laporan praktikum anis 1

7/21/2019 Laporan Praktikum Anis 1

1/25

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISA INSTRUMENT

SPEKTROFOTOMETER

ULTRAVIOLET-VISIBLE

Disusun oleh :

kelompok 4 kelas A:

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2013

Yeyet Durotul Yatimah 1110102000013

Myra Kharisma 1110102000027

Anas 1110102000035

Yanti Puspitaningrum 1110102000043

RM. Rendy H 1110102000045

Jaga Paramudita 1110102000063

Melia Puspitasari 1110102000065

Raden Atras S 1110102000073

Sri Wahyuni 1110102000077


2/25

I. Tujuan Praktikum

1. Memahami prinsip kerja alat spektrofotometer ultraviolet-visible

2. Mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu senyawa obat

(paracetamol & kofein)

3. Membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva kalibrasi,

akurasi, presisi, LOD, LOQ)

4. Membuat parameter validasi (akurasi, presisi, uji perolehan kembali, LOD, LOQ)

5. Penetapan kadar dalam sediaan (paracetamol generic 500 mg)

II. Dasar Teori

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan

panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di

transmisikan atau yang di absorpsi. Spektrofotometri juga merupakan suatu metode

analisis yang berdasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur

larutan berwarna pada panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan

monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum phototube atau tabung foton

hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu sutu alat yang digunakan

untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan

mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari

konsentrasi.

Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :

a) Spektrofotometer ultraviolet

b) Spektrofotometer sinar tampak

c) Spektrofotometer infra merah

d) Spektrofotometer serapan atom


3/25

Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat yang

berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra

lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan

ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul

tersebut (Harjadi, 1990). Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus

fungsional atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat

eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas.

Kromofor-kromofor organik seperti karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu

menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya dapat

berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional

yang mempunyai elektron bebas seperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus

kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang

yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas. Ketika cahaya melewati

suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah cahaya

ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Bila energi dari cahaya

(foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul

tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam

spektrofotometer (sutopo, 2006). Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan

dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian

menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang

diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar

pembaca (Sastrohamidjojo, 1992)

Hasil pengukuran yang baik dari suatu parameter kuantitas kimia, dapat dilihat

berdasarkan tingkat presisi dan akurasi yang dihasilkan.Akurasi menunjukkan kedekatan

nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. Untuk menentukan tingkat akurasi perlu

diketahui nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan kemudian dapat diketahuiseberapa besar tingkat akurasinya. Presisi menunjukkan tingkat reliabilitas dari data yang

diperoleh. Hal ini dapat dilihat dari standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran,

presisi yang baik akan memberikan standar deviasi yang kecil dan bias yang rendah. Jika

diinginkan hasil pengukuran yang valid, maka perlu dilakukan pengulangan, misalnya

dalam penentuan nilai konsentrasi suatu zat dalam larutan larutan dilakukan pengulangan


4/25

sebanyak n kali. Ilmu yang mempelajari interaksi radiasi dengan materi sedangkan

spektrofotometri adalahpengukuran kuantitatif dari intensitas radiasi elektromagnetik

pada satu atau lebih panjanggelombang dengan suatu transduser (detektor).

Spektrofotometri adalah analisis kuantitatif yang paling sering digunakan karena

mempunyai sensitivitas yang baik yaitu 10-4

sampai 10-6

. Analisis jenis ini juga relatif

selektif dan spesifik, ketepatannya cukup tinggi, relatif sederhana, dan murah ( Mathias,

2005).

Spektofotometri adalah metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk

menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang

didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam

spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya

visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun

yang lebih berperan adalah elektron valensi ( Sutopo, 2006 ).

Interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi

elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga

dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi

emisi. Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya,

baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga

sebagai spektroskopi absorbsi ( Eka, 2007).

Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan

Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber

cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu

sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan

monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan

paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk

sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektroskopi ultraviolet-visible atau

spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis) melibatkan spektroskopi dari

foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya dalam terlihat dan


5/25

berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR)) kisaran.

Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan

kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami

transisi elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi

berkaitan dengan transisi dari ground state ke eksited state. Penyerapan sinar uv dan sinar

tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :

a) Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan electron anti ikatan

b) Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks.

c) Penyerapan oleh perpindahan muatan.

Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan

oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen

yang berbeda.Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A = log ( Io / It ) = a b c

Keterangan :

Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorptivitas

b = Panjang sel/kuvet

c = konsentrasi (g/l)

A = Absorban

Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter

fotometri sebagai berikut :

1.Daerah jangkauan spectrum


6/25

Fotometer hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm).

Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380

nm) maupun IR (> 750 nm).

2. Sumber sinar

Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan

sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR).

Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.

3. Monokromator

Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro

digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.

4. Detektor

- Filter fotometer menggunakan detektor fotosel

- Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.

Panjang gelombang pada alat spektrofotometer lazim disajikan dalam satuan nm di mana

1 m = 10-9 nm.

B. Larutan standar

Larutan baku/ larutan standar adalah larutan yang konsentrasinya sudah diketahui.

Larutan baku biasanya berfungsi sebagai titran sehingga ditempatkan buret, yang

sekaligus berfungsi sebagai alat ukur volume larutan baku. Larutan yang akan ditentukan

konsentrasinya atau kadarnya, diukur volumenya dengan menggunakan pipet volumetri

dan ditempatkan di erlenmeyer (Basset, 1994).

Larutan baku primer

Larutan yang mengandung zat padat murni yang konsentrasi larutannya diketahui secara

tepat melalui metode gravimetri (perhitungan massa), dapat digunakan untuk menetapkan

konsentrasi larutan lain yang belum diketahui. Nilai konsentrasi dihitung melalui


7/25

perumusan sederhana, setelah dilakukan penimbangan teliti dari zat pereaksi tersebut dan

dilarutkan dalam volume tertentu. Contoh: K2Cr2O7, As2O3, NaCl, asam oksalat, asam

benzoat. Menurut Basset (1994) Syarat-syarat larutan baku primer :

Zat harus mudah diperoleh, dimurnikan, dikeringkan (jika mungkin pada suhu 110-120

derajat celcius) dan disimpan dalam keadaan murni. (Syarat ini biasanya tak dapat

dipenuhi oleh zat- zat terhidrasi karena sukar untuk menghilangkan air-permukaan

dengan lengkap tanpa menimbulkan pernguraian parsial.)

Zat harus tidak berubah berat dalam penimbangan di udara; kondisi ini menunjukkan

bahwa zat tak boleh higroskopik, tak pula dioksidasi oleh udara atau dipengaruhi

karbondioksida.

Zat tersebut dapat diuji kadar pengotornya dengan uji- uji kualitatif dan kepekaan

tertentu.

Zat tersebut sedapat mungkin mempunyai massa relatif dan massa ekuivalen yang besar.

Zat tersebut harus mudah larut dalam pelarut yang dipilih.

Reaksi yang berlangsung dengan pereaksi harus bersifat stoikiometrik dan langsung.

Larutan baku sekunder

Larutan suatu zat yang konsentrasinya tidak dapat diketahui dengan tepat karena berasal dari

zat yang tidak pernah murni. Konsentrasi larutan ini ditentukan dengan pembakuan

menggunakan larutan baku primer, biasanya melalui metode titrimetri. Contoh: AgNO3,

KmnO4, Fe(SO4)2.

Menurut Basset (1994) Syarat-syarat larutan baku sekunder :

Derajat kemurnian lebih rendah daripada larutan baku primer

Mempunyai berat ekivalen yang tinggi untuk memperkecil kesalahan penimbangan


8/25

Larutannya relatif stabil dalam penyimpanan.

Syarat larutan yang dapat digunakan untuk analisis campuran dua komponen adalah

Komponen-komponen dalam larutan tidak boleh saling bereaksi

Penyerapan komponen-komponen tersebut tiak sama

Komponen harus menyerap pada panjang gelombang tertentu

Senyawa-senyawa yang diukur dengan metoda spektrofotometri harus memenuhi hukum

Lambert-Beer, yaitu

Bila suatu sinar monokromatis dilewatkan pada medium pengabsorbsi,maka berkurangnya

intensitas cahaya per unit tebal medium sebanding dengan intensitas cahaya tersebut

Berkurangnya intensitas cahaya per unit konsentrasi akan berbanding lurus dengan

intensitas cahaya

Dari hukum Lambert Beer didapat rumus sebagai berikut

A = a.b.c A = -log T

Rumus yang digunakan untuk analisis dua komponen adalah :

A1 = ax1. b. cx + ay1 . b . cy

A2 = ax2 . b. cx + ay2 . b . cy

Dimana :

