makalah asam nukleat hg 1

7/22/2019 Makalah Asam Nukleat HG 1

1/36

MAKALAH BIOLOGI MOLEKULER

Asam Nukleat

HG 1:

Ghilandy Ramadhan (1206242012)

Maylina Chandra Puspita (1206212451)

Evania Hutasoit (1206248483)

Nindya Bestari (1206255122)

Sabrina Zahra Fitriani (1206249391)

Vifki Leondo (1206238665)

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

2014


2/36

1

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI .........................................................................................................................1

STRUKTUR .........................................................................................................................2

FUNGSI ..............................................................................................................................9

SINTESIS ...........................................................................................................................14

DETEKSI .............................................................................................................................21

APLIKASI ............................................................................................................................30

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................34


3/36

2

I. SRUKTUR ASAM NUKLEAT

Asam nukleat merupakan suatu biopolimer yang memiliki bobot molekul tinggi denganmonomer-monomer yang disebut nukleotida. Asam nukleat terdapat pada semua sel hidup danbertugas untuk menyimpan dan mentransfer materi genetik, kemudian menerjemahkan informasi ini

secara tepat untuk mensintesis protein yang khas bagi masing-masing sel. Asam-asam nukleatterdapat pada jaringan tubuh sebagai nukleoprotein, yaitu gabungan antara asam nukleat denganprotein. Asam nukleat dalam sel ada dua jenis yaitu DNA (deoxyribonucleic acid) atau asamdeoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic acid) atau asam ribonukleat. Baik DNA maupun RNA berupaanion dan pada umumnya terikat oleh protein dan bersifat basa. Asam-asam nukleat ini merupakanmolekul-molekul yang membuat organisme dapat memproduksi komponen-komponen kompleksnyadari suatu generasi ke generasi berikutnya. Nukleotida dari suatu asam nukleat terdiri dari gugusfosfat, gula pentosa dan basa nitrogen. Gula pentosa merupakan molekul gula yang memiliki limaatom karbon. Gula pentosa terdiri dari dua jenis, yaitu ribosa dan deoksiribosa. Perbedaan antaragula ribosa dengan gula deoksiribosa terletak pada ikatan pada karbon nomor 2. Gula ribosamemiliki ikatan dengan hidroksil pada karbon nomor 2, sedangkan gula deoksi ribosa tidak terdapatikatan dengan hidroksil pada karbon nomor dua atau tidak memiliki satu atom oksigen pada karbonnomor 2. Oleh sebab itu, gula pentosa dinamakan gula deoksiribosa atau 2 deosiribosa.

Gambar 1. Gula ribosa dan deoksiribosa

(sumber :http://www.studyblue.com/notes/note/n/dna-structure/deck/107470)Basa nitrogen pada asam nukleat terdiri dari dua jenis yaitu purin dan pirimidin. Basa purin

mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin

(monosiklik). Basa purin terdiri dari dua jenis yaitu adenin dan guanin. Basa pirimidin terdiri dari tigajenis yaitu sitosin, timin dan urasil.

STRUKTUR DNA

Gambar 2. Purin dan pirimidin(sumber :http://amit1b.wordpress.com/the-molecules-of-life/)

Basa nitrogen dapat bergabung dengan gula ribosa maupun deoksiribosa dengan caramembentuk ikatan glikosidik antara N-9 pada purin atau N-1 pada pirimidin dengan atom karbonnomor 1 dan melepas molekul air. Basa nitrogen dengan gula pentosa yang bergabung dinamakannukleosida. Terdapat dua posisi dalam nukleosida yaitu syn- dan anti-. Posisi syn terjadi jika basanitrogen dan gula pentosa menunjuk kearah yang sama. Sedangkan posisi anti- terjadi jika basanitrogen dengan gula pentosa menunjuk kearah yang berlainan.

Gugus fosfat dapat bergabung dengan gula ribosa maupun deosiribosa dengan membentukikatan fosfomonoeter antara gugus fosfat dengan karbon nomor 5 pada gula ribosa maupun gula

deoksiribosa dan melepaskan molekul air. Jumlah fosfat yang terikat pada gula pentosa dapat lebihdari satu fosfat. Monomer nukleotida dapat berikatan satu sama lain melalui ikatan fosfodiester
http://www.studyblue.com/notes/note/n/dna-structure/deck/107470http://www.studyblue.com/notes/note/n/dna-structure/deck/107470http://www.studyblue.com/notes/note/n/dna-structure/deck/107470http://amit1b.wordpress.com/the-molecules-of-life/http://amit1b.wordpress.com/the-molecules-of-life/http://amit1b.wordpress.com/the-molecules-of-life/http://amit1b.wordpress.com/the-molecules-of-life/http://www.studyblue.com/notes/note/n/dna-structure/deck/107470


4/36

3

antara -OH di atom C nomor 3nya dengan gugus fosfat dari nukleotida berikutnya untuk membentukpolimer nukleotida. Kedua ujung polinukleotida yang dihasilkan menyisakan gugus fosfat di atomkarbon nomor 5' nukleotida pertama dan gugus hidroksil di atom karbon nomor 3 nukleotida terakhir.

Gambar 3. Ikatan fosfodiester dan glikosidik

STRUKTUR DNA

DNA Tersusun dari Rantai PolinukleotidaDNA memiliki ciri utama yaitu tersusun dari dua rantai polinukleotida yang saling berpilin

yang membentuk heliks ganda (double helix). Nukleotida terdiri dari fosfat yang bergabung dengangula pentosa, yang dikenal dengan 2-deoksiribosa, yang mengikat basa nitrogen. Gula pentosadisebut dengan 2-deoksiribosa karena tidak ada hidroksil pada posisi 2 atau tidak memiliki satuatom oksigen pada karbon nomer 2 yang membuat namanya disebut deoksi. Basa nitrogen dapatbergabung dengan 2-deoksiribosa dengan melepas molekul air antara hidroksil pada 1 karbon yangterdapat pada gula dan pada basa untuk membentuk ikatan glikosidik. Ikatan antara gula pentosadan basa nitrogen itu sendiri disebut dengan nukleosida. Fosfat dapat bergabung dengan 2-deoksiribosa dengan cara melepaskan molekul air dari fosfat dan hidroksil pada 5 karbon yang terdapat pada gula untuk membentuk fosfomonoeter. Penambahan fosfat pada nukleosida akanmembentuk nukleotida. Dengan demikian, dengan membuat ikatan glikosidik antara basa dengangula, dan dengan membuat ikatan fosfoester antara gula dan asam fosfat maka akan didapatkan

nukleotida. Nukleotida bergabung satu sama lain dalam rantai polinukleotida melalui 3 hidroksil dari2-deoksiribosa dari satu nukleotida dan fosfat melekat pada 5 hidroksil nukleotida lain. Hal inimerupakan hubungan fosfodiester dimana kelompok fosforil antara dua nukleotida memiliki satugula esterifikasi melalui 3 hidroksil dan gula kedua diesterifikasi melalui 5 hidroksil. Keterkaitanfosfodiester memberikan suatu polaritas pada rantai DNA. Polaritas ini digambarkan oleh asimetrinukleotida dan cara mereka bergabung. Rantai DNA memiliki 5 fosfatatau 5 hidroksil yang bebaspada salah satu ujung dan 3 fosfat atau 3 hidroksil yang bebas padaujung lainnya.

Gambar 4. Pembentukan nukleotida dengan pelepasan molekul air

Setiap Basa Nitrogen Memiliki Bentuk Tautomerik yang Lebih DisukaiBasa nitrogen pada DNA terbagi menjadi dua yaitu purin dan pirimidin. Purin terdiri dari

adenin dan guanin, sedangkan pirimidin terdiri dari sitosin dan timin. Basa nitrogen yang melekatpada deoksiribosa melalui ikatan glikosidik pada N1 dari pirimidin atau N9 dari purin. Setiap basa


5/36

4

nitrogen ada dalam dua keadaan alternatif tautomerik, yang berada dalam kesetimbangan satusama lain. Atom nitrogen melekat pada cincin purin dan pirimidin dalam bentuk amino pada bagianyang dominan dan jarang dipakai konfigurasi imino. Demikian juga, atom oksigen melekat padaguanin dan timin yang biasanya memiliki bentuk keto dan jarang menggunakan konfigurasi enol.Sebagai contoh, Gambar 5 menunjukkan tautomerization sitosin ke bentuk imino (a) dan guaninmenjadi bentuk enol (b). Seperti yang kita lihat, kapasitas untuk membentuk tautomer alternatifsering menjadi sumber kesalahan selama sintesis DNA.

Gambar 5. Tautomerik basa nitrogen

Dua Untaian dari Double Helix Dimiliki Bersama oleh Pasangan Basa dalam Orientasi Anti-Paralel

Double helix terdiri dari dua rantai polinukleotida yang disatukan secara lemah oleh ikatannon-kovalen antara pasangan basa. Adenin pada suatu rantai selalu dipasangkan dengan timinpada rantai lain, sedangkan guanin selalu dipasangkan dengan sitosin. Kedua untaian memilikiheliks yang sama secara geometris, akan tetapi pasangan basa nitrogen mengikat dengan polaritasyang berlawanan. Artinya, basa nitrogen 5 pada akhir satu untai dipasangkan dengan basa nitrogen3 padaakhir untai lainnya. Untaian tersebut dikatakan memiliki orientasi anti-paralel. Orientasi anti-paralel ini merupakan akibat dari stereokimia pasangan adenin dan timin serta guanin dan sitosin.Kedua Rantai dari Doub le HelixMemiliki Rangkaian komplementer

Pasangan antara adenin dan timin serta antara guanin dan sitosin berakibat pada hubunganyang saling melengkapi antara rangkaian basa nitrogen pada dua rantai saling terkait dan

memberikan karakter DNA self-encoding. Sebagai contoh, jika kita memiliki urutan 5-ATGTC-3pada satu rantai, maka rantai yang berlawanan harus memiliki urutan komplementer 3 -TACAG-5.Ketatnya aturan pasangan " Watson - Crick " didasarkan pada komplementari baik dari bentuk dansifat ikatan hidrogen antara adenin dan timin serta antara guanin dan sitosin. Adenin dan timin cocok,sehingga ikatan hidrogen dapat terbentuk antara kelompok amino exocyclic di C6 pada adenin dankarbonil pada C4 di timin, demikian pula, ikatan hidrogen dapat terbentuk antara N1 dari adenin danN3 timin. Sebuah penyusunan yang sesuai dapat digambarkan antara guanin dan sitosin, sehinggapasangan basa ini terdapat ikatan hidrogen dan bentuk yang saling melengkapi secara baik.Pasangan basa G:C memiliki tiga ikatan hidrogen, karena exocyclic NH2 di C2 pada guanin terletakberlawanan dan dapat membentuk ikatan hidrogen dengan karbonil di C2 pada sitosin. Demikianjuga, sebuah ikatan hidrogen bisa terbentuk antara N1 dari guanin dan sitosin N3 dan antara karbonildi C6 guanin dan exocyclic NH2 di C4 sitosin. Sebuah ciri utama dari double helix adalah bahwa

dua pasangan basa memiliki geometri yang sama persis, memiliki pasangan basa A:T ataupasangan G:C antara dua gula, namun tidak mengganggu susunan gula tersebut. Dengan kata lain,terdapat sekitar dua lipatan sumbu simetri yang menghubungkan dua gula dan empat pasanganbasa dapat diakomodasi dalam susunan yang sama tanpa distorsi dari keseluruhan struktur DNA .

Gambar 6. Pasangan Basa Nitrogen A:T dan G:C


6/36

5

Ikatan Hidrogen Pasangan Basa NitrogenIkatan hidrogen antara basa komplementer memberikan ciri yang mendasar pada helix

ganda, memberikan kontribusi bagi stabilitas termodinamika helix dan menyediakan informasi danspesifisitas pasangan basa. Secara sekilas, ikatan hidrogen mungkin tidak tampak memberikankontribusi penting bagi stabilitas DNA. Alasannya karena sebuah molekul organik dalam larutan air

akan membentuk ikatan hidrogen yang nyaman dengan molekul air. Akibatnya, untuk setiap ikatanhidrogen yang dibuat ketika pasangan basa terbentuk, ikatan hidrogen dengan air yang ada di sanarusak sebelum pasangan basa terbentuk. Dengan demikian, kontribusi energi bersih dari ikatanhidrogen untuk stabilitas double helix akan terlihat sederhana. Namun, ketika untaian polynucleotideterpisah, molekul air berbaris di bagian dasar. Ketika untaian datang bersama-sama dalam doublehelix, molekul air akan pindah dari dasar. Hal ini menciptakan gangguan dan meningkatkan entropi.Ikatan hidrogen bukan satu-satunya kekuatan yang dapat menstabilkan helix ganda. Kontribusipenting kedua berasal dari penumpukan interaksi antar basa.. Interaksi elektron awan (-) antarbasa dalam tumpukan heliks memberikan kontribusi yang signifikan bagi stabilitas double helix.Selain itu, ikatan hidrogen juga penting untuk spesifikasi pasangan basa.

