PETUNJUK PRAKTIKUM

KIMIA PRODUK ALAM

Oleh :

Dr.rer.nat. Nanang Fakhrudin, M.Si., Apt.Dr. Erna Prawita Setyowati, M.Si, Apt.Dr.rer.nat. Triana Hertiani, M.Si, Apt.Andayana Puspitasari, M.Si, Apt.Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si, Apt.Dra. Sri Mulyani, S.U., Apt.Purwanto, M.Sc., Apt.Prof. Dr. Wahyono, Apt.Prof. Dr. Suwijiyo Pramono, Apt.Prof. Dr. Sudarsono, Apt.Prof. Dr. Subagus Wahyuono, Apt.

2013

1

TATA TERTIB PRAKTIKUMNAMA PRAKTIKUM

Sebelum melakukan praktikum, praktikan harus mempersiapkan diri untukmemahami tentang praktikum yang akan dikerjakan dengan membuat persiapansecara tertulis dalam buku laporan sementaraSepuluh menit sebelum waktu praktikum dimulai, mahasiswa sudah berada ditempatpraktikum, mengenakan jas praktikum dan kartu nama.Pada dasarnya tidak diadakan praktikum perorangan (praktikum susulan) danpraktikan yang tidak dapat mengikuti praktikum harus ada surat keterangan dokterdan/ atau surat keterangan dari orang tua/wali.Peserta praktikum dilarang menggunakan kaos oblong, sandal, celana robek danmenggunakan perhiasan yang berlebihan.Praktikan yang merusakkan, memecahkan atau menghilangkan peralatan praktikumharus melapor kepada pembimbing praktikum atau laboran. Praktikan harusmembereskan penggantian alat tersebut secepat mungkin.Selama praktikan menjalankan praktikum tidak diperbolehkan melakukan perbuatanyang mengganggu praktikan lain (termasuk menggunakan Hp).Praktikan tidak diperkenankan meninggalkan laboratorium tanpa seizin pembimbingpraktikum atau asistennya.Praktikan diwajibkan membawa peralatan praktikum yang lain yang tidak disediakanoleh laboratorium, misal lap atau tisu, gunting kecil dan alat tulis.Praktikan yang merusakkan, memecahkan atau menghilangkan peralatan praktikumharus melapor kepada pembimbing praktikum atau laboran. Praktikan harusmembereskan penggantian alat tersebut secepat mungkin.Peserta praktikum wajib menjaga kebersihan dan ketertiban ruangan praktikumselama praktikum berlangsungSesudah praktikum praktikan harus membersihkan atau mencuci peralatan yangdigunakan.Peserta praktikum diwajibkan mengikuti semua kegiatan praktikum.

Demikian tata tertib ini dibuat untuk diindahkan dan ditaati demi kelancaran praktikum yangdijalankan dan segala sesuatu yang belum tercantum dalam tata tertib ini akan di umumkan padasaat praktikum.

Yogyakarta, 18 Februari 2013

Laboratorium Kimia Produk Alam

2

UNIT I

IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDERDENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

A. TUJUAN PRAKTIKUMSetelah melakukan praktikum, mahasiswa diharapkan mampu memisahkansenyawa-senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak tumbuhan yang dianalisis sertamampu mengidentifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dengan teknik KLT.

Mahasiswa juga diharapkan mampu memahami prinsip pemisahan dan identifikasigolongan senyawa matabolit sekunder dengan metode KLT.

B. PENDAHULUANKLT merupakan teknik yang sangat penting untuk pemisahan dan identifikasi

campuran senyawa-senyawa organik. Selain digunakan untuk memisahkan danmengidentifikasi senyawa organik, KLT juga bisa digunakan untuk memantau reaksikimia, menganalisis komposisi kimiawi, dan untuk menganalisis kemurnian suatusenyawa. Selain itu, KLT juga bisa digunakan untuk analisis kuantitatif dengan

digabungkan dengan analisis secara densitometri. Mekanisme pemisahan pada KLTmelibatkan interaksi partisi dan adsorbsi atau gabungan keduanya, tergantung dari fasediam (misalnya silika gel/SiO2) dan fase gerak yang digunakan. Pada KLT, fase diamnyamerupakan serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik atau logam secara

merata. Sedangkan fase geraknya berupa pelarut organik baik itu tunggal, maupunkombinasi. Teknik KLT menawarkan flesibilitas pemilihan fase gerak yang bervariasiuntuk memisahkan berbagai macam senyawa kimia.Sampel yang akan dianalisis dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (harus larut)