A1 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum pertama

A2 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum kedua

C = konsentrasi larutan


9/25

Keabsahan Hukum Beer

Kondisi berikut adalah keabsahan hukum Beer. Cahaya yang digunakan harus

monokromatis, bila tidak demikian maka akan diperoleh dua nilai absorbansi pada dua

panjang gelombang. Hukum tersebut tidak diikuti oleh larutan yang pekat. Konsentrasi lebih

tinggi untuk beberapa garam tidak berwarna justru mempunyai efek absorbsi yang

berlawanan. Larutan yang bersifat memancarkan pendar-fluor atau suspensi tidak selalu

mengikuti hukum Beer. Jika selama pengukuran pada larutan encer terjadi reaksi kimia

seperti polimerisasi, hidrolisis, asosiasi atau disosiasi, maka hukum Beer tidak berlaku.

Cara Kerja Spektrofotometer

Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan

pembanding, misalnya blanko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis

pada sel kedua. Kemudian pilih fotosel yang cocok 200-650 nm ( 650-1100 nm ) agar daerah

yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang fotosel dalam keadaan tertutup nol

galvanometer dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan, buk

fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blanko dan nol galvanometer didapat dengan

memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakn tombol transmitansi, kemudian atur

besarnya pada 100 %. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis.

Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.

Parasetamol

Parasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesic dan antipiretik yang populer dan

digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam.

Digunakandalam sebagian besar resep obat analgesic salesma dan flu. Ia aman dalam dosis

standar, tetapikarena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja atau tidak sengaja sering

terjadi.Parasetamol (Asetaminofen) merupakan salah satu obat yang paling banyakdigunakan sehari-hari. Obat ini berfungsi sebagai pereda nyeri dan penurun panas. Setelah

berpuluh tahundigunakan, parasetamol terbukti sebagai obat yang aman dan efektif. Tetapi,

jika diminum dalamdosis berlebihan (overdosis), parasetamol dapat menimbulkan kematian


10/25

Kafein

Kafein dikenal sebagai trimethylxantine dengan rumus kimia C8H10N4O2 dan termasuk

jenis alkaloida. Bentuk alami kafein adalah Kristal putih, prisma heksagonaldan dan

berbobot molekul 194,19 dalton. Kafein memiliki titik leleh 238C dan mengalami sublimasi

pada suhu 178C. Kafein terdapat secara alami pada biji kopi, bijicoklat, daun teh serta cula

nuts.Rumus Molekul kafeinKafein sebagai zat stimulant sering dituding sebagai penyebab

kecanduan. Haltersebut tidak sepenuhnya benar. Kafein hanya dapat menimbulkan

kecanduan jika dikonsumsi dalam jumlah yang sangat banyak dan rutin.

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut

memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi adalah untuk

menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat, handal

dan dipercaya.

Parameter yang diuji dalan validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang,

limit deteksi, limit kuantitas, spesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas dan uji

kesesuaian system.

1. Selektivitas

Adalah kemampuan metode analisis untuk mengukur kadar analit secara cermat dan

seksama degan adanya komponen-komponen lain dalamm sampel. Setiap sampel blangko

harus diuji iterferensinya pada batas terendah dari limit kuantitasi (LLOQ) dan

selektivitas harus menjamin tidak ada interferensi pada LLOQ.

2. Kecermatan

Adalah suatu metode analisis yang menggambarkan kedekatan hasi penetapan yang

diperoleh dengan kadar analit sesungguhnya. Pengukuran dapat dilakukakan intra assay

(dalam satu run) dan inter assay (day to day variation). Pengukuran akurasi memenuhi

syarat jika nilai rata-rata %diff yang diperoleh 2%.

3. Keseksamaan

Adalah metode analisis yang menunjukkan kedekatan antara hasil pengujian dengan hasil

pengujian lainnya. Presisi diukur minimal lima kali pengukuran untuk tiap konsentrasi,


11/25

minimal digunakan tiga konsentrasi berbeda yaitu pada konsentrasi rendah, sedang dan

tinggi. Pengukuran presisi dilakukan secara intra assay dan inter assay. Suatu metode

dikatakan presisi jika nilai koefisien variasi (KV) untuk masing-masing tingkat

konsentrasi tidak boleh 2%/

4. Kurva kalibras

Adalah hubungan antara respon instrument dengan konsentrasi anailt yang diketahui.