Lekukan Mayor dan Minor Double HelixSebagai hasil dari struktur heliks ganda dari kedua rantai, molekul DNA merupakan polimer

panjang yang diperpanjang dengan dua alur yang tidak sama ukurannya satu sama lain. Adanyalekukan minor dan mayor merupakan akibat sederhana dari geometri pasangan basa. Sudut dimanadua gula menonjol dari pasangan basa (yang merupakan sudut antara ikatan glikosidik) adalahsekitar 120 untuk sudut sempit atau 240 untuk sudut lebar. Hasilnya, karena semakin banyaktumpukan pasangan basa di atas satu sama lain, sudut sempit antara gula pada salah satu ujungdari pasangan basa menghasilkan lekukan kecil dan sudut besar di tepi lain menghasilkan lekukanmayor. Jika gula menjauh dari satu sama lain dalam garis lurus, yaitu pada sudut 180 , kemudiandua lekukan akan memiliki dimensi yang sama dan tidak akan ada lekukan kecil dan besar.

Gambar 7. DNA double heliks

Lekukan Mayor Kaya dalam Informasi KimiaDi bagian pinggir setiap pasangan basa yang terkena lekukan mayor dan minor terdapat pola

donor dan akseptor ikatan hidrogen dan permukaan van der Waals yang mengidentifikasi pasangan.Tepi dari pasangan basa A : T menampilkan kelompok kimia pada lekukan mayor sebagai berikut:akseptor ikatan hidrogen (N7 pada adenin), donor ikatan hidrogen (gugus amino exocyclic pada C6dari adenin), akseptor ikatan hidrogen (gugus karbonil pada C4 dari timin) dan permukaan hidrofobikbesar (kelompok metil pada C5 timin). Demikian pula, pada tepi pasangan basa G : C menampilkankelompok dalam lekukan mayor sebagai berikut: akseptor ikatan hidrogen pada N7 dari guanin),akseptor ikatan hidrogen (karbonil pada C6 guanin), sebuah donor ikatan hidrogen (gugus aminoexocyclic pada C4 sitosin), hidrogen non - polar kecil (hidrogen pada C5 sitosin). Dengan demikian,

teradapat pola karakteristik ikatan hidrogen dan bentuk keseluruhan yang terpapar dalam lekukanmayor yang membedakan pasangan basa A : T dari pasangan basa G : C, dan A : T dari T : A, serta


7/36

6

G : C dari C : G. Kita dapat menganggap ciri ini sebagai kode di mana A merupakan akseptor ikatanhidrogen, D donor ikatan hidrogen, M adalah gugus metil, dan H merupakan hidrogen nonpolar.Dalam kode tersebut, A D A M pada lekukan mayor menandakan pasangan basa A : T, dan A A DH singkatan dari pasangan basa G : C. Demikian juga, untaian M A D A untuk pasangan basa T : Adan H D A A adalah karakteristik dari pasangan basa C : G. Dalam semua kasus, kode kelompokkimia dalam lekukan mayor menentukan identitas pasangan basa. Pola ini penting karenamemungkinkan protein untuk mengenali rangkaian DNA tanpa harus membukanya. Mekanisme

decoding utama bergantung pada kemampuan rantai pinggir asam amino untuk menonjol ke alurutama untuk mengenali dan mengikat urutan DNA tertentu. Lekukan minor tidak begitu kayainformasi kimia dan informasi yang tersedia kurang berguna untuk membedakan antara pasanganbasa. Ukuran yang kecil dari lekukan minor kurang mampu mengakomodasi rantai samping asamamino. Dan juga , pasangan basa A : T dan T : A dan G : C dan C : G terlihat mirip satu sama laindalam lekukan minor. Lekukan minor memang terlihat berbeda ketika membandingkan pasanganbasa A : T dengan pasangan basa G : C, tetapi G : C dan C : G , atau A : T dan T : A , tidak dapatdengan mudah dibedakan.

Gambar 8. Kelompok kimia dalam lekukan mayor dan minor pasangan basa dari samping

Konformasi Double Helix

Menurut Ussery (2002), tiga bentuk atau konformasi DNA yang umum dikenal adalahkonformasi A, B, dan Z. Konformasi B merupakan bentuk DNA yang paling umum pada kromosomorganisme dan yang umumnya kita pelajari, dengan bentuk double helix. B-DNA adalah helikstangan kanan dengan 10 pasangan basa per putaran. B-DNA direplikasi dan digunakan dalam

transkripsi dan translasi RNA, yang merupakan molekul yang digunakan untuk sintesis protein. B-DNA dapat terdenaturasi, yang berarti ikatan hidrogen dihilangkan. Ini pada dasarnya adalahlangkah pertama dalam replikasi DNA dalam sel. Konformasi A juga berbentuk double helix,bentuknya lebih pendek dan lebih tebal dibandingkan konformasi B. A-DNA merupakan helikstangan kanan. Namun, ada banyak pasangan basa per putaran. A-DNA memiliki 11 pasangan basaper putaran. Ini adalah biologis aktif dalam sel, dan membentuk struktur mengkristal dalampercobaan laboratorium. Konformasi A dapat ditemukan pada RNA dan kompleks DNA-RNA.Konformasi Z merupakan konformasi DNA yang spesial. Tidak seperti konformasi A dan B yangmemiliki kiralitas tangan kanan, konformasi Z memiliki kiralitas tangan kiri. Dengan kata lain,konformasi Z ini seperti cerminan konformasi A dan B. Ia juga dikenal secara biologis aktif dalamformasi zigzag berulang urutan pasangan basa. Z-DNA memiliki 12 pasangan basa per putaran,sehingga membawa sebagian besar gen antara setiap pergantian. Z-DNA berperan dalamtranskripsi RNA, yang merupakan proses sintesis protein untuk menciptakan mRNA dari untai DNA.mRNA (message RNA) adalah molekul yang membawa gen ditranskripsi ke ribosom dimana protein


8/36

7

disintesis. Uniknya lagi, konformasi ini tidak ditemukan pada organisme prokariot, tetapi padaorganisme eukariotpada suatu daerah di genom yang bernama CpG island. Daerah ini mengandungbanyak basa sitosin (C) dan guanin (G). Sejauh ini, konformasi Z ditemukan berperan dalamtranskripsi gen, translasi gen, dan diferensiasi sel.

a b c

Gambar 9. Konformasi double helix DNA(a) B-DNA (b) A-DNA (c) Z-DNA

Tabel 1. Perbedaan ketiga konformasi double helix DNA

Ciri-ciri DNA-B DNA-A DNA-Z

Tipe helix Berpilin ke kanan Berpilin ke kanan Berpilin ke kiri

Diameter helical (nm) 2,37 2,55 1,84

Jarak antara dua pasangan basa(nm)

0,34 0,29 0,37

Jarak antara dua pasangan basadalam satu pilinan (nm)

3,4 3,2 4,5

Jumlah pasangan basa dalamsatu pilinan 10 11 12

Topologi lekukan mayor Lebar, dalam Sempit, dalam rata

Topologi lekukan minor Sempit, tidak dalam Dangkal, lebar Sempit, dalam

DNA Terdapat Dalam Bentuk Relaxed Circle dan Supercoi l

Pada sebagian organisme seperti bakteri, bakteriofag dan banyak virus hewan yangmengandung DNA, ujung-ujung molekul DNA disatukan hingga menciptakan suatu lingkarantertutup tanpa akhir. Tentu saja bentuk ini tidak akan menghancurkan polaritas molekul tersebut,tetapi menghilangkan semua gugus 3 serta 5 hidroksil dan fosforil yang bebas. Lingkaran tertutup

terdapat dalam bentuk relaxed circle atau supercoil. Supercoil terbentuk kalau suatu lingkarantertutup berpuntir di sekeliling sumbunya sendiri atau kalau bagian linier DNA dupleks yang ujungnyaterikat terpuntir. Proses yang memerlukan energi ini membuat molekul DNA berada dalam tekanan,dan semakin besar jumlah supercoil, semakin besar tekanan atau torsio. Supercoilnegatif dibentukkalau molekul DNA terpuntir dengan arah yang berlawanan dengan arah jarum jam pada heliksganda dominasi-kanan yang ditemukan dalam DNA bentuk B. DNA semacam ini dikatakanunderwound.Energi yang diperlukan untuk mencapai keadaan ini logikanya akan disimpan dalamsupercoil. Pengalihan menjadi bentuk lain yang memerlukan energi dengan demikian diperlancaroleh peristiwa underwinding. Salah satu pengalihan seperti itu adalah proses pemisahan benang,yang merupakan persyaratan bagi replikasi dan transkripsi DNA. Karena itu, DNA supercoilmerupakan bentuk DNA yang disukai dalam berbagai sistem biologi. Enzim-enzim yangmengkatalisis perubahan topologi DNA disebut topoisomerase. Topoisemorase dapat

mengendorkan atau menyisipkan supercoil. Topoisomerase dibagi menjadi dua kelas yaitu Kelas I topoisomerase memotong rantai induk fosfodiester satu untai DNA, melewati ujung lain,

dan kemudian reseal rantai induk.


9/36

8

Kelas II topoisomerase memotong kedua untai DNA, melewati beberapa DNA yang tersisa helixantara potongan akhir, dan kemudian reseal.

Yang paling khas adalah girase bakterial, yang menimbulkan supercoilingnegatif dalam DNAdengan menggunakan ATP sebagai sumber energi. Supercoiling dari DNA nuklir eukariota (sepertitumbuhan dan hewan) lebih rumit daripada supercoiling dari DNA sirkular dari prokariota. DNAeukariotik dikomplekskan dengan sejumlah protein, terutama dengan basa protein yang memiliki

rantai samping berlimpah bermuatan positif pada fisiologis (Netral) pH.

STRUKTUR RNA

RNA merupakan polinukleotida rantai tunggal yang berpilin yang berfungsi sebagaipenyimpan danpenyalur informasi genetik. Struktur primer RNA secara umum mirip dengan DNA,namun terdapat tiga hal yang membedakan antar DNA dan RNA. Pertama , tulang punggung RNAmengandung ribosa bukan 2-deoksiribosa. Artinya, ribose memiliki gugus hidroksil pada posisi 2.Kedua, RNA mengandung urasil yang menggantikan timin pada DNA. Urasil memiliki struktur cincintunggal yang sama seperti timin, namun urasil tidak memiliki kelompok 5 metil sedangkan timinmemiliki 5 Metil-urasil. Ketiga, RNA biasanya ditemukan sebagai rantai polinukleotida tunggal. RNA

terbagi menjadi 4 jenis yaitu rRNA, mRNA, tRNA, dan iRNA. Ribosomal RNA (rRNA) adalah RNAyang merupakan bagian dari Ribosom dan berfungsi untuk sintesis protein pada makhluk hidup.rRNA dan Ribosomal protein membentuk Ribosom dengan presetanse berat 60% rRNA dan 40%protein. rRNA terdiri dari dua jenis yaitu Large Subunit (LSU) dan Small Subunit (SSU).Terdapattiga binding sites pada Ribosom yaitu A (Aminoacyl-tRNA bindign site), P (Peptidyl-tRNA bindingsite) dan E (Exit site). RNA Transfer adalah RNA yang berfungsi menerjemahkan kode genetik dariRNA Duta (mRNA) dan membawa asam amino spesifik ke Ribosom dalam proses sintesis protein.tRNA disebut juga antikodon yang memiliki kodon komplemen dari mRNA atau kodon. mRNA adalahRNA yang bertugas untuk mengkopi susunan genetik suatu DNA untuk dapat dibawa ke ribosomdimana nantinya akan dimulai pembentukan protein. Dalam pembentukan protein, mRNA akandicari pasanganan asam aminonya oleh tRNA. Struktur mRNA terdiri dari ujung 5, daerah koding,dan untranslated region (UTR). Ujung 5 adalah ujung awal dari mRNA yang terbuat dari guanin

yang telah dimodifikasi yang berfungsi sebagai ujung yang dapat diidentifikasi oleh ribosom danmelindungi dari degradasi eksonukleat dan hanya terdapat sel eukariotik. Daerah koding adalahdaerah dimana transkripsi terjadi. Daerah koding terdiri dari kodon-kodon yang terbentuk daritranskripsi dengan DNA dan nantinya akan di translasi dengan tRNA. Untranslated Region (UTR)merupakan daerah yang tidak di translasi dari awal sampai akhir (5UTR dan 3UTR)dan terletak dikedua ujung mRNA. RNAi adalah merupakan potongan gen dengan panjang 21-23 nukleotida yangberasal dari dsRNA yang ditemukan oleh Andrew Z. Fire(Stanford University) dan Craig C. Mello(University of Massachusetts). RNAi terdiri dari 2 jenis RNA yaitu microRNA (miRNA) dan smallinterfering (siRNA)