kemudian ditotolkan berbentuk titik atau pita pada fase diam. Totolan ini dieluasi denganfase gerak (tunggal atau campuran) dalam suatu chamber tertutup dan fase gerak akanbergerak keatas pada fase diam mengikuti gaya kapiler hingga batas eluasi yangditetapkan (biasanya 0,5-1 cm dari ujung plat KLT). Seiring dengan pergerakan fase

gerak, komponen-komponen dalam sampel yang dianalisis juga bergerak dengankecepatan yang berbeda tergantung pada interaksinya dengan fase gerak dan fase diam.Hal ini mengakibatkan terjadinya pemisahan senyawa dalam sampel yang dianalisis.Ketika fase gerak mencapai batas akhir dari eluasi (biasanya 0,5-1 cm dari ujung plat

KLT), plat KLT kemudian diambil dari dalam chamber dan fase geraknya diuapkan.Dalam KLT, perbandingan jarak rambat bercak senyawa tertentu terhadap jarak rambatfase gerak diukur dari titik penotolan dinyatakan sebagai harga Rf. Pemisahan senyawadiamati dengan menghitung dan membandingkan harga Rf (retention factor) dari bercak-bercak yang diperoleh dengan dibandingkan dengan senyawa pembanding (jika ada). Jika

sampel yang dianalisis diduga mengandung senyawa pembanding yang digunakan, makaharus ada bercak senyawa yang memiliki harga Rf yang sama dengan senyawapembanding. Harga Rf bukan merupakan konstanta fisik karena harganya berubah sesuai

3

dengan kondisi percobaan. Oleh karena itu, senyawa pembanding dan sampel yangdianalisis ditotolkan pada lempeng yang sama dan dilakukan setiap kali untuk setiappercobaan. Jarak rambat suatu senyawa yang dianalisis juga sering dibandingkan dengan

jarak rambat senyawa pembanding, dan harganya dinyatakan sebagai harga Rx.Senyawa-senyawa hasil pemisahan divisualisasikan dengan detektor yang sesuai(UV, sinar tampak, pereaksi kimia). Biasanya bercak-bercak senyawa hasil pemisahanperlu untuk divisualisasikan karena sebagian besar senyawa organik tidak berwarna.

Beberapa senyawa mengabsorbsi sinar UV atau berfluoresensi ketika terpapar sinar UV,namun sebagian besar memerlukan visualisasi dengan reagen penampak bercak. Dengancara diatas, senyawa-senyawa penyusun dari sampel yang dianalisis (misalnya ekstraktumbuhan) bisa dipisahkan dan dianalisis secara kualitatif. Untuk keperluan analisis

kuantitatif, bercak-bercak hasil pemisahan pada lempeng KLT bisa dianalisis dengandensitometri pada panjang gelombang tertentu. Identifikasi dengan teknik KLT padakondisi tertentu memberikan petunjuk identitas yang jelas, namun tetap diperlukankonfirmasi dengan metode lain untuk identifikasi yang lebih valid.

Beberapa alat yang biasa digunakan dalam KLT antara lain :1. Lempeng KLTLempeng pada KLT mempunyai ketebalan serba rata dan ukuran yang sesuai(umumnya 20 x 20 cm. Namun dalam praktikum ini akan digunakan lempeng yang

sudah dipotong kecil. Jika tidak dinyatakan lain, lempeng lapis tipis yang digunakandalam Farmakope Herbal Indonesia adalah lempeng silika atau selulosa pralapis(lempeng siap pakai).2. Rak penyimpanan

Rak penyimpanan digunakan untuk mebawa lempeng atau mengeringkan lempengsetelah dilakukan eluasi.3. Zat penjerabTerdiri dari bahan penjerap yang halus umumnya berukuran diameter 5-40

mikrometer. Bahan penjerap dapat dilapiskan langsung pada lempeng atau denganmemakai perekat kalsium sulfat, pasta kanji atau perekat yang lain. Zat perekat bisamengandung zat berfluoresensi yang bisa menyerap sinar UV untuk membantuvisualisasi bercak senyawa.

4. Bejana KLTBejana KLT dapat memuat satu atau lebih lempeng kromatografi dan dapat ditutup

kedap.