5. Linieritas dan rentang

Adalah kemampuan metode yang memberikan respon secara langsung, proporsional

terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas diperoleh dari koefisien korelasi (r )

pada analisis regresi ;inier yang di dapat dari kurva kalibrasi. Dengan diakukan ujian ini,

maka dapat diketahui batas-batas konsentrasi dari analit yang memberikan respon

detektor yang linier. Rentang metode adalah pernyataan konsentrasi terendah dan

tertinggi analit yang dianalisis memberikan kecermatan, keseksamaan dan linieritas yang

dapat diterima.

6. Batas deteksi dan batas kuantitas

Adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan

respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji

batas. Batas kuantitasi diartikan sebagai kuantitas terkecil sampel yang masih dapat

memenuhi criteria cermat dan seksama.

7. Uji perolehan kembali

Merupakan perbandingan antara respon detektor analit yang diekstraksi dari sampel

biologis dengan respon detektor kadar yang sebenarnya daristandar murni. Uji perolehan

kembali dari analit tidak perlu 100%,, tetapi perolehan kembali dari analit dan baku

dalam presisi dan keberulangan harus konsisten. Persyaratan uji perolehan kembali

adalah 85-115%.


12/25

III. Alat dan Bahan

Alat

1. Spektrofotometer ultraviolet-visible

2. Timbangan Analitik

3. Pipet Mikro

4. Gelas Ukur

5. Baker Glass

6. Labu Ukur

Bahan

1.

Bahan Baku Standar (Parasetamol, Coffein)

2. Sampel Parasetamol Generik 500 mg

3. Aquadest

IV. Prosedur Kerja

I. Pencarian panjang gelombang optimum

a. Siapkan alat dan bahan

b. Buat larutan induk Koffein dengan konsentrasi 100 ppm dengan menimbang 10 mg

Kafein kemudian ad aquadest 100 ml

c. Buat larutan Koffein 10 ppm sebanyak 25 ml dengan mengambil 2.5 ml dari larutan

induk 100 ppm.

d. Ukur dengan spektrofotometer UV-Vis, hingga di dapat panjang gelombang optimum

e. Hitung konsentrasi minimum dan maksimum dari hasil absorbansi yang didapat.

II. Kaliberasi Kafein pada panjang gelombang optimum

a.

Buat larutan dengan variasi konsentrasi antara konsentrasi maksimum dan minimum :

6,8,10,12,14 ppm.

b. Buat larutan konsentrasi 6 ppm dengan memipet 1,5 ml larutan 100 ppm kemudian ad

aquadest 25 ml.


13/25

c. Buat larutan konsentrasi 8 ppm dengan memipet 2 ml larutan 100 ppm kemudian ad

aquadest 25 ml.

d. Buat larutan konsentrasi 10 ppm dengan memipet 2,5 ml larutan 100 ppm kemudian

ad aquadest 25 ml.

e. Buat larutan konsentrasi 12 ppm dengan memipet 3 ml larutan 100 ppm kemudian ad

aquadest 25 ml.

f. Buat larutan konsentrasi 14 ppm dengan memipet 3,5 ml larutan 100 ppm kemudian

ad aquadest 25 ml.

g. Ukur serapan masing-masing konsentrasi dengan spektrofotometer UV-Vis pada

panjang gelombang 243 nm (optimum PCT) dan 273 nm ( optimum koffein).

h. Hitunglah nilai a,b dan r masing-masing menggunakan regresi linier.

III. Validasi Metode (presisi dan akurasi)

a. Ambil 2 konsentrasi (misal 6 dan 8 ppm ) yang digunakan dalam kalibrasi Koffein di

awal praktikum.

b. Konsentrasi 8 ppm untuk uji akurasi dan 6 ppm untuk uji presisi.

c. Buat larutan Koffein 100 ppm dengan menimbang 10 mg Kofein dan kemudian ad

aquadest 100 ml.

d. Pipet 1,5 ml larutan Koffein 100 ppm dan ad aquadest 25 ml untuk membuat larutan

Koffein 6 ppm. Lakukan sebanyak 5 kali.

e. Pipet 2 ml larutan Koffein 100 ppm dan ad aquadest 25 ml untuk membuat larutan

Koffein 8 ppm. Lakukan sebanyak 5 kali.

f. Ukur serapan masing-masing larutan dan hitung presisi dan akurasinya.