Pembentukan Daerah Lokal Doub le HelixRantai RNA

Meskipun berbentuk untaian tunggal, molekul RNA sering memperlihatkan karakter doubleheliks. Hal ini dikarenakan rantai RNA sering melipat pada diri mereka sendiri untuk membentuksegmen pasangan basa nitrogen antara bentangan pendek dari rangkaian komplementer. Jika duabentangan dari rangkaian komplementer dekat satu sama lain, RNA dapat mengadopsi salah satudari berbagai struktur stem-loop dimana intervensi RNA melingkar keluar dari ujung segmen heliksganda sebagai sebuah jepit rambut (hairpin), tonjolan, atau loop sederhana. Stabilitas struktur stem-loop tersebut dalam beberapa kasus ditingkatkan dengan sifat-sifat khusus dari loop. Misalnya,stem-loop dengan rangkaian "tetraloop" UUCG secara tiba-tiba stabil karena interaksi tumpukanbasa khusus dalam loop. Pasangan basa dapat juga terjadi antara urutan yang tidak berdekatanuntuk membentuk kompleks struktur yang tepat bernama pseudoknots. Daerah pasangan basadalam RNA bisa menjadi double helix biasa atau mereka dapat mengandung diskontinuitas, sepertinukleotida noncomplementary yang meonjol keluar dari helix. Sebuah ciri dari RNA yang menambah

kecenderungan untuk membentuk struktur heliks ganda adalah tambahan pasangan basa nonWatson-Crick. Misalnya, pasangan basa G : U yang memiliki ikatan hidrogen antara N3 urasil dan


10/36

9

karbonil pada C6 guanin dan antara karbonil pada C2 urasil dan N1 guanin. Karena pasangan basaG : U dapat terjadi juga sebagai empat pasangan basa Watson-Crick konvensional, rantai RNAmemiliki ditingkatkan kapasitas diri saling melengkapi. Dengan demikian, RNA sering menunjukkandaerah lokal dari pasangan basa nitrogen. Kehadiran 2-Hidroksil dalam kerangka RNA mencegahRNA dari adopsi bentuk B-helix. Sebaliknya, RNA heliks ganda menyerupai bentuk struktur A DNA.Dengan demikian, lekukan minor menjadi lebar dan dangkal, dan karenanya dapat diakses, namunlekukan minor hanya memberikan sedikit informasi rangkaian spesifik. Sementara itu, lekukan utama

begitu sempit dan mendalam sehingga sangat tidak mudah untuk rantai asam amino sampingberinteraksi dengan protein. Dengan demikian, RNA heliks ganda cukup berbeda dari heliks gandaDNA dalam detail struktur atom dan kurang cocok untuk interaksi tertentu dengan protein (meskipunbeberapa protein mengikat RNA dengan cara tertentu).

Gambar 10. Karakterstik DNA double helix(a) Hairpin (b) Tonjolan (c) Loop

Gambar 11. Pseudoknot

Hammerhead Ribozyme Memecah RNA Melalui Pembentukan 2,3 Cyclic Phosphate

Hammerhead adalah rangkaian spesifik ribonuklease yang ditemukan dalam agen RNAinfeksi tertentu pada tanaman yang dikenal sebagai viroid, yang tergantung pada self-cleavageuntuk propagasi. Ketika viroid bereplikasi, dihasilkan beberapa salinan dari dirinya sendiri dalamsatu rantai RNA kontinu. Viroid tunggal muncul dengan cara membelah, dan reaksi pembelahan inidilakukan oleh rangkaian RNA di sekitar persimpangan. Satu rangkaian membelah diri sepertihammerhead karena bentuk struktur sekunder yang terdiri dari tiga batang pasangan basa ( I, II ,dan III ) yang mengelilingi inti nukleotida non-komplementer yang dibutuhkan untuk katalisis. PadapH tinggi, 2 hidroksil dari ribosa dalam kerangka RNA dapat terdeprotonasi, dan menghasilkanoksigen bermuatan negatif yang dapat menyerang fosfat scissile pada posisi 3 dari ribosa yangsama. Reaksi ini memutus rantai RNA dan menghasilkan 2,3 siklik fosfat dan 5 hidroksil bebas.Pada pH normal, enzim protein ini menggunakan ion logam yang terikat pada situs aktif mereka danmengaktifkan 2 hidroksil dari RNA.

II. FUNGSI ASAM NUKLEAT

ABSTRAKAsam nukleat yang terkandung dalam untaian DNA dikenal sebagai pembawa informasi genetik. .DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasitersebut dari tetua kepada keturunannya. Selain itu, DNA juga harus mengatur perkembanganfenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasiorganisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yangdilaksanakan melalui ekspresi gen. DNA sewaktu-waktu dapat mengalami perubahan sehinggaorganisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah.

Selain fungsinya sebagai materi genetik, DNA juga memiliki fungsi heterokatalitis (mensintesismolekul kimiawi lainnya secara langsung seperti mensintesis protein dan RNA), serta fungsi


11/36

10

autokatalis, yaitu DNA dapat mensistesa dirinya sendiri.

A. DNA

DNA merupakan sebuah bagian penting dalam hereditas. Informasi genetik dari satu

generasi ke generasi berikutnya dihantarkan oleh DNA. Berikut akan dibahas mengenai DNA daribeberapa sudut pandang.

1. Kromasomal

Secara umum, DNA membentuk gen dan kemudian gen membuat kromosom. Kromosomadalah struktur padat yang terdiri dari dua komponen molekul, yaitu DNA dan protein. Manusia baiklaki-laki maupun perempuan memiliki 23 pasang kromosom - total 46 kromosom. 22 pasangmerupakan kromosom autosom yang bersifat somatik, sedangkan satu pasang lainnya merupakankromosom seks . Kromosom ke 23 ini tentunya bergantung pada jenis kelamin seseorang, jadikromosom seks pria tentu berbeda dengan wanita. Wanita memiliki kromosom XX, sedangkan priakromosom XY.

Kromosom X berukuran lebih besar dan memiliki wilayah euchromatin lebih aktif daripada

kromosom Y. Euchromatin adalah bentuk ringan dikemas kromatin (DNA, RNA dan protein) yangkaya akan konsentrasi gen. Sedangkan kromosom Y mewakili sekitar 2% dari total DNA selmanusia. Kromosom Y manusia mengandung 86 gen, yang merupakan kode untuk hanya 23 proteinyang berbeda. Sifat yang diwariskan melalui kromosom Y disebut sifat holandric.

Selain kromosom seks, manusia juga memiliki pasangan kromosom autosomal yang tidakbergantung pada jenis kelamin. 22 dari 23 kromosom pada manusia merupakan DNA AutosomalDNA Autosomal merupakan istilah yang digunakan dalam silsilah genetika untuk menggambarkanDNA yang diwariskan dari kromosom autosomal. Autosom yang adalah pasangan kromosom yangditurunkan masing-masing 1 dari ayah dan 1 dari ibu. Proses bersatunya kromosom dari ayah danibu secara tidak teratur dinamakan recombination. Kromosom autosomal dapat menjadi geneticrecord karena akan terus mengalami recombination dari setiap generasi

2. Organisme

2.1. Virus

Asam nukleat pada virus dapat berupa untaian atau rantai tunggal (RNA) ataupun ganda(DNA). Sama seperti pada organisme lainnya, DNA pada virus juga berperan sebagai materigenetik. Banyaknya jenis virus dan jenis sel yang diinfeksi oleh beragam virus tersebut, digunakanDNA yang telah direkayasa atau dimodifikasi genetiknya untuk membawa DNA asing ke sebuah sel.Ini membawa pengaruh yang besar sebagai ekspirimen terapi gen.Virus harus berada dalam sel inang untuk dapat mereplikasi dirinya. Pada replikasi virus, dikenaltahap litik dan lisogenik. Pada pertengahan tahap infeksi oleh lisogenik , beberapa virus dapat

tinggal dalam jangka panjang dalam DNA sel inangnya , bahkan hingga bertahun-tahun tanpabanyak mengganggu kerja sel itu sendiri (silent virus). Virus yang memiliki kecendrungan tersebutdapat menyebabkan efek jangka panjang yang amat serius. Karena mereka dapat mengganggu genyang mengontrol siklus kehidupan normal sel , virus tersebut dapat mengakibatkan kanker dikemudian hari . Contohnya HPV (Human Papilloma Virus) yang sangat terkait dengan kankerserviks, atau dapat mengganggu gen yang berhubungan dengan kondisi lingkungan , seperti HIVyang mengganggu fungsi selT.

Pada tahap tengah hingga akhir fase lisogenik, DNA virus akan ditranskripsi danditerjemahkan oleh RNA dan protein yang diproduksi pada tahap awal dan pertengahan untukmenghasilkan

- Eksemplar dari DNA virus itu sendiri- Protein yang membentuk kapsid kosong yang mengandung DNA virus jika tidak dalam

sel


12/36

11

- Packaging protein, yang akan menempatkan keduanya bersama-sama, dan pada tahapakhir akan mentranskripsi dan menterjemahkan enzim litik yang dapat merobekmembran sel dan melepaskan virus salinan hasil replikasi .

Seperti kebanyakan DNA, fungsi dari DNA virus yang intinya ialah untuk mereplikasi diri ataumembuat lebih banyak virus. DNA yang dimiliki virus lisogenik , seperti apa yang dijelaskan di atas, memiliki manfaat dalam dunia medis serta bioteknologi. Jika pembentukan kode DNA virus

biasanya menghasilkan DNA tinggal lama pada kromosom sel inang, hal ini dapat memungkinkanberbagai macam gen yang berbeda dimasukkan ke dalam organisme inang. Hal ini dapat dilihatpada produksi insulin manusia menggunakan bakteri E. coli, serta implementasi terapi gen untukmengobati penyakit seperti cystic fibrosis dengan mengganti gen mutan dengan gen normal.

2.2 Prokariotik dan Eukariotik

Pada hampir semua sel eukariotik, DNA berada dalam inti sel, menempati sekitar 10% darivolume total sel. Bagian ini dibatasi oleh membran nukleus, yang dibentuk oleh dua membran lipidbilayer konsentris pada interval pori-pori nucleus (tempat transportasi antara inti dan sitosol).Sedangkan pada sel prokariotik, materi inti (DNA) terdapat dalam nukleoid yang tidak dibatasi olehmembran inti, misalnya bakteri dan ganggang.

Fungsi utama DNA pada prokariotik sama seperti pada sel manusia, yaitu transkripsi menjadi

asam ribonukleat (RNA) yang diikuti oleh penerjemahan menjadi asam amino dan berikutnya,menyambung asam amino-asam amino tersebut menjadi protein (fungsi heterokatalitis), dan fungsiautokatalis

3. Mitokondria

Sebagian besar DNA terletak dalam kromosom pada nukleus, namun pada mitokondria jugaterdapat sejumlah kecil DNA. Materi genetik ini dikenal sebagai DNA mitokondria atau mtDNA. Padamanusia, DNA mitokondria meliputi sekitar 16.500 ( pasangan basa ), yang mewakili sebagian kecildari total DNA dalam sel.