Fungsinya

untuk

menampung

fase

gerak

atau

sebagai

ruang

pengembangan/eluasi bercak senyawa dengan fase geraknya.5. Pipet mikro

Pipet ini dapat mengeluarkan cairan sejumlah volume tertentu. Alat ini bisa digunakanuntuk penotolan bercak yang membutuhkan volume yang tetap/sama sehingga bisadigunakan untuk analisis secara kuantitatif atau semikuantitatif.6. Alat penyemprot

4

Alat ini digunakan untuk menyemprotkan butir-butir partikel cairan pereaksipenampak bercak. Dengan penyemprotan, maka distribusi pereaksi penampak bercaklebih homogen dan tidak terlalu tebal.

7. Lampu UVLampu UV digunakan untuk visualisasi bercak senyawa yang bisa dideteksi denganbantuan sinar UV. Senyawa yang mempunyai gugus kromofor umumnya bisadideteksi dengan sinar UV atau bahkan cukup dengan sinar tampak.

C. PERCOBAAN1. Penyiapan larutan uji dan larutan pembandingTimbanglah kurang lebih 2 gram serbuk simplisia dan masukkan dalam tabung.

Tuangkan 10 ml penyari yang sesuai dan biarkan terendam sambil dikocok-kocok diatas penangas air selama 10 menit (Sambil menunggu, lakukan penjenuhan bejana ataulangkah nomer 2). Setelah 10 menit, saring dengan kertas saring dan tempatkan filtratdalam labu takar, tambahkan penyri sampai tanda. Cairan ini kemudian disebut larutan

uji. Untuk membuat larutan pembanding, ikuti prosedur yang tertulis di masing-masing sampel uji dengan senyawa pembanding yang ditentukan.2. Penjenuhan bejanaMasukkan 2-4 ml fase gerak kedalam bejana KLT dan diamkan selama 10 menit untuk

menjenuhi bejana dengan fase gerak.3. Prosedur KLTTotolkan larutan uji dan larutan pembanding menurut cara yang tertulis pada masing-masing sampel uji dengan jarak penotolan 1,5-2,0 cm dari dasar/tepi bawah lempeng

KLT (bisa ditandai dengan pensil), kemudian biarkan mengering. Tetapkan jarakrambat 8 cm dari titik penotolan dan tandailah dengan pensil. Masukkan lempeng KLTpada bejana yang sudah dijenuhi fase gerak dengan hati-hati. Lepaskan lempeng secaraperlahan dan sandarkan pada dinding bejana, kemudian tutuplah bejana dengan rapat.

Pastikan bahwa totolan tidak tercelup pada fase gerak dan fase gerak bergerak keatassecara bersama-sama (membentuk garis horizontal lurus). Biarkan fase gerak bergerakkeatas pada permukaan lempeng hingga mencapai batas jarak rambat. Keluarkanlempeng dan keringkan diudara dan amati bercak dengan sinar tampak, sinar ultra

violet gelombang pendek (254 nm) kemudian dengan ultraviolet gelombang panjang(366 nm) dan bila perlu gunakan pereaksi penampak bercak (baca cara deteksi untukmasing-masing sampel). Hitunglah harga Rf dari bercak-bercak senyawa hasilpemisahan dan bandingkan dengan senyawa pembanding. Jika senyawa belumterdeteksi atau belum diperoleh pemisahan yang baik, lakukan analisis KLT ulang

dengan fase gerak yang berbeda.4. Sampel yang dianalisis dalam praktikumLakukan analisis terhadap sampel (materi 1 dan 2) dibawah ini dengan metode KLTdengan mengikuti langkah-langkah diatas. Pisahkan komponen-komonen senyawa

dalam sampel secara KLT, hitung harga Rf dan amati visualisasi bercak senyawadengan detektor yang telah ditentukan (dokumetasikan hasilnya dengan foto).

5

MATERI 1a. Senyawa golongan alkaloid

Buah cabe jawaFase gerak: dikloromethan : etil asetat (3:1)Fase diam: silika gel 60 F254Larutan uji: 1% dalam etanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkan

etanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendor danadd kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: piperin 0,1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV366, UV254 dan semprot dengan pereaksi dragendorf (amati pada sinar

tampak)

Buah MericaKerjakan seperti buah cabe jawa

Kulit kayu kinaFase gerak: kloroform : dietil amin (90:10)Fase diam: silika gel 60 F254Larutan uji: 5% dalam etanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkanetanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendor dan

add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 2 mikroliter.Larutan pembanding: kinin 0,1% dalam etanol, totolkan 10 mikroliterDeteksi : UV366, UV254 dan semprot dengan pereaksi dragendorf (amati pada sinartampak)

b. Minyak atsiri (terpenoid dan fenilpropanoid aromatis)Buah ketumbarFase gerak: toluen : etil asetat (9:1)

Fase diam : silika gel 60 F254Larutan uji: 10% dalam dikloromethan. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalutambahkan dikloromethan 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segerapindahkan ke eppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.