IV. Uji sampel Parasetamol dan Koffein

a. Timbang 20 tablet parasetamol generik lalu gerus dan timbang setara 500mg.

b.

Buat larutan induk parasetamol 5000 ppm dengan melarutkan parasetamol setara 500

mg yang di ad aquadest 100 ml.

c. Buat larutan parasetamol 100 ppm dengan memipet 2 ml larutan induk dan ad

aquadest 100 ml.


14/25

d. Kemudian buatlah larutan parasetamol-koffein 10 ppm dengan memipet 2,5 ml

larutan parasetamol 100 ppm dan 2,5 ml larutan koffein 100 ppm kemudian ad

aquadest 25 ml.

e. Ukur serapan masing-masing parasetamol dan koffein dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis.

V. Analisa Data

Prosedur 1: pembuatan spektrum.

Hasil:

1. Coffein di serap pada panjang gelombang maksimum 273 nm.

2. Paracetamol diserap pada panjang gelombang maksmum 243 nm.

3. Tidak melakukan penggabungan spektrum sehingga tidak diperoleh panjang gelombang

optimum.

Prosedur 2 : Pembuatan kurva kalibrasi.

Hasil:

1.

Mencari seri konsentrasi untuk pembuatan kurva kaibrasi.

A coffein = a.b.c.

0,48 = a . 1 . 10

a = 0,048

Mencari C min dan Cmax dengan memasukkan nilai A sebesar masng-masing 0,2 dan 0,8.

Untuk Cmin = 0,2 = 0,048 x 1 x Cmin

Cmin = 4,1667

Untuk Cmax = 0,8 = 0,048 x 1 x Cmax

Cmax = 16,6667

Maka konsentrasi seri yang dibuat harus berada pada rentang 4,1667 ppm 16,6667 ppm.

Kami membuat seri dengan konsentrasi 6ppm, 8ppm, 10 ppm, 12ppm, 14ppm.


15/25

2. Mencari absorbansi coffein dalam coffein pada serapan 273 nm.

3. mencari Absorbansi coffein dalam paracetamol pada serapan 243 nm.

y = 0,0497x + 0,001

R = 0,9995

R = 0,9998

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.60000.7000

0.8000

0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000 10.000012.000014.000016.0000

AxisTitle

Axis Title

coffein dalam coffein

X y

0,0000 0,0000

6,0000 0,30008,0000 0,3990

10,0000 0,5030

12,0000 0,5870

14,0000 0,7000

x y

0,0000 0,0000

6,0000 0,0850

8,0000 0,1070

10,0000 0,1370

12,0000 0,1630

14,0000 0,1910


16/25

4. Menghitung daya resap coffein dalam coffein.

A = a.b.c

A= absorbansi

a = serapan

b = tebal kuvetc = konsentrasi

A A b C0,3000 0,0500 1 6,0000

0,3990 0,0499 1 8,0000

0,5030 0,0503 1 10,0000

0,5870 0,0489 1 12,0000

0,7000 0,0500 1 14,0000

Nilai a rata-rata = 0,04982

5. Menghitung daya resap coffein dalam paracetamol.

A = a.b.cA= absorbansi

a = serapan

b = tebal kuvet

c = konsentrasi

y = 0,0136x + 0,0007

R = 0,9994

R = 0,9997

0.0000

0.0500

0.1000

0.1500

0.2000

0.2500

0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000 10.000012.000014.000016.0000

AxisTitle

Axis Title

coffein dalam paracetamol


17/25

A A b c

0,085 0,0142 1 6,0000

0,1070 0,0134 1 8,0000

0,1370 0,0137 1 10,0000

0,1630 0,0136 1 12,0000

0,1910 0,0136 1 14,0000

Nilai a rata-rata = 0,0137

Prosedur 3: pembuatan parameter validasi.