DNA mitokondria mengandung 37 gen, yang seluruhnya penting untuk fungsi mitokondrianormal. Tiga belas dari seluruh gen tersebut memberikan instruksi dalam pembuatan enzim yangterlibat dalam fosforilasi oksidatif. Fosforilasi oksidatif adalah proses yang menggunakan oksigendan gula sederhana untuk membuat adenosin trifosfat (ATP), sumber energi utama sel . Gen-genyang tersisa memberikan instruksi untuk membuat molekul yang disebut RNA transfer (tRNA) danRNA ribosom (rRNA) yang membantu transformasi asam amino menjadi protein yang fungsional.

DNA mitokondria rentan terhadap mutasi somatik , yang merupakan jenis mutasi yang tidakmenurun. Mutasi somatik terjadi dalam DNA sel-sel tertentu selama seumur hidup seseorang danbiasanya tidak diteruskan ke generasi berikutnya. Mutasi somatik pada DNA mitokondria dapatdikaitkan dengan berbagai penyakit kanker, seperti kanker payudara, usus besar, lambung, hati,serta tumor ginjal.

DNA mitokondria umumnya diuji untuk berbagai keperluan yang menyangkut masalahketurunan. DNA mitokondria merupakan untai DNA yang sensitif dan mutasi pada DNA tersebutdapat menyebabkan penyakit menurun. DNA mitokondria juga memungkinkan kita untuk melacakratusan generasi. Dalam forensik, mtDNA digunakan untuk mengidentifikasi mayat dan sisa-sisakerangka yang biasanya digunakan untuk melacak identitas seseorang yang terlibat dalam tindakancriminal. DNA menjadi lebih penting setelah ditemukannya teknologi kloning.

DNA mitokondria sangat berperan dalam produksi energi yang diperlukan untukkelangsungan hidup sel. DNA mitokondria memiliki fungsi khusus seperti semua DNA lainnya yaitumengatur kerja sel.


13/36

12

B. RNA

Sebagian besar sel prokariotik dan sel eukariotik juga memiliki asam nukleat yang lain yaituRNA. RNA singkatan dari ribonucleic acidatau asam ribonukleat. RNA merupakan hasil transkripsidari suatu fragmen DNA, sehingga RNA merupakan polimer yang jauh lebih pendek dibanding DNA.RNA juga dapat berfungsi sebagai katalis reaksi biokimia (dalam perannya sebagai ribozyme) .

RNA dapat dibedakan menjadi dua kelompok utama, yaitu RNA genetik dan RNA non-genetik. Pada prinsipnya, RNA genetik memiliki fungsi yang sama dengan DNA, yaitu sebagaipembawa informasi genetik. RNA genetik hanya ditemukan pada makhluk hidup tertentu yang tidakmemiliki DNA, misalnya virus. Dalam hal ini fungsi RNA menjadi sama dengan DNA, baik sebagaimateri genetik maupun dalam mengatur aktivitas sel. RNA non-genetik tidak berperan sebagaipembawa keterangan genetik sehingga RNA jenis ini hanya dimiliki oleh makhluk hidup yang jugamemiliki DNA.

Berdasarkan letak dan fungsinya, RNA non-genetik terbagi lagi menjadi :

1. Messenger RNA (mRNA)

mRNA merupakan RNA yang urutan basanya komplementer (berpasangan) dengan salah satuurutan basa rantai DNA. RNA jenis ini merupakan polinukleotida berbentuk pita tunggal linier dandisintesis oleh DNA di dalam nukleus. Panjang pendeknya mRNA berhubungan dengan panjangpendeknya rantai polipeptida yang akan disusun. Urutan asam amino yang menyusun rantaipolipeptida itu sesuai dengan urutan kodon yang terdapat di dalam molekul mRNA yangbersangkutan. mRNA bertindak sebagai pola cetakan pembentuk polipeptida. Adapun fungsiutama mRNA adalah membawa kode-kode genetik dari DNA di inti sel menuju ke ribosom disitoplasma. mRNA ini dibentuk bila diperlukan dan jika tugasnya selesai, maka akan dihancurkandalam plasma.

Setiap gen pada DNA berisi petunjuk untuk membuat satu protein spesifik dengan urutan asamamino dikode oleh urutan yang tepat dari amina heterosiklik pada nukleotida

2. Transfer RNA (tRNA) atau ARNt (ARN transfer)

Transfer RNA dibentuk di dalam nukleus, tetapi kemudian terletak dalam sitoplasma. tRNAmerupakan RNA terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon dari mRNA, danmentranslasinya menjadi asam amino lalu menyusunnya menjadi sebuah protein

Transfer RNA merupakan RNA terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon darimRNA yang juga berfungsi mengikat asam-asam amino di dalam sitoplasma yang akan disusunmenjadi protein dan mengangkutnya ke ribosom. Bagian tRNA yang berhubungan dengan kodondinamakan antikodon.

3. Ribosomal RNA (rRNA) atau ARNr (ARN ribosomal)RNA ini disebut ribosomal RNA karena terdapat di ribosom meskipun dibuat di dalam

nukleus. RNA ini berupa pita tunggal, tidak bercabang, dan fleksibel. Lebih dari 80% RNAmerupakan rRNA. Fungsi dari RNA ribosom adalah sebagai perakit dalam sintesis protein yangbergerak ke satu arah sepanjang mRNA. Di dalam ribosom, molekul rRNA ini mencapai 30-46%.Dalam sitoplasma, RNA ribsomal (rRNA) dan protein bergabung membentuk nukleoprotein yangdisebut ribosom. Ribosom menempel pada m-RNA dan menyediakan struktur menstabilkan untukmenampung semua zat dalam posisi sebagai protein disintesis. Beberapa ribosom dapatmenempel pada RNA tunggal pada setiap saat. Di sudut kanan atas adalah sub satuan 30Sdengan mRNA dan tRNA terpasang.

4. MicroRNA (miRNA)


14/36

13

Pada dasarnya, miRNA merupakan pelengkap bagi bagian dari satu atau lebih messengerRNA (mRNAs). MiRNA juga berperan sebagai pendukung kerja RNAi. miRNA juga memiliki perananpenting yakni terlibat dalam ekspresi gen. miRNA berukuran sangat kecil (sebagian besar hanyapanjang sekitar 25 nukleotida). Sebagian Mirna mencegah transkripsi gen tertentu dan jika merekahilang, gen-gen akan terekspresi.

5. Transfer messenger RNA (tmRNA)

Transfer messenger RNA (tmRNA) memiliki beberapa fungsi, seperti memperbaiki ataumemperbaharui kerja ribosom, menambahkan proteolysis-inducing tagke polipeptida yang belumselesai terbentuk, dan membantu degradasi messenger RNA yang tidak sesuai. Pada kebanyakanbakteri, fungsi-fungsi ini dilakukan oleh satu tmRNAs. Dalam spesies bakteri lainnya, gen ssrA yangtelah mengalami permutasi menghasilkan dua tmRNA di mana dua rantai RNA yang terpisahberpasang-pasangan.

RNA yang stabil ini mengurangi jumlah ribosom yang tidak dapat menyelesaikan sintesisprotein pada mRNA yang kurang kodon stop.

6. Small nucleolar RNAs (snoRNAs)

Small nucleolar RNAs (snoRNAs) merupakan kelas molekul RNA kecil yang terutamamembimbing modifikasi kimia RNA lain, terutama RNA ribosom, dan RNA transfer. Kemajuanterbaru dalam bioinformatika telah menghasilkan algoritma baru dan dapat dengan cepatmengidentifikasi RNA noncoding umumnya dan khususnya di snoRNAs genomic. snoRNAs jugadapat berfungsi sebagai miRNAs. Baru-baru ini, telah ditemukan bahwa snoRNAs dapat memilikifungsi yang tidak berkaitan dengan rRNA.

7. RNA Interface

RNAi memiliki tugas penting yaitu mengendalikan aktivitas sel, serta menghentikan prosestranskripsi sehingga tidak berlanjut ke proses translasi. RNAi berperan penting dalam sistempertahanan terhadap informasi genetik asing (virus), mengatur proses perkembangan, dan dalamsejumlah aspek ekspresi gen lainnya .

RNAi sering disebut sebagai teknologi revolusioner karena membuka pintu untukmengembangkan terapi baru untuk kanker dan penyakit lainnya berdasarkan membungkam gentertentu. RNAi dapat memungkinkan kita mengeksplorasi fungsi dari setiap gen, sehingga kita dapatmenentukan bagaimana hal itu cocok ke dalam proses penyakit. Menggunakan RNAi, peneliti dapatmematikan gen individu, satu per satu, dalam rangka untuk mencari tahu mana fungsi merekakontrol. Setelah peneliti medis tahu, misalnya, bahwa sebuah gen tertentu merupakan penyumbangutama untuk proses penyakit tertentu, mereka dapat membuat target untuk pengembangan obatmasa depan, ia menjelaskan.

Berdasarkan penelitian RNAi awal, uji klinis telah dimulai di Amerika Serikat untuk beberapapenyakit, termasuk hepatitis C dan leukemia. Teknologi ini juga saat ini sedang digunakan untukmengeksplorasi degenerasi makula, penyebab utama kebutaan pada orang tua.

8. SiRNA

SiRNAs memiliki kemungkinan besar dapat berkembang sebagai respon kekebalan primitifditimbulkan oleh adanya asam nukleat asing. sRNA memiliki tugas utama sebagai pendukungmiRNA, dalam hal ini siRNA membantu pembelahan miRNA. siRNA atau molekul seperti siRNAterwakili di hampir setiap kingdom.

Selain kemampuan yang berguna untuk membungkam gen melalui penghambatan translasi,fungsi selular utama siRNA adalah perlindungan dari asam nukleat asing. Penemuan ini telah

menyebabkan meluasnya penggunaan teknologi ini untuk mempelajari fungsi gen mamaliatermasuk gen yang relevan secara klinis, menyinggung aplikasi terapi yang berbasis teknologi RNAi.


15/36

14

9. Non-coding RNA (ncRNA)

Istilah non - coding RNA (ncRNA) umumnya digunakan untuk RNA yang tidak mengkodeprotein, tapi ini tidak berarti bahwa RNA tersebut tidak mengandung informasi atau memiliki fungsi.Meskipun telah umum diasumsikan bahwa informasi genetik yang paling ditransaksikan oleh protein,bukti terbaru menunjukkan bahwa mayoritas genom mamalia dan organisme kompleks lainnyaadalah sebenarnya ditranskripsi menjadi ncRNAs , banyak yang alternatif disambung dan / atau

diolah menjadi produk yang lebih kecil . NcRNAs ini termasuk microRNAs dan snoRNAs (banyakjika tidak sebagian besar yang masih harus diidentifikasi), serta kelas-kelas lain kemungkinan belum- to-be - ditemukan RNA peraturan kecil, dan puluhan ribu transkrip lagi (termasuk pola-polakompleks jalinan dan rasa tumpang tindih dan transkrip antisense ), sebagian besar yang fungsinyatidak diketahui.

10. XistRNA (X Inactive transcript RNA)

XistRNA merupakan RNA yang terdapat dalam kromosom X, dan berperan penting dalamproses penonaktifkan kromosom X. Penonaktifan kromosom X ini melibatkan Xic (X inactivationcentre), Xist, dan Tsix.

11. Small nuclear RNA (snRNA)

snRNA Ditemukan dalam nukleus sel eukarIot. snRNA memiliki panjang sekitar 150nukleotida. snRNA memproses pre-mRNA (hnRNA) menjadi mRNA dalam nukleus (prosessplicing), serta mengatur / menjaga telomer. Fungsi lain yang dimilikinya ialah membantu regulasi(transcription factor, RNA polymerase II), membentuk snRNP dengan protein, dan ikut serta dalamsplicing (penyambungan)RNA.

12. Heterogonous nuclear RNA (hnRNA)

hnRNA merupakan precursor RNA yang mengandung kodon. hnRNA ini merupakantranskripsi dari DNA genomik. Selain itu, hnRNA yang diproses dengan snRNA juga menghasilkan

mRNA. hnRNA Merupakan transkripsi dari DNA genomik yang terbentuk di nukleus

III. SINTESIS ASAM NUKLEAT

ABSTRAKAsam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting

dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Ada dua macam asamnukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atauribonucleic acid (RNA). Adapun proses sintesis nukleat dibagi menjadi dua macam. Sintesis DNAdisebut juga proses replikasi DNA, sedangkan sintesis RNA disebut juga Transkripsi RNA. Masingmasing proses sintesis tersebut memiliki komponen komponen yang terlibat, dan mekanisme

yang berbeda baik= pada eukariotik maupun prokariotik.Dengan bantuan beberapa jenis enzimproses sintesis asam nukleat pun dapat terlaksana.