Larutan pembanding: timol 1% dalam toluen, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366, sinar tampak dan semprot dengan anisaldehid-asam sulfat,lalu panaskan lempeng KLT pada suhu 1000C selama 5-10 menit (amati pada sinartampak).

Daun sirihFase gerak: toluen : etil asetat (93:7)Fase diam : silika gel 60 F254Larutan uji: 2% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkanmetanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendor

dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: eugenol 0,2% dalam metanol, totolkan 3 mikroliter

6

Deteksi : UV254, UV366, dan semprot dengan vanilin-asam sulfat, lalu panaskanlempeng KLT pada suhu 1100C selama 5-10 menit (amati pada sinar tampak).

Kulit kayu manis janganFase gerak: toluen : etil asetat (98:2)Fase diam : silika gel 60 F254Larutan uji: 10% dalam etanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkanetanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendor dan

add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: sinamaldehid 1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366, sinar tampak dan semprot dengan anisaldehid-asam sulfat,lalu panaskan lempeng KLT pada suhu 1000C selama 5-10 menit (amati pada sinar

tampak)

c. Senyawa golongan kumarinBuah mengkuduFase gerak: eter : toluen : asam asetat 10% (55:45:0,8)Fase diam: silika gel 60 F254Larutan uji: 20% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalutambahkan metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke

eppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 2 mikroliter.Larutan pembanding: coumarin 0,1% dalam metanol, totolkan 2 mikroliterDeteksi : UV366, UV254 dan semprot dengan pereaksi KOH-etanolik (amati padasinar tampak)

Kulit batang pulosariKerjakan seperti buah mengkudu

Daun kemuningFase gerak: toluen : etil asetat (70:30)

Fase diam: silika gel 60 F254Larutan uji: 10% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalutambahkan metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan keeppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.

Larutan pembanding: coumarin 0,1% dalam metanol, totolkan 2 mikroliterDeteksi : UV366, UV254 dan semprot dengan pereaksi KOH-etanolik (amati padasinar tampak)

MATERI 2

a. TaninDaun TehFase gerak: Toluene : aseton : asam format (5:4:1)Fase diam: Silika gel 60 F254

7

Larutan uji: 20% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalutambahkan metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan keeppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.

Pembanding: Katekin 2% (dalam metanol), totolkan 5 mikroliterDeteksi: UV254, UV366, Besi (III) klorida 1% (amati pada sinar tampak)

Biji cokelatFase gerak: Toluene : aseton : asam format (5:4:1)

Fase diam: Silika gel 60 F254Larutan uji: 20% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalutambahkan metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan keeppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.

Pembanding: Katekin 2% (dalam metanol), totolkan 5 mikroliterDeteksi: UV254, UV366, Besi (III) klorida 1% (amati pada sinar tampak)

GambirFase gerak: asam asetat 15%

Fase diam: selulosaLarutan uji: 0,1% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalutambahkan metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan keeppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.

Larutan pembanding: katekin 0,1% dalam metanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : Besi (III) klorida 1% (amati pada sinar tampak)

b. Flavonoid

Daun kumis kucingFase gerak: kloroform : etil asetat (60:40)Fase diam : silika gel 60 F254Larutan uji: 10% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu

tambahkan metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan keeppendor dan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: quersetin 1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366, sinar tampak dan semprot dengan sitroborat, lalu panaskanlempeng KLT pada suhu 1000C selama 5-10 menit dan amati dibawah sinar UV366

Daun alpukatFase gerak: kloroform : metanol ; air (80:12:2)Fase diam : silika gel F254Larutan uji: 5% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkan

metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendordan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: quersetin 0,1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366, dan semprot dengan Aluminium klorida lalu amati dibawah

sinar UV366

Daun tempuyung

8

Fase gerak: asam asetat : asam formiat : air (100:15:17)Fase diam : silika gel 60 F254Larutan uji: 5% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkan

metanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendordan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: rutin 1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366, sinar tampak dan semprot dengan sitroborat, lalu panaskanlempeng KLT pada suhu 1000C selama 5-10 menit dan amati dibawah sinar UV366.

c. Antrakinon:Daun lidah buayaFase gerak: etil asetat : metanol : air (9:1:0,5)Fase diam: silika gel 60 F254Larutan uji: 5% dalam etanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkanetanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendor dan

add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 1 mikroliter.Larutan pembanding: istizin 0,1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366 dan pereaksi semprot KOH-etanolik (amati pada sinartampak dan dibawah sinar UV365)

Daun ketepengKerjakan seperti akar kelembak

Akar kelembakFase gerak: n-heksan:kloroform:etil asetat (20:1:1)

Fase diam: silika gel 60 F254Larutan uji: 5% dalam metanol. Uapkan penyari hingga ekstrak kering, lalu tambahkanmetanol 1 ml untuk melarutkan kembali ekstrak dan segera pindahkan ke eppendordan add kan sampai tanda volume 1 ml. Totolkan 5 mikroliter.