Hasil:

1. Mencari konsentrasi LOD dan LOQ coffein.

x Y y' y-y' (y-y')2

6,0000 0,3000 0,3002 -0,0002 4 x 10-8

8,0000 0,3990 0,399 0 010,0000 0,5030 0,498 0,0050 0,000025

12,0000 0,5870 0,5966 -0,0096 9,216 x 10-5

14,0000 0,7000 0,6954 0,0046 2,116 x 10-5

Sigma (y-y)2 1,3836 x 10-4

a = 3,8 x 10-3

b = 0,0494

r = 0,9993

y = 3,8 x 10-3 + 0,0494 x

Sb =

Sb = = 6,791 x 10-3

LOD = 3Sb/b

= 3

= 0,4124

LOQ = 10 Sb/b

= 10

= 1,3747


18/25

2. Membuat absorbansi menggunakan konsentrasi LOQ.

X Y

2,0000 0,1026

4,0000 0,2270

6,0000 0,3000

8,0000 0,3990

10,0000 0,5030

12,0000 0,5870

14,0000 0,7000

3. Menentukan nilai akurasi.

% recovery = Cf/Ca x 100%

Cf = konsentrasi yang diperoleh

Ca = konsentrasi yang ditambahkan

Cf Ca

%

recovery

8,109 8 101,36%

7,837 8 97,96%

8,044 8 100,55%

7,877 8 98,46%

y = 0.0485x + 0.0148

R = 0.9977

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

AxisTitle

Axis Title

Kalibrasi Coffein dengan batas LOQ


19/25

7,622 8 95,28%

98,72%

4. Menentukan nilai presisi.

Conc. (x yangdibuat)

Abs (y) Conc (x) (x-x)2

6 0,335 6,726 0,0640

6 0,379 7,621 1,3179

6 0,285 5,720 0,5670

6 0,354 7,100 0.627

6 0,259 5,198 1,6256

Rata-rata x=

6,473

4,2015

Presisi :

SD = = 1,0249RSD =

x 100% =

= 15,8335%

Prosedur 4: Penentuan kadar dalam sampel.

Hasil:

Atot = A1 + A2

Ket : A1 = kofein

A2 = PCT

A1= ax1. b. cx + ay1. b. cy

0,602 = 0.04982 cx + 0.02259 cy (1)

A2= ax2. b. cx + ay2. b. cy

0,797 = 0.0137 cx + 0.0737 cy(2)


20/25

Eliminasi persamaan 1 dan 2

0,797 = 0.0137 cx + 0.0737 cy x0.04982

0,602 = 0.04982 cx + 0.02259 cy x0.0137

0,0397065 = 0,00068253 Cx + 0,00367173 Cy

0,0082474 = 0,00068253 Cx + 0,00030948 Cy

0,0314591 = 0,0033623 Cy

Cy = 9,3564227 ppm

0,797 = 0,0137 Cx + 0,0737 Cy

0,797 = 0,0137 Cx + 0,0737 x 9,3564227

0,797 = 0,0137 Cx + 0,68956835

Cx = 7,8417 ppm

Persentase Kadar

Paracetamol =

Coffein =

VI. Pembahasan

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer

ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa

obat, serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi,

akurasi, presisi, LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan

adalah paracetamol dan kofein dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu

praktikum selama 2 kali pertemuan.

Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik

spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk

mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk


21/25

larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh

pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan

struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah

spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektra UV-Vis dari

senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-

tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul

organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau atom yang

mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat

energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding

dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk

analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan

antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Dibawah ini adalah

persamaan Lamber beer:

Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif.

Pada analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu

panjang gelombang maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang

maksimum dengan membuat spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk.

Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh

konsentrasi 10 um/mL . setelah itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk

menentukan panjang gelombang maksimum. Setelah dispektrofotometer didapatkan

panjang gelombang maksimum pada kofein 273 nm dan untuk paracetamol 243 nm.Berdasarkan iteratur panjang gelombang kofein adalah 272 nm dan panjang gelombang

paracetamol 242 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan panjang

gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Lalu

gabungkan kedua spektrum paracetamol dan kofein untuk menentukan panjang

gelombang optimum. Setelah itu membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang


22/25

gelombang maksimum yang diperoleh, dibuat lima seri konsentrasi larutan dari larutan

induk dengan menggunakan rumus Lambert Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi

larutan sebelumnya kami menentukan nilai konsentrasi minimum dan maksimum dengan

rumus A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat adalah 4,167 ppm dan nilai

konsentrasi maksimumnya 16,667 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri konsentrasi larutan

yaitu 6,8,10,12,14 ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada panjang

gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu

y=0,0497x + 0,001. sehingga diperoleh nilai resapan 0,04982 .

Setelah itu kami mencari nilai LOD dan LOQ. Nilai LOD didapat yaitu 0,4124

dan nilai LOQ yaitu 1,3747 nilai LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan

nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat

ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional

metode yang digunakan.