REPLIKASI DNA

Komponen Penyusun Replikasi DNA1. Polimerase DNA

DNA Polimerase adalah enzim yang mengkatalisi polimerisasi deoksiribonukleotida deoksiribisanukleotida menjadi utaian DNA. DNA polimerase yang paling terkenal karenaperan mereka dalam replikasi DNA, di mana polimerase "membaca" sebuah untai DNA utuhsebagai template dan menggunakannya untuk mensintesis untai baru. DNA polimerase

menggunakan ion magnesium untuk aktivitas katalitik. DNA Polimerase memiliki strukturyang sangat-kuat. subunit katalitik mereka secara keseluruhan bervariasi.


16/36

15

2. Ligase DNA

Dalam biologi molekuler, ligase DNA adalah tipe khusus dari ligase, yang merupakan enzim(EC 6.5.1.1) dalam perbaikan sel diskontinuitas beruntai tunggal pada molekul DNA beruntaiganda. DNA ligase yang dimurnikan digunakan dalam mengkloning gen untukmenggabungkan molekul DNA bersamasama.Mekanisme ligase DNAdalam bekerja adalah untuk membentuk dua ikatan kovalen

fosfodiester antara 3 'ujung hidroksil dari satu nukleotida, ("akseptor") dengan ujung 5' fosfatlain ("donor"). ATP diperlukan untuk reaksi ligase, yang berlangsung dalam tiga langkah: (1)adenylation (penambahan AMP) dari residu di pusat aktif enzim, pirofosfat dilepaskan, (2)transfer AMP ke 5 'fosfat dari donor yang disebut, pembentukan ikatan pirofosfat, (3)pembentukan ikatan fosfodiester antara 5 'fosfat dari donor dan 3' hidroksil dari akseptor.

3. Primase DNA : enzim yang digunakan untuk memulai polimerisasi DNA pada lagging strand

Primase adalah enzim yang mensintesis urutan RNA pendek yang disebut RNA primer. RNAprimer ini berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Sejak primase menghasilkanmolekul RNA primer , enzim yang bekerjaadalah jenis DNA polimerase.Fungsi dari EnzimPrimase adalah mensintesis urutan RNA pendek yang melengkapi satu bagian untai DNA,yang berfungsi sebagai template-nya. Sangat penting diketahui bahwa RNA primer disintesis

oleh primase sebelum replikasi DNA dapat terjadi. Hal ini karena enzim yang mensintesisDNA, yang disebut DNA polimerase, hanya dapat mempolimerisasi nukleotida DNA baru keuntai nukleotida yang ada. Oleh karena itu, primase berfungsi untuk mengawali danmeletakkan dasar untuk sintesis DNA

4. Helikase DNA : enzim yang berfungsi membuka jalinan DNA double heliks

Helikase DNA adalah enzim yang mengikat dan bahkan dapat merombak asam nukleat atauprotein asam nukleat kompleks . Helikase DNA sangat penting selama replikasi DNA karenamereka memisahkan DNA untai ganda menjadi untai tunggal yang memungkinkan setiaphelai yang akan disalin . Selama replikasi DNA , DNA helikase membuka DNA pada posisiyang akan menjadi awal mula dimana sintesis akan dimulai . Helikase DNA terus membukaDNA membentuk struktur yang disebut garpu replikasi. Proses memecah ikatan hidrogen

antara pasangan basa nukleotida dalam DNA beruntai ganda membutuhkan energi . Untukmelepaskan ikatan , helicases menggunakan energi yang tersimpan dalam molekul yangdisebut ATP , yang berfungsi sebagai peredaran energi sel . Helikase DNA juga berfungsidalam proses seluler lain di mana DNA beruntai ganda harus dipisahkan , termasukperbaikan DNA dan transkripsi

5. Single strand binding protein (SSBs)Single strand binding protein(SSBs) berfungsi untuk mencegah untai DNA heliks ganda yangtelah dibuka oleh enzim helicase menjadi rantai tunggal DNA menyatu kembali. DNA palingstabil secara fisiologis ketika ada dalam kondisi heliks ganda, asalkan untai komplementerDNA yang hadir di lokasi yang sama. Setelah helikase memisahkan enzim double helixmenjadi individu, untai tunggal DNA, maka untaianuntaian tersebut akan cenderung untukmenyatu kembali menjadi heliks ganda kecuali mereka dicegah dari proses penyatuantersebut.

6. Enzim Ribonuclease H (RNase H)Digunakan untuk mendegradasi RNA primer dari jalinan DNA baru yang terbentuk.

Metode Replikasi Dna1. Metode Konservatif

Dalam metode ini dua untai DNA parental kembali seperti semula setelah replikasiberlangsung. Artinya, salah satu material DNA mengandung kedua untai DNA parental, danmaterial DNA lainnya mengandung untai DNA yang rau saja disintesis.

2. Metode SemikonservatifDalam metode ini dua untai DNA parental terpisah dan masing-masing helai kemudian


17/36

16

berfungsi sebagai template untuk sintesis untai DNA baru. Hasilnya adalah dua heliks gandaDNA, yang terdiri dari satu parental dan satu untai baru.

3. Metode DispesifDalam metode ini DNA heliks ganda parental terbuka menjadi segmen segmen DNAberuntai ganda seperti pada model konservativ , segmen segmen tadi berfungsi sebagaitemplate untuk sintesis untai DNA baru. Segmen segmen DNA parental diselingi DNA

keturunan berkumpul dan menyatu membentuk DNA heliks ganda.

Gambar 1.1 Metode dalam Replikasi DNA

Mekanisme Replikasi DNA1. Pemisahan Jalinan DNA

Enzim helicase membuka jalinan DNA doubleheliks. Tempat dimana jalinanan DNAdoubleheliks diubah menjadi rantai tunggal dan replikasi berlangsung disebut garpureplikasi.

Single strand DNA-binding protein atau SSB melapisi jalinan tunggal rantai DNA agar tidakkembali menyatu menjadi rantai ganda.

2. Sintesis Jalinan Baru


18/36

17

Gambar 1.2 Mekanisme Replikasi DNA

Sebelum proses replikasi berlanjut . Giliran kerja enzim polymerase untuk menggandakanrantai tunggal DNA sebagai pelengkap. Namun perlu diketahui bahwa enzim polymerasehanya bekerja untuk memperpanjang nukleotidanukleotida. Tidak bisa memulai dari gugusgula pada suatu nukleotida. Oleh karena itu Enzim primase mensintesis RNA primer agarpolimerisasi DNA dapat dilakukan oleh enzim polymerase.Enzim polymerase mensintesis jalinan baru dari arah 5 menuju 3 pada RNA primer. Ituberarti masing2 enzim pada kedua jalinan bekerja saling berlawanan arah. Pada saat enzimpolymerase mensintesis DNA , enzim SSB secara sendirinya terlepas dari jalinan tunggalDNA.Pada jalinan satu atau disebut juga leading strand, enzim polymerase bekerja secaraberkelanjutan/kontinyu . Pada jalinan lainnya atau disebut juga lagging strand, enzimpolimerase bekerja secara terputus putus dengan cara Enzim primase mensintesis

beberapa RNA primer di jarak yang tersisa pada jalinan DNA tunggal yang belumdipolimerisasi. Jarak Jalinan jalinan DNA yang terpisah oleh RNA primer pada laggingstrand disebut okazaki fragments.

3. Penyatuan FragmenPada untai DNA baru terdapat beberapa RNA primer yang melekat yang harus dihilangkandan jarak antar Jalinan DNA atau okazaki fragment haruslah hilang dan Jalinan DNA yangterputus menjadi menyatu.untuk itu Enzim RNase H berfungsi untuk mendegradasi RNAprimer dari jalinan DNA dan Enzim polimerisasi menggantinya dengan untaian DNA baru.Terakhir jarak pada okzaki fragment disatukan oleh Enzim ligase yang berfungsi sepertiperekat.

Transkripsi

Komponen yang terlibat dalam proses transkripsi1. DNA Template2. Enzim RNA Polimerase3. Promoter4. Terminator

Tahapan proses transkripsi1. Tahapan inisiasi

Sebelum tahap inisiasis RNA polimerase membentuk kompleks dengan rantai ganda DNA,

ikatan hidrogen dilelehkan, dan menciptakan gelembung transkripsi. Tahap inisiasimendeskripsikan pembentukan ikatan nukleotida pertama dalam RNA. Enzim RNA


19/36

18

polimerase tetap berada di daerah promotor sambil mensintesis ~9 nukleotida pertama.Namun demikian, pembentukan nukleotida pendek ini terkadang mengalami keguguran(abortion), yaitu: enzim mensintesis transkrip kurang dari 9 basa, melepaskannya kembali,dan memulai kembali mensintesis RNA baru. Tahapan pengawalan berakhir apabila enzimmampu mensintesis rantai RNA baru melewati batas panjang ini.

2. Tahapan elongasiTahapan elongasi adalah selang selama enzim bergerak sepanjang DNA cetakan dan

memperpanjang rantai RNA. Sambil ia bergerak, ia membuka rantai ganda DNA danmenyingkapkan sandi rantai tunggal DNA dengan nukleotida-nukleotida yang datangmenyerang ujung 3 dari rantai RNA yang sedang mengalami pemanjangan, membentukmolekul hibrida RNA-DNA di daerah yang dibuka gulungannya. Persis dibelakang gulunganDNA yang terbuka ini, rantai tunggal DNA berpasangan kembali membentuk rantai gandadengan pasangan aslinya. RNA kemudian muncul sebagai rantai tunggal yang bebas, yangujung pemanjangannya masih terkait dengan kompleks DNA-RNA-enzim.

3. TerminasiTerminasi melibatkan pengakuan titik dimana tidak ada lagi basa yang ditambahkan kedalam rantai. Untuk mengakhiri transkripsi, pembentukan ikatan fosfodiester harusdihentikan, dan kompleks transkripsi harus dibubarkan. Sewaktu nukleotida terakhirditambahkan akan diikuti oleh runtuhnya gelembung transkripsi, dan dilepaskannya hibridaRNA-DNA. DNA kembali ke keadaan rantai ganda, RNA dan enzim dibebaskan. Urutan basanukleotida dalam DNA yang digunakan agar terjadinya pengakhiran transkripsi disebutterminator.

Mekanisme transkripsi pada prokariot

Inisiasi Transkripsi

Terdapat empat langkah inisiasi pada transkripsi yaitu:

1. Pembentukan kompleks promoter tertutup, yaitu RNA polymerase holoenzim menempelpada DNA bagian promoter suatu gen. Dalam hal ini subunit s yang menempel pada RNAPolimerase berperanan dalam menemukan bagian promoter suatu gen. Pada awalpenempelan, RNA polymerase masih belum terikat secara kuat dan struktur promotermasih dalam keadaan tertutup (closed promoter complex).

2. Pembentukan kompleks promoter terbuka, RNA polymerase terikat secara kuat dan ikatanhydrogen molekul DNA pada bagian promoter mulai terbuka membentuk struktur terbuka(open promoter complex). Struktur khas promoter biasanya berupa suatu kelompok ikatanhydrogen antara kedua untaian DNA pada posisi -35 dan -10. Sedangkan bagian DNAyang terbuka setelah RNA polymerase menempel biasanya terjadi pada daerah sekitar -9dan +3 sehingga menjadi struktur untai tunggal.

3. Penggabungan beberapa nukleotida awal (10 nukleotida). Bagian DNA yang berikatandengan RNA polymerase membentuk suatu struktur gelembung transkripsi (transcriptionbubble)sepanjang kurang lebih 17 pasang basa. Setelah struktur promoter terbuka secarastabil, maka selanjutnya RNA polymerase melakukan proses inisiasi transkripsi denganmenggunakan urutan DNA cetakan sebagai panduannya. Dalam proses transkripsi,nukleotida RNA digabungkan sehingga membentuk transkrip RNA. Nukleotida pertamayang digabungkan hampir selalu berupa molekul purin.