Larutan pembanding: istizin 0,1% dalam etanol, totolkan 5 mikroliterDeteksi : UV254, UV366 dan pereaksi semprot KOH-etanolik (amati pada sinartampak dan dibawah sinar UV365)

9

UNIT II

SKRINING FITOKIMIA

A. Tujuan Praktikum

Sebelum melakukan praktikum ini, praktikan wajib memahami berbagai golongansenyawa yang terdapat dalam tumbuhan, terutama yang disebut metabolit sekunder.

Setelah melakukan praktikum ini, dengan menggunakan metode KLT, mahasiswamampu mengidentifikasi senyawa metabolik sekunder.

B. Pendahuluan

Para peneliti dalam bidang bahan alam untuk tujuan mencari tetumbuhan atau senyawakandungannya yang memiliki aktivitas biologi melakukannya dengan dua macampendekatan, yaitu (a) pendekatan fitofarmakologi dan (b) pendekatan skrining fitokimia.

Pendekatan fitofarmakologi meliputi uji berbagai efek farmakologi terhadap hewan

percobaan dengan ekstrak tumbuhan atau bagian tumbuhan. Misalnya afek farmakologiterhadap susunan syaraf pusat, terhadap organ tertentu,dan sebagainya. Percobaanfarmakologi dapat dilakukan secara in vivo dan/atau in vitro. Adapun aktivitas yang diujikanantara lain antineoplastik (antikanker), antiviral, antimicrobial, antimalaria, insektisida,hipoglikemik, kardiotonik, estrogenik atau androgenik, dan sebagainya.

Pendekatan skrining fitokimia meliputi analisis kualitatif kandungan kimia dalam

tumbuhan atau bagian tumbuhan (akar, batang, daun, bunga, buah, biji), terutama kandunganmetabolit sekunder yang bioaktif, yaitu alkaloid, antrakinon, flavonoid, kumarin, saponin(steroid dan triterpenoid), tannin (polifenolat), minyak atsiri (terpenoid dan fenilpropanoidaromatis), iridoid, dan sebagainya. Adapun tujuan utama dari pendekatan skrining firokimia

adalah untuk mensurvei tumbuhan untuk mendapatkan kandungan bioaktif atau kandunganyang berguna untuk pengobatan.

Metode yang digunakan atau dipilih untuk melakukan skrinig fitokimia harus memenuhibeberapa persyaratan antara lain (a) sederhana, (b) cepat, (c) dapat dilakukan denganperalatan yang minimal, (d) selektif terhadap golongan senyawa yang dipelajari, (e) bersifatsemi kuantitatif, yaitu memiliki batas kepekaan untuk senyawa yang bersangkutan, serta (f)

dapat memberikan keterangan tambahan ada/tidaknya senyawa tertentu dari golongansenyawa yang dipelajari. Dalam bentuk laporan kriteria (a) sampai dengan (d) dapatditemukan, tetapi untuk (e) dan (f) jarang sekali ada.

10

Analisis kualitatif untuk mengetahui golongan senyawa yang bioaktif tadi dapatdilakukan dengan uji tabung dan/atau uji kualitatif secara KLT. Kedua metode ini dapatdigabungkan dan dapat dilakukan untuk melakukan survey tumbuhan di lapangan.

C. Percobaan

Uji skrining fitokimia dilakukan dengan metode KLT terhadap sampel yang ada.Pertama-tama lakukan terlebih dahulu penyarian dengan cairan penyari yang relevan

dilanjutkan dengan analisis dengan KLT. Gunakan fase gerak yang tepat untuk menganalisiskandungan kimia sampel. Jika anda belum memperoleh pemisahan bercak yang baik, gantifase geraknya hingga optimal (kandungan kimia senyawa terpisah dengan baik). Carilahliteratur dan diskusikan dengan dosen pembimbing sistem KLT yang akan anda gunakan

dalam skrining fitokimia. Serbuk simplisia yang dianalisis akan dipersiapkan oleh laboran.Setiap praktikan bertugas untuk mengekstraksi/menyari serbuk simplisia tersebut denganbeberapa cairan penyari untuk memudahkan identifikasi setiap golongan senyawa.

