catena (1050 Kb, cromosoma 22)

    Locus catena (1820 Kb, cromosoma 2)

    Locus catena H (1250 Kb, cromosoma 14)

  • 9

  • 10

    Dimostrazione sperimentale della teoria di Bennett e Dreyer (modello a due geni) ad opera di Tonegawa e Hozumi (1976)

    RE= enzimi di restrizione

    Nelle cellule B, i geni delle Ig sono riarrangiatiSouthern

  • 11

    Meccanismi per determinare la diversit del repertorio

    1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)

    2. Diversit giunzionale

    3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera

    4. Ipermutazione somatica

  • 12

    Riarrangiamento della catena pesante

    LH1 VH1 LH2 VH2 LH VH~40JH 1-6

    DNA germinale

    DH1-25C

    Ricombinazione DJEs: DH25-JH4

    LH1 VH1 LH2 VH2 LH VH~40 CJH4 JH5 JH6DH25

    VH2LH2Ricombinazione V-DJEs: VH2-DJ

    CJH4 JH5 JH6DH25

    RNA trascritto primario

    CVH2LH2 JH4 JH5 JH6DH25

    AAA

    mRNADJVL C

    AAA

    Splicing

    Trascrizione

  • 13

    Riarrangiamento genico o ricombinazione somatica della catena leggera K

    DNA riarrangiato della catena K

    JVL C

    LK1 VK1 LK2 VK2 LK3 VK3 CKLK VK~40 JK 1-5

    DNA germinale

    Ricombinazione VJVK1LK1 CKJK3JK3 JK4 Jk5

    JVL C

    AAA RNA Trascritto primario

    JVL C

    AAA

    Trascrizione

    SplicingmRNA

  • 14

    Sequenza nucleotidica delle RSS (sequenze segnale di ricombinazione dallinglese Recombination Signal Sequence)

    RSS a due giri RSS a un giro

    eptamero eptamerononamero nonamero

    RSS= eptameri e nonameri palindromici conservati Sequenze spaziatrici= 12 o 23 paia di basi

    Sequenze spaziatrici a 12 paia di basi= un giro dellelica del DNA

    Sequenze spaziatrici a 23 paia di basi= due giri dellelica del DNA

    Meccanismi della ricombinazione somatica

  • 15

    Localizzazione delle RSS nel DNA germinale delle Ig

    Regola 12/23

  • 16

  • 17

    I segmenti genici della regione V sono riuniti grazie alla ricombinazione

    Gli enzimi che catalizzano la giunzione tra i vari segmenti V-(D) J sono detti ricombinasi. Sono codificati da due geni, chiamati RAG-1 e RAG-2(dallinglese: Recombination Activating Genes: geni attivanti la ricombinazione).

    SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency)

    Altri geni implicati nella recombinazione VDJ: Ku70:Ku80, DNA-PK, Cernunnos, Arthemis la cui inattivazione responsabile di SCID nelluomo

    Orientamento trascrizionale in direzioni opposte

    Esoni V

    e J:Stesso orientamento trascrizionale

  • 18

    Meccanismi per determinare la diversit del repertorio

    1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)

    2. Diversit giunzionale

    3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera

    4. Ipermutazione somatica

  • 19

    1

    2

    3

    4

    5

    6

  • 20

  • 21

    Aggiunta dei nucleotidi P ad opera degli enzimi riparatori

    Aggiunta dei nucleotidi N ad opera dell enzima TdT

    TdT= enzima desossinucleotidil transferasi terminale

  • 22

    Riarrangiamento produttivo

    Riarrangiamento non produttivo

    Flessibilitgiunzionale

    Flessibilit giunzionale

    Due su tre riarrangiamenti non sono produttivi

  • 23

  • 24

  • 25

  • 26

    Meccanismi per determinare la diversit del repertorio

    1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)

    2. Diversit giunzionale

    3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera

    4. Ipermutazione somatica

  • 27

    Fattori che contribuiscono alla generazione della diversit del repertorio anticorpale

    catene

    N geni della linea germinale H V 40 40 30D 25 0 0J 6 5 4

    Ricombinazione 40 x 25 x 6 = 6000 40 x 5 = 200 30 x 4 = 120

    Associazione catene H e L 6000 x (200 + 120) = 1,9 x 106

  • 28

    Meccanismi per determinare la diversit del repertorio

    1. Diversit combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)

    2. Diversit giunzionale

    3. Diversit nellassociazione tra la catena pesante e leggera

    4. Ipermutazione somatica

    Prime fasi di maturazione, negli organi linfatici centrali

    Organi linfatici periferici

  • 29

  • 30

  • 31

    Lipermutazione somatica introduce diversificazione nella regione variabile riarrangiata

    Mancanza di Citidina Deaminasi Indotta dallAttivazione (AID) blocca laccumulo di mutazioni somatiche

  • 32

    40

    25

    1,9 X 106

    5 X 1013

    3 X 1011

  • 33

    Immunoglobulina di membrana

  • 34

    Ig di membrana e secretoria

  • 35

  • 36

    Co-espressione di IgM ed IgD

  • 37

    Isotype switch = Scambio di isotipo = Generazione di Ac con la stessa specificit antigenica ma funzioni effettrici diverse

  • 38

    Isotype switch = Scambio di isotipo

    Mancanza di AIDblocca completamente lo scambio isotipico ed associato a immunodeficienza: sindrome da iper IgM di tipo 2.

    Locus murino

  • 39

  • 40

    SommarioLe catene pesanti e leggere sono codificate da famiglie multigeniche distinte, localizzate su cromosomi differenti.

    Ciascuna famiglia multigenica contiene molteplici sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da sequenze non codificanti.

    Le famiglie delle catene leggere e si trovano su due cromosomi differenti (2- 22 respettivamente) e contengono i segmenti genici V e J (regione variabile) e C (regione costante).

    La famiglia delle catene pesanti si trova su un singolo cromosoma (14) e contiene i segmenti genici V, D, J (regione variabile) e C (regione costante).

  • 41

    La specificit del sito combinatorio determinata da:

    ricombinazione dei vari segmenti genici,

    diversit giunzionale (e aggiunta dei nucleotidi N, P),

    associazione tra la catena pesante e quella leggera,

    ipermutazione somatica

    La stessa regione V pu essere associata con diverse regioni C, grazie allo scambio di isotipo che permette la produzione di Accon la stessa specificit antigenica ma funzioni effettrici diverse