4. Perubahan konformasi RNA polymerase karena subunit s dilepaskan dari kompleksholoenzim. Setelah RNA polymerase menempel pada promoter, subunit s melepaskan diridari struktur holoenzim. Pelepasan subunit s biasanya terjadi setelah terbentuk molekulRNA sepanjang 89 nukleotida. RNA polymerase inti yang sudah menempel padapromoter akan tetap terikat kuat pada DNA sehingga tidak lepas. Selanjutnya subunit s

dapat bergabung dengan RNA polymerase yang lain untuk melakukan proses inisiasitranskripsi selanjutnya.


20/36

19

Elongasi Transkripsi

1. Pada bagian gelembung transkripsi, basa-basa molekul RNA membentuk hybrid denganDNA cetakan sepanjang kurang lebih 12 nukleotida. Hybrid RNA-DNA ini bersifatsementara sebab setelah RNA polimerasenya berjalan, maka hidrid tersebut akan terlepasdan bagian DNA yang terbuka tersebut akhirnya akan menutup lagi. RNA polymerase akanberjalan membaca DNA cetakan untuk melakukan proses pemanjangan untaian RNA. Lalupemanjangan maksimum molekul transkrip RNA berkisar antara 30 sampai 60 nukleotidaperdetik, meskipun laju rata-ratanya dapat lebih rendah dari nilai ini. Secara umum,berdasarkan atas nilai laju semacam ini, sutu gen yang mengkode protein akan disalinmenjadi RBA dalam waktu sekitar satu menit. Meskipun demikian, laju pemanjangantranskrip dapat menjadi sangat rendah jika RNA polymerase melewati sisi jeda yangbiasanya mengandung banyak basa GC.

2. Dalam pemanjangan transkrip, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3

molekul RNA yang baru terbentuk. Nukleotida RNA yang ditambahkan tersebut bersifatkomplementer dengan nukleotida pada untaian DNA cetakan. Ada dua hipotesis yangdiajukan mengenai perubahan topologi DNA dalam proses pemanjangan transkripsi, yaitu:1) Enzim RNA polymerase bergerak melingkari untaian DNA sepanjang perjalanannya,2) Enzim RNA yang terbentuk tidak mengalami pelintiran, tetapi untaian DNA yangditranskripsi harus mengalami puntiran.

3. Dalam proses pemanjangan transkripsi RNA, terjadi pembentukan ikatan fosfodiesterantara nukleotida RNA yang satu dengan nukleotida yang berikutnya dan ditentukan olehkeberadaan subunit b pada RNA polymerase. Transkripsi berakhir ketika RNA polymerasemencapai ujung gen (terminator).

Terminasi Transkripsi

Terdapat dua macam terminator transkripsi pada Prokaryotik, yaitu:

1. Terminator yang tidak tergantung pada protein rho (rho-dependent terminator). Dilakukantanpa harus melibatkan suatu protein khusus, melainkan ditentukan oleh adanya suatuurutan nukleotida tertentu pada bagian terminator. Sinyal yang akan mengakhiri transkripsidengan mekanisme semacam ini ditentukan oleh daerah yang mengandung banyak urutanGC yang dapat membentuk struktur batang dan lengkung (steam and loop) pada RNAdengan panjang 20 basa di sebelah hulu dari ujung 3-OH dan diikuti oleh rangkaian 4-8residu uridin berurutan. Struktur batang lengkung tersebut menyebabkan RNA polymeraseberhenti dan merusak bagian 5 dari hybrid RNA-DNA. Bagian sisa hybrid RNA-DNA

tersebut berupa urutan oligo (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan dA.Akibatnya ujung 3 hybrid tersebut akan terlepas sehingga transkripsi berakhir. Selanjutnya,pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segeramenempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnyaterlepas dari DNA.

2. Terminator yang tergantung pada protein rho (rho-independent terminator). Pengakhirantranskripsi yang memerlukan faktor rho hanya terjadi pada daerah jeda yang terletak padajarak tertentu dari promoter, maka daerah itu tidak dapat berfungsi sebagai daerahpengakhiran transkripsi. Terminator yang bergantung pada rho terdiri atas suatu urutanberulang-balik yang dapat membentuk lengkungan (loop), tetapi tidak ada rangkaian basaT seperti pada daerah terminator yang tidak melibatkan faktor rho. Faktor rho diduga ikutterikat pada transkrip dan mengikuti pergerakan RNA polymerase sampai akhirnya RNA

polymerase berhenti pada daerah terminator yaitu sesaat setelah menyinstesis lengkunganRNA. Selanjutnya, faktor rho menyebabkan distabiliasi ikatan RNA-DNA sehingga transkripRNA terlepas dari DNA cetakan.


21/36

20

Mekanisme transkripsi pada eukariot

Mekanisme transkripsi pada eukariot pada dasarnya menyerupai mekanisme pada prokariot.Namun, begitu banyaknya polipeptida yang berkaitan dengan mesin transkripsi pada eukariotmenjadikan mekanisme tersebut jauh lebih kompleks daripada mekanisme pada prokariot. Secaraumum mekanisme transkripsi dimulai dari inisiasi, elongasi dan terminasi. Tetapi pada eukariotterdapat tiga gen kelas yang berperan dalam proses transkripsi, karena itu transkripsi harusdilakukan pada masing-masing gen kelas tersebut. Proses transkripsi diawali (diinisiasi) oleh prosespenempelan faktor-faktor transkripsi dan kompleks enzim RNA polimerase pd daerah promoter.RNA polimerase eukariot tidak menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter,melainkan melalui perantaraan protein-protein lain, yg disebut faktor transkripsi Pada eukariotproses transkripsi dan translasi tidak terjadi secara bersamaan, karena transkripsi terjadi pada intisedangkan translasi terjadi pada sitoplasma. Jeda waktu anatara transkripsi dan translasi disebutfase pasca-transkripsi.

Pada fase pasca-transkripsi, terjadi proses :

Pemotongan dan penyambungan RNA (RNA-splicing)Pada eukariot banyak terdapat gen yang organisasinya tersusun atas akson dan intron, meskipuntidak semua gen eukariot mempunyai intron. Pada awalnya, gen yang terdiri atas ekson danintron yang ditranskipsi menghasilkan pre-mRNA karena masih mengandung sekuensi intro.Pada tahapan selanjutnya intron akan dipotong dari pre-mRNA dan ekson-ekson yang adaselanjutnya disambung menjadi mRNA yang matang. Proses pemotongan intron danpenyambungan kembali ekson-ekson disebut sebagai proses penyambungan RNA. TranskripsimRNA yang sudah matang inilah yang selanjutnya akan ditranslasi.

Poliadenilasi (penambahan gugus poli-A pada ujung 3mRNA)Poliadenilasi dlakukan pada prekusor mRNA bahkan sebelum terjadi termnasi transkripsi. Haltersebut dlakukan dengan cra memoton prekusor mRNA pada bagian yang nantinya akanmenjadi bagian mRNA yang matang, kemudian dilanjutkan dengan penambhan polia paa ujung

3 yang terbuka. Bagian mRNA yang isentesis setelah poliadenilasi selanjutnya akan didegradasi. Penambahan tudung (cap) pada ujung 5 mRNA

Pada mRNA eukariot mengalami meilasi (penambahan gugus metal) yang sebagian besarterakumulasi pada ujung 5 mRNA. Struktur ini kemudian dikenal sebagai tudung mRNA

Penyuntingan mRNA

Transkripisi pada Virus

Retrovirus bereproduksi secara transkripsi balik. Pada proses transkripsi balik, virusmenggunakan RNA sebagai model cetakan (blue print) untuk membentuk DNA. Selanjutnya, DNAyang terbentuk di gunakan untuk membentuk RNA virus baru. Retrovirus dapat melakukan

transkripsi balik dengan bantuan enzim reversetranscriptase yang dimilikinya.

Proses transkripsi balik RNAmenjadi DNA adalah sebagai berikut :

1. tRNA primer terikat pada Primer Binding Site (PBS) RNA.2. Enzim reverse transcriptase memulai kerjanya dari PBS dengan mengkopiRNA menjadi rantai

tunggal DNA. Pada tahap ini, pengkopian RNA hanyaterjadi dari PBS ke LTR ( Long TerminalRepeat).

3. Setelah terjadi pengkopian RNA, RNase H akan memindahkan fragmenRNA (U5 dan R) yangtelah dikopi sebelumnya.

4. Tahapan tersebut diikuti dengan loncatan pertama, yakni berpindahnya kopi DNA ke ujungrantai 3.

5. Rantai DNA mulai dikopi kembali dengan diawali dari ujung rantai 3.6. RNase H memindahkan RNA yang telah dikopi dan hanya menyisakan satufragmen RNA yangutuh, yang dinamakan bidang polypurine.


22/36

21

7. Reverse transcriptase mulai menyusun rantai kedua DNA. Tahapan inidimulai dari bidangpolypurine. Pembuatan rantai kedua DNA merupakanpembuatan rantai sebagai pasangan koderantai pertama.

8. Sekarang, RNAse H memindahkan semua RNA, bidang polypurine dantRNA primer.9. Loncatan kedua terjadi, PBS yang terletak pada rantai kedua terikat padaPBS di rantai pertama.10. Enzim Reverse Transcriptase telah menyelesaikan tugasnya denganmenuntaskan pengkopian

rantai kedua DNA sekaligus menyelesaikanpembentukan LTR pada tiap-tiap ujung rantai

IV. DETEKSI ASAM NUKLEAT

AbstrakDeteksi asam nukleat diperlukan untuk mengetahui keberadaan asam nukleat pada suatu zat. Asam

nukleat erat kaitannya dengan DNA (Deoksiribosa nukleid acid) dan RNA (Ribosa nukleid acid).Oleh karena itu deteksi asam nukleat sama halnya dengan deteksi DNA atau RNA. Deteksi asamnukleat dapat dibagi menjadi dua jenis, yakni secara kualitatif dan kuantitatif. Deteksi secarakualitatif diantaranya adalah metode elektroforesis, hibridisasi, sequencing, analisis teknik PCR,staining, blottingdan labelling. Terdapat pula analisis UV-vis Spectrophotometry yang mencakupdeteksi secara kuantitatif maupun kualitatif. Semua metode tersebut memiliki cara dalam mendeteksiasam nukeat dengan ciri khasnya masing-masing.

ElektroforesisElektroforesis adalah teknik pemisahan yang paling popular dang dianggap sebagai gerbang dariilmu biologi molekuler. Elektroforesis memiliki prinsip tentang pemisahan campuran molekulberdasarkan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada masa diam(stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Khusus untuk DNA, pemisahantidak didasarkan atas perbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi ataustruktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosadigunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebihkecil. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melaluimatriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah lajumigrasinya. Jika hubungan antara ukuran molekul dan laju migrasi 102 dipetakan dalam suatu grafiklogaritmik, maka akan diperoleh kurva linier. Oleh karena itu, kita dapat memperkirakan beratmolekul suatu fragmen DNA dengan melihat atau membandingkan laju migrasinya dengan lajumigrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya.