A. Sari dalam Petroleum eterSari ini mengandung zat-zat kimia yang larut dalam minyak, misalnya minyak atsiri,

Lemak dan asam lemak tinggi, steroid dan triterpenoid juga karotenoid.Cara penyarian :Sejumlah 10 gram serbuk simplisia disari dengan petroleum eter (sampai serbukterendam) dengan cara pengocokan berkali-kali hingga larutan penyari jernih. Sari

petroleum eter dipekatkan sampai kira-kira 5 ml untuk KLT.

B. Sari dalam eterSari ini mengandung senyawa alkaloid, senyawa-senyawa fenolik (fenol-fenol, asamfenolat, fenil propanoid, flavonoid, antrakinon, xanton dan stilben), komponen minyak

atsiri tertentu, dan asam lemak. Senyawa fenolik bisa dideteksi dengan pereaksi semprotFeCl3 yang akan memberikan warna. Adanya warna hijau, ungu, biru sampai hitam yangmengindikasikan adanya senyawa fenolik terutama fenol bebas. Senyawa turunanfenilpropanoid (kumarin) memberikan fluoresensi biru atau hijau dibawah sinar UV

sedangkan senyawa golongan antrakinon akan berwarna merah pada penyemprotandengan KOH-etanolik.Cara penyarian :Serbuk sisa (ampas) penyarian dengan petroleum eter (point A) disari kembali dengan

eter dengan cara pengocokan berkali-kali, sehingga hasil pengocokan terakhir biladiuapkan tidak meninggalkan sisa. Sari dalam eter yang diperoleh dipekatkan sampaikurang lebih 5 ml dan digunakan untuk KLT.

C. Sari Etanol-AirSari ini mengandung zat-zat kimia sebagai berikut :1. Garam alkaloid, alkaloid basa kuarterner dan amina teroksidasi

11

2. Antosian3. Glikosida4. Saponin5. Tanin

Cara penyarian : Serbuk sisa (ampas) penyarian dengan eter disari dengan etanol 70%berkali-kali hingga pelarut hampir jernih. Sari yang diperoleh dipekatkan hingga sekitar30 ml dan dibagi 3 masing-masing 10 ml untuk KLT.

1. Garam alkaloid dan amina teroksidasiLebih kurang 10 ml sari etanol 70% diuapkan hingga penyarinya menguap

kemudian ditambahkan HCl 10% secukupnya sambil dipanaskan dan diaduk,larutan yang diperoleh dibagi dua. Bagian 1 untuk garam alkaloid, bagian 2 untukamina teroksidasi dan basa kuarterner.a. Larutan pada tabung 1 ditambah ammonia encer hingga pH 8-9 kemudian disaridengan kloroform. Sari kloroform dipekatkan kurang lebih 1 ml dan gunakan

untuk percobaan KLT garam alkaloid.b. Larutan pada tabung 2 dikeringkan dan kemudian dilarutkan dengan sedikitHCL (2%) hingga terbentuk larutan. Larutan tersebut kemudian ditambahsedikit NaCl padat sambil diaduk, larutan lalu disaring. Fltrat yang diperoleh

dipekatkan dan digunakan untuk larutan percobaan KLT alkaloid basakuarterner atau amina teroksidasi.

2. Glikosida

Lebih kurang 10 ml sari dalam etanol air ditambah 7,5 ml HCL 10% LP, kemudiandirefluks selama 30 menit. Setelah didinginkan larutan disari 3 kali dengan masing-masing 5 ml eter P dalam corong pisah. Lapisan eter dipisahkan, kemudianditambah dengan natrium sulfat anhidrat. Saring dan pekatkan untuk pengujian

aglikon steroid, terpenoid, kumarin dll (seperti pada sari eter).

3. Untuk identifikasi KLT senyawa yang lain yang relatif polar (saponin, tannin dll),gunakan sisa sari etanol 70% yang sudah dipekatkan.

Sistem KLT yang digunakanLempeng KLTLempeng yang digunakan adalah Silika gel F254

Fase gerakGunakan fase gerak yang sesuai untuk masing-masing kandungan kimia yang akandiperiksa. Perhatikan skema sistem KLT, bila tidak terdapat fase gerak yangsesuai,