Selanjutnya kami menghitung parameter validasi. Parameter validasi berguna

untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam

penggunaannya. Tujuan utama validasi parameter adalah untuk menjamin metode analisi

yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal serta dapat dipercaya.

Parameter yang diuji dalam validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit

deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas, dan uji

kesesuaian sistem.

Pada praktikum untuk menentukan metode validasi penetapan kadar kafein

dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis, yang dilakukan hanya menentukan

akurasi dan presisi. Pada percobaan ini sampel yang diperoleh adalah kafein

yang berkhasiat sebagai stimulan saraf otak dan kardiotonikum. Parameter akurasi

merupakan parameter yang digunakan untuk melihat kedekatan hasil uji dengan nilai

yang sebenarnya. Syarat nilai akurasi antara 80%-110%. Untuk menentukan nilai akurasi

kami membuat lima buah larutan dengan konsentrasi yang sama yaitu 8 ppm. Setelah itu

di spektrofotometer uv-vis, dan nilai akurasi yang didapat adalah 98,72 %sehingga dapat

dikatakan bahwa nilai perolehan kembali ini memenuhi persyaratan dan hal ini


23/25

menunjukkan bahwa penetapan kadar kofein dengan spektrofotometri memiliki akurasi

yang cukup baik, karena berada pada rentang persyaratan.

Sedangkan untuk menentukan nilai presisi, kamu juga membuat lima buah larutan

dengan konsentrasi yang sama yaitu 6 ppm. Setelah itu di spektrofotometer Uv Vis.

Nilai presisi yang didapat adalah 15,8335 %. Berdasarkan literatur syarat nilai presisi

atau RSD adalah < 2 %. Sedangkan pada kelompok kami nilai presisi yang didapt jauh

dari syarat yang ditentukan. Sehingga hal ini menunjukkan bahwa penetapan kadar kofein

secara spektrofotometri memiliki presisi yang tidak baik atau derajat kesesuaiannya

rendah. Ketidaksesuaian ini bisa disebabkan karena kurang teliti dan kurang hati-hati

dalam pembuatan larutan konsentrasi, seperti pada saat memipet atau mngambil larutan

kurang teliti atau kurang tepat serta peralatan yang digunakan kurang higienis sehingga

dikhawatirkan adanya pengotor dalam larutan.

Selain itu kami juga melakukan penetapan kadar kofein dan paracetamol. Untuk

menenetapkan kadar kofein dan paracetamol kami membuat larutan dengan masing-

masing konsentrasi 10 ppm. Setelah itu, ukur serapan pada panjang gelombang optimum

dengan spektrofotometer. Untuk menghitung kadar sampel menggunakan nilai regresi

linear. Kadar sampel paracetamol adalah 93.564 % sedangkan kadar kofein adalah 78.417

%. Dari hasil perhitungan tersebut kadar paracetamol sangat baik karena mendekati

100%, namun kadar kofein yang didapat cukup baik walaupun tidak terlalu mendekati

100%, kemungkinan hal ini dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam melakukan

setiap tahap demi tahap dalam praktikum.

VII. Kesimpulan dan Saran

1. Kesimpulan

Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya

jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul

sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh

molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik

dari molekul. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul

organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau


24/25

atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital

terluarnya dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.

Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit

yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Panjang gelombang maksimum Parasetamol adalah 243 nm dan koffein 273

nm.

Parameter validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu

berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter

tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

Parameter validasi yang diuji yaitu LOD, LOQ, akurasi dan presisi dengan

hasil sebagai berikut:

LOD = 0,4124 ppm

LOQ = 1,3747 ppm

Akurasi (%recovery) = 98,72%

Presisi (Koefisien Variant)= 15,8335%

Penetapan kadar dalam sediaan (paracetamol generic 500 mg)

Kadar PCT yang diperoleh : 93,56%

Kadar Coffein yang diperoleh : 78,42%

2. Saran

Ketelitian dan ketepatan dalam pengerjaan harus diperhatikan benar agar

mengurangi faktor kesalahan.

Pemipetan sebaiknya dilakukan oleh satu orang saja untuk mengurangi

kesalahan.

Untuk satu volume dilakukan satu kali pemipetan saja.


25/25

DAFTAR PUSTAKA

laporan praktikum anis 1

Documents