Fragmen-fragmen DNA divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet setelah terlebih dulu direndam didalam larutan etidium bromid, pewarna yang akan menyisip atau melakukan interkalasi di sela-selabasa DNA. Perendaman dilakukan setelah migrasi dianggap cukup untuk dihentikan. Fragmen DNAakan nampak sebagai pita berwarna merah dengan posisi migrasi yang sesuai dengan beratmolekulnya. Cara ini dapat memvisualisasikan fragmen DNA hingga sekecil 0,05 g. Seperti telahdikatakan di atas bahwa selain karena perbedaan ukurannya, laju migrasi DNA pada gelelektroforesis juga ditentukan oleh konformasi molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closedcircular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusul berikutnya konformasi open circular (OC), danyang terakhir linier. Oleh karena perbedaan konformasi menyebabkan perbedaan laju migrasi, makapenentuan ukuran suatu fragmen DNA selalu dilakukan pada konformasi linier. Elektroforesistermasuk pada analisis kualitatif.Sequencing asam nukleat

Sequencing asam nukleat adalah penentuan urutan basa nukleotida dalam fragmen DNA atau RNA.Sequencing asam nukleat telah menjadi alat yang sangat diperlukan untuk penelitian biologi dasardan untuk berbagai bidang terapan, seperti diagnostik molekuler, rekayasa genetika, forensik,


23/36

22

pharmacogenomics dan sistem biologi. Secara tradisional, analisis urutan DNA telah dicapai denganmenggunakan dua teknik yang berbeda: metode terminasi rantai ddNTP-dimediasi Sanger et al.(1977) dan metode degradasi kimia Maxam dan Gilbert (1977). Meskipun kemajuan terbaru dalamgenerasi teknologi sequencing DNA, metode sekuensing tradisional masih rutin digunakan dibanyak laboratorium ilmu kehidupan. Untuk mendapatkan hasil yang optimal dengan tekniksekuensing konvensional, diperlukan pemilihan reagen yang cermat. Sequencing DNA dapatdigunakan pada banyak bidang lainnya seperti sub-tipe dari bakteri dan virus dengan mengurutkan

daerah variabel dari genom yang mereka miliki. Sequencing juga dapat memfasilitasi indentifikasidari hal yang telah teridentifikasi sebelumnya, atau pathogen yang tidak diketahui dan karenanyahal ini dapat digunakan pada ilmu epidemologi molekular, investigasi pathogen, dan lain-lain.Sanger sequence Metode Sanger, yang juga disebut sebagai sequencing dideoksi atau terminasirantai, didasarkan pada penggunaan dideoksinukleotida (ddNTP) di samping normal (NTP) yangditemukan dalam DNA. Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan nukleotida kecuali merekamengandung gugus hidrogen pada 3 'karbon bukan gugus hidroksil (OH). Nukleotida yangtermodifikasi, ketika diintegrasikan ke dalam urutan, mencegah penambahan nukleotida lebih lanjut.Ini terjadi karena ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk antara dideoksinukleotida dan nukleotida

masuk berikutnya sehingga rantai DNA diakhiri.Metode sanger diawali dengan menguatkanwilayah DNA yang akan diurutkan dalam beberapacara dan kemudian didenaturasi untukmemproduksi DNA beruntai tunggal. Sebuah primersequencing teranneal menjadi DNA beruntaitunggal. Pemutusan rantai dideoksinukleotidasekuensing DNA kemudian mengambil keuntungandari fakta bahwa rantai berkembang nukleotida,yang memperluas dalam 5 ' ke arah 3', akanberakhir jika, selain Deoksinukleotida konvensional,dideoksinukleotida 2'3' menjadi dimasukkan.Dengan melakukan empat reaksi terpisah, masing-masing berisi polimerase DNA dan sejumlah kecil

salah satu dari empat dideoksi selain keempatdeoksinukleotida, empat set terpisah fragmen rantaidihentikan dapat diproduksi. Mengikuti langkah replikasi/terminasi, fragmen rantai yang dihentikanini akan tetap terikat pada molekul DNA beruntai tunggal yang telah bertindak sebagai template.Dengan memanaskan molekul-molekul ini sebagian double stranded dan menambahkan agendenaturing seperti formamida, molekul pemutusan rantai beruntai tunggal dapat dilepaskan daritemplate mereka dan dipisahkan menggunakan resolusi tinggi denaturasi gel elektroforesis. Urutanwilayah asli dari DNA kemudian akhirnya disimpulkan dengan melihat posisi relatif dari rantai produkterminasi dideoksinukleotida dalam empat jalur dari gel denaturisasi. Metode Sanger ini termasukmetode secara kualitatif untuk menganalisis asam nukleat.Label l ingasam nukleatAsam nukleat dapat dimodifikasi dengan tanda yang memungkinkan deteksi atau pemurnian. Hasil

dari probe asam nukleat dapat digunakan untuk mengidentifikasi atau menemukan interaksi molekuldengan molekul lainnya. Jenis labeling yang umum digunakan untuk menghasilkan probe asamnukleat diantaranya fosfat radioaktif, biotin, f luorophores, dan enzim. Selain itu, metode biokonjugasidapat digunakan untuk menghasilkan probe asam nukleat dapat disesuaikan untuk memasangasam nukleat dengan molekul lain atau ke permukaan untuk memfasilitasi pengiriman ditargetkanatau imobilisasi.Metode enzimatik dalam labeling asam nukleat- TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)sering digunakan untuk melabel probe DNA untuk RACE (Rapid Amplifikasi cDNA Ends), TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling) tes dan sebagai metode untukmenambahkan ujung 3' untuk fragmen DNA untuk memfasilitasi kloning. TdT juga dapat digunakanuntuk label ujung 3' dari probe DNA dengan tag radioaktif dan nonradioaktif untuk berbagai aplikasideteksi dan afinitas. Misalnya, penambahan TdT biotin-11-UTP ke ujung 3' dari probe DNA

komplementer adalah cara yang efektif untuk menciptakan probe untuk digunakan dalam tespergeseran electromobility (EMSA) nonradioaktif dan tes DNA pull-down.


24/36

23

T4 RNA ligase adalah enzim dikodekan dalam genombakteriofag T4. T4 RNA ligase mengkatalisis lampiran dariterminal 5'-fosfat untuk kelompok 3'-hidroksil terminal padaRNA. T4 ligase RNA adalah template independen tetapimembutuhkan RNA beruntai tunggal dan ATP. Meskipunsubstrat utama untuk T4 ligase RNA adalah RNA, kondisireaksi dapat dioptimalkan untuk molekul DNA beruntai

tunggal, meskipun efisiensi sangat rendah. T4 ligase RNAdigunakan untuk pelabelan 'akhir RNA dengan [5' 3 P]PCP (cytidine-3 ', 5'-bis-fosfat), memodifikasi mRNA untukcDNA generasi perpustakaan dan melakukan 5'-RACE. T4ligase RNA juga dapat digunakan untuk 3 'akhir-label RNAdengan tag nonradioactive menggunakan nucleoside tepatdimodifikasi 3', 5'-bifosfat.T4 polinukleotida Kinase(T4 PNK) adalah enzim dikodekan dalam genom bakteriofag T4. T4 PNKtransfer fosfat organik dari posisi gamma pada ATP ke gugus 5'-hidroksil dari DNA dan RNA. Thewild type enzim juga memiliki aktivitas 3'-fosfatase. T4 ligase PNK adalah template independen danmemodifikasi polynucleotides beruntai tunggal dan 5 overhang 'efisien. Tumpul-berakhir dan 5'tersembunyi ujung dapat dimodifikasi dengan efisiensi berkurang. T4 PNK digunakan terutamauntuk label ujung 5 'dari polynucleotides dengan fosfat radioaktif dari isotop diubah-ATP. PNK lebihefisien dalam memodifikasi overhang pendek dan fragmen tumpul-end dari TdT atau T4 ligase RNA.Meskipun dimungkinkan untuk melakukan reaksi fosfat-exchange, PNK pelabelan yang palingefisien ketika ujung 5 'molekul target telah dephosphorylated. Lain penggunaan umum dari PNKadalah 'fosforilasi polynucleotides sintetis (yaitu, primer DNA) 5 untuk memfasilitasi kloning.DNA polimeraseadalah keluarga enzim yang menciptakan polimer asam deoksiribonukleat denganmenjadi katalis bagi bergabungnya akhir 5'- terfosforilasi dari deoxyribonucleotide (monomer) keujung 3 - hidroksil dari untai DNA yang ada (DNA elongasi) atau primer (extension primer). DNApolymerase tergantung pada template tapi tidak bergantung pada urutan. Untuk mensintesis DNA,akhir 3-OH dari untai DNA yang ada harus anil ke untai komplementer DNA. Enzim viral reversetranscriptase merupakan pengecualian untuk aturan ini dan menggunakan DNA atau RNA primer

dan template RNA untuk sintesis DNA komplementer. DNA polimerase akan mensintesis untai DNAbaru melalui perpanjangan yang ada di ujung 3'-OH, menambahkan nukleotida individu melengkapiuntai cetakan sedang dibaca. DNA polimerase digunakan untuk berbagai keperluan lab dari kloninguntuk sequencing. Aplikasi yang memerlukan amplifikasi fragmen DNA spesifik yang dilakukandengan bantuan enzim panas stabil kloning dari organisme termofilik (misalnya, Thermus aquaticus(Taq), Bacillus stearothermophilus (Bst), Thermococcus litoralis (Vent)) dengan menggunakanpolymerase chain reaction (PCR). Untuk aplikasi di mana amplifikasi tidak diperlukan, polimeraseDNA dari organisme mesofilik ( misalnya E. coli(Klenow) dan bakteriofag (T4, T7)) dapat digunakantergantung pada panjang DNA yang akan disintesis dan tingkat replikasi kesetiaan yang diperlukan.Probe yang dihasilkan dengan bantuan polimerase DNA yang paling sering dibuat olehpenggabungan acak nukleotida diubah selama proses replikasi DNA, yang dapat dilakukan denganPCR atau reaksi ekstensi primer sederhana. Probe yang dihasilkan dengan cara ini memiliki aktivitas

spesifik yang tinggi dan memungkinkan deteksi jumlah kecil target. Secara tradisional, metode inidiperlukan nukleotida radioaktif untuk menghasilkan probe, namun, biotin, fluorophores dan tagnonradioactive lainnya dapat digunakan jika modifikasi tidak mengganggu dengan elongasi reaksipolimerase (kecuali untuk aplikasi sequencing terminator). Untuk aplikasi yang memerlukan aktivitasspesifik yang lebih rendah atau ketika pelabelan ditargetkan diinginkan, polimerase DNA dapatdigunakan untuk label khusus ujung probe DNA. Untuk label 5'-akhir probe DNA, primer 5' ujungyang telah dimodifikasi harus digunakan. Metode ini sangat berguna ketika menambahkan tagafinitas atau fluorophores untuk probe DNA yang terlalu panjang untuk sintesis otomatis efisien.Metode ini sangat ideal untuk 5' ujung label dengan PCR atau reaksi ekstensi primer sederhana.Untuk label probe DNA di atau dekat polimerase 3' ujung, DNA dapat digunakan untukmenggabungkan satu atau lebih nukleotida yang termodifikasi ke ujung probe beruntai gandadengan 3' ujung tersembunyi. Reaksi "fill" ini dapat dilakukan dengan primer anil yang tidak stabil,

fragmen restriksi atau molekul DNA beruntai ganda lain di mana urutan DNA komplementer dapatanil dan digunakan sebagai template untuk perpanjangan 3' ujung. Klenow fragment (E. coli DNA

Gambar. 2 T4 RNA ligase


25/36

24

polimerase I) umumnya digunakan untuk reaksi mengisi-dalam dan bahkan dapat digunakan untuk3' akhir-label molekul RNA ketika hibridisasi ke primer DNA menghasilkan ujung 3 ' tersembunyi .RNA polymerase adalah keluarga enzim yang menciptakan polimer asam ribonukleat denganmenjadi katalis bagi bergabungnya dari ujung 5' terfosforilasi ribonucleotide (monomer) ke ujung 3'-hidroksil dari ribonucleotide dimasukkan sebelumnya. Polimerase RNA adalah tergantung padatemplate dan tergantung urutan, membutuhkan urutan promotor dalam template DNA dalam rangkauntuk memulai pengikatan enzim dan, tergantung pada sistem host, berbagai kofaktor yang

diperlukan untuk transkripsi RNA untuk melanjutkan pada template beruntai tunggal. RNApolimerase digunakan untuk berbagai keperluan lab dari sintesis in vitro dari mRNA ke generasiprobe untuk hibridisasi dan tes mengikat. Probe yang dihasilkan dengan bantuan RNA polimeraseyang dibuat oleh penggabungan acak nukleotida diubah selama proses transkripsi. Hal ini biasanyadilakukan dengan kloning cDNA atau urutan template lainnya menjadi plasmid yang mengandungsatu atau lebih urutan RNA polimerase promotor. Probe RNA yang dihasilkan dengan cara inimemiliki aktivitas spesifik yang tinggi dan yang paling sering dibuat dengan nukleotida radioaktif,meskipun biotin dan tag lainnya juga tersedia.Metode kimiawi dalam labeling asam nukleat- Oksidasi Periodat RNA. Meta- dan orto- periodat(IO4 dan IO6, masing-masing) adalah anion terbentuk dari yodium dan ok sigen dan umumnyaditemukan sebagai garam dengan kalium (misalnya KIO4) atau natrium (misalnya NaIO4). Dalamlarutan, periodat memotong ikatan antara atom karbon yangberdekatan yang memiliki gugus hidroksil (diol berdamping atau cis-glikol), menciptakan dua kelompok aldehida. Kelompok aldehida yangdihasilkan secara spontan reaktif terhadap amina yang mengandungmolekul primer dan permukaan. Aldehida dapat digunakan dalam duajenis reaksi kopling dengan baik tag amina atau primer hydrazide-diaktifkan. Amina primer bereaksi dengan aldehida untuk membentukSchiff basa, yang mudah menghidrolisis dan harus distabilkan melaluipengurangan mereka untuk obligasi menjadi amina sekunder dengannatrium cyanoborohydride (NaBH4). Molekul hydrazide-dimodifikasijuga spontan bereaksi dengan aldehida, tetapi membentuk hubunganhydrazone cukup stabil, membuat reaksi jauh lebih efisien.

Penambahan natrium cyanoborohydride akan meningkatkan efisiensi reaksi lebih lanjut danmeningkatkan stabilitas obligasi dari waktu ke waktu dan perubahan pH. Karena sifat oksidatif ringannya, natrium meta-periodat sering digunakan sebagai oksidator karbohidrat protein untukmenghasilkan kelompok aldehida reaktif baik untuk deteksi atau prosedur konjugasi kimia. The diolberdamping ribosa nukleotida dalam RNA juga dapat dibelah dengan periodat-memungkinkanmetode ini digunakan untuk menambahkan label ujung 3' tunggal untuk RNA tetapi tidak DNA.Ribosa nukleotida dalam RNA dapat dibelah dengan penambahan periodat-memungkinkan labelpada ujung 3' tunggal.Aktivasi EDC dari 5' fosfatKarbodiimida adalah kelompok fungsional (RN=C=NR) yang biasanya

digunakan dalam sintesis organik untuk mengaktifkanpembentukan amida atau phosphoramidate hubungan antaraamina primer (RNH2) dan karboksilat (RCOOR' - atau molekul yang

mengandung fosfat (R-PO4), masing-masing. Tidak sepertikebanyakan crosslinkers , karbodiimida tidak menjadi bagian daricrosslink final antara molekul dan dengan demikian tidakmenambahkan struktur kimia tambahan untuk produk yangdihasilkan. EDC (EDAC, 1-Etil-3- [3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hidroklorida) adalah karbodiimida yang larut dalam airlebih disukai untuk digunakan da lam reaksi berair dalam kisaranpH kisaran pH 4,0-6,0, di mana reaksi - produk dapat dengan

mudah dihilangkan dengan dialisis atau pengendapan produk konjugasi. Dalam reaksi dengangugus asam karboksilat, EDC membentuk O-acylisourea aktif menengah yang mudah tergeser olehserangan nukleofilik dari kelompok amino utama dalam campuran reaksi. Reaksi yang sama dapatdilakukan dengan fosfat (yaitu, 5' fosfat dari oligonukleotida) meskipun imidazol harus disertakan

dalam reaksi untuk mendapatkan konjugasi efisien. Karena 5' fosfat diperlukan, oligonukleotidasintetis pertama harus diobati dengan kinase. Dengan pengecualian kecil, konjugasi EDC-

Gambar. 3 Oksidasi Periodat RNA


26/36

25

termediasi merupakan sarana ekonomis untuk kopling baik RNA dan DNA untuk hampir semuautama amina yang mengandung molekul atau permukaan lainnya.Chemical random -label ing Pelabelan acak kimiawi asam nukleat dapat dicapai dengan berbagaicara. Karena metode ini label di situs acak sepanjang DNA atau molekul RNA, merekamemungkinkan tingkat yang lebih tinggi dari label yang akan dicapai daripada teknik-end label.Namun, satu kelemahan dari metode ini adalah bahwa basa nukleotida secara langsungdimodifikasi, yang akan mengurangi atau mencegah dasar-pasangan antara untai komplementer

selama percobaan hibridisasi. Oleh karena itu, mungkin perlu untuk menyeimbangkan tingkatpelabelan dengan efisiensi hibridisasi probe dalam percobaan tertentu.Yang paling populer strategiacak-label kimia melibatkan penggunaan reagen pelabelan fotoreaktif atau Universal LinkageSystem (ULS, KREATECH Bioteknologi BV). Dua jenis label reagen photoreactiv digunakan untukasam nukleat: phenylazide- dan berbasis psoralen. Ketika gugus fungsional phenylazide terkenasinar UV, membentuk nitrene labil yang dapat memasukkan nonspesifik menjadi ikatan ganda dansitus CH dan NH melalui reaksi. Selain itu, asalkan nukleofilik lebih reaktif (misalnya, amina primer)tidak hadir. Molekul yang mengandung gugus fungsional psoralen dapat digunakan untuk label DNAuntai ganda atau RNA. Struktur cincin psoralen efektif intercalates ke bagian beruntai ganda, danpaparan sinar UV menyebabkan produk cyclo-selain dibentuk dengan ikatan 5,6 - ganda dalamresidu timin. The ULS label reagen mengandung suhu- aktif berbasis platinum bagian proprietaryyang bereaksi dengan basa guanin dalam RNA dan DNA dan rantai samping metionin, sistein danhistidin residu protein.Stainingasam nukleatAda beberapa staining(pewarnaan) yang berbeda yang dapat digunakan untuk memvisualisasikandan foto DNA setelah pemisahan dengan elektroforesis gel. Daftar berikut menjelaskan beberapapilihan pewarnaan, dan perbedaan antara mereka.Ethidium Bromide Etidium bromida kemungkinan pewarna yang paling terkenal digunakan untukmemvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam campuran gel, dalam bufferelektroforesis atau pewarna gel setelah dijalankan. Molekul pewarna mematuhi untai DNA danberpendar di bawah sinar UV, menunjukkan di mana pita berada dalam gel. Etidium bromidamerupakan karsinogen potensial, sehingga harus ditangani dengan hati-hati. Karena risikokesehatan potensial dari bekerja dengan gel ini, alternatif telah ditemukan.

SYBR EmasSYBR Emas pewarna dapat digunakan untuk pewarna ganda atau untai tunggal DNA,atau RNA. Itu adalah salah satu alternatif pertama yang etidium bromida untuk memukul pasar dandianggap lebih sensitif dibandingkan etidium bromida. Pewarna pameran 1000 kali lipat fluoresensiUV lebih besar setelah terikat dengan asam nukleat. Menembus tebal dan tinggi % agarose gel dandapat digunakan dalam formalin gel. Karena fluoresensi molekul terikat begitu comparitively rendah,destaining tidak diperlukan. Lisensi pemegang Probe Molekuler memiliki juga, sejak saat itu,dipasarkan SYBR Aman dan SYBR Hijau sebagai alternatif yang lebih aman untuk etidium bromida.SYBR HijauPewarna SYBR Hijau I dan II, oleh Probe Molekuler, dioptimalkan untuk tujuan yangberbeda. Karena mereka mengikat DNA, mereka masih dianggap mutagen potensial dan harusditangani dengan hati-hati. SYBR Hijau I lebih sensitif untuk digunakan dengan DNA untai ganda,sedangkan SYBR Hijau II yang terbaik untuk digunakan dengan DNA beruntai tunggal atau RNA.Seperti etidium bromida, ini sangat sensitif pewarna berpendar di bawah sinar UV.

SYBR SafeSYBR Safedirancang untuk menjadi alternatif yang lebih aman untuk etidium bromidadan pewarna SYBR lainnya. Hal ini tidak dianggap sebagai limbah berbahaya dan umumnya dapatdibuang melalui sistem saluran pembuangan biasa (yaitu sia-sia), karena pengujian toksisitasmenunjukkan tidak ada toksisitas akut dan sedikit atau tidak ada genotoxicity di sela Suriah HamsterEmbrio (SHE), limfosit manusia, limfoma tikus sel dan dalam uji AMES. Noda dapat digunakandengan transillluminator cahaya biru yang menyebabkan lebih sedikit kerusakan DNA yangdivisualisasikan dan efisiensi yang lebih baik untuk kloning.Eva GreenEva Greenadalah pewarna fluorescent hijau yang telah ditemukan untuk menghambatPCR untuk sebagian lessor dari pewarna lainnya, sehingga sangat berguna untuk aplikasi sepertikuantitatif real-time PCR. Ini juga merupakan pilihan yang baik ketika menggunakan titik lebur gelrendah untuk menemukan DNA. Hal ini sangat stabil pada suhu tinggi dan memiliki fluoresensisangat rendah sendiri, tetapi sangat fluorescent ketika terikat ke DNA. Eva Greenjuga telah terbukti

memiliki sangat rendah atau tidak ada sitotoksisitas atau mutagenisitas.Blot t ing


27/36

26

Blotting asam nukleat adalah teknik yang baik untuk mencari gen atau urutan dari campurankompleks dari DNA atau RNA. Blotting adalah proses dari berpindahnya biomolekul yang terpisahsecara elektroforesis (contoh: asam nukleat datau protein) dari gel (agarose atau polyacrylamide)ke dalam substrat membran. Membran adalah substrat yang sangat ideal untuk mengikat danmeretensi biomolekul karena permukaan dalamnya yang sangat luas dan terbuat dari polimer yangsangat adsorptive. Sebagaimana perbandingannya dengan matriks gel dari biomolekul yangditransfer, membrane lebih mudah untuk digunakan dan dapat dimanipulasi dengan efektif di metode

deteksi berikutnya. Biomolekul dapat ditransfer dari gel ke membrane menggunakan tekanankapilaritas, vakum, atau medan magnet. Koloni (bakteri) atau plak (virus) tumbuh di agar plates dandapat ditransfer dengan meletakkan membran pada plate. Meskipun teknik dasar darimempersiapkan dan menganalisis blot sudah berjalan lebih dari dua dekade, penemuan terbarumenunjukkan bahwa teknik Blotting telah membuka jalan pemanfaatan yang lebih luas untukmembran Blotting dalam analisis asam nukleat. Blotting terdiri dari berbagai macam jenis,diantaranya Southern blotting, North blotting, West blotting, dan Eastern blotting. Namun, Easterndan Western blotting tidak berlaku untuk deteksi asam nukleat karena teknik ini digunakan danberkenaan dengan protein.Southern BlottingSouthern blot adalah suatu teknik yang dikembangkan oleh Edwin. M. Southernpada 1975, seorang ahli biologi asal Inggris.Teknik ini digunakan untuk pendeteksiansuatu DNA sequence spesifik (gen atau lain)dalam sample kompleks DNA (selular DNA).Teknik ini juga digunakan untuk menentukanbobot molekular suatu restriksi fragmen danuntuk mengukur sejumlah relatif dalamsample berbeda. Di bawah kondisi-kondisioptimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pgDNA yang menarik. Blot teknik digunakanuntuk memindahkan protein DNA dan RNA kesuatu pengangkut sehingga dapatdipisahkan, dan sering juga diikuti

penggunaan suatu gel ectrophoresis.Southern blot digunakan untuk memindahkanDNA. Digunakan biologi molekular untukmelihat kemungkinan kehadiran suatu urutanDNA dalam suatu sample DNA. Southern blotberkombinasi gel agarose electrophoresisuntuk separasi ukuran DNA dengan metodauntuk memindahkan DNA ke suatu membranfilter untuk pemeriksaan hybridisasi. Metodalain adalah Western blot dan Northern blotmemiliki prinsip kerja yang sama tetapimenggunakan RNA dan protein.

Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali yang menyebabkan DNAterdenaturasi dan terpisah menjadi rantai tunggal. Suatu membran seperti selaput ditempatkan padagel dan diberi tekanan melalui pengisapan atau metoda mundane dalam kertas handuk (papertowels) dengan suatu berat. DNA berpindah tempat ke membran dan stick. Membran DNA-impregnanted dibakar atau menyebar secara permanen dengan menyertakan DNA tersebut.Molekul yang kemudian diperlakukan dengan suatu pemeriksaan hybridisasi yang mana hanyasuatu molekul DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan DNA yang telahditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents atau chromogenic berpijarsehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari hybridisasi dengan sinar X atauAutoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNA sequence spesifik atau gen.Southern blots digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan, evolusi, dan studi pengembangan,forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot

digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen.Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman. Analisis Southern blot bermanfaat

Gambar. 5 Southern Blotting


28/36

27

untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah copydan untuk mendeteksi gross DNA penyusunan kembali yang mungkin tel

makalah asam nukleat hg 1

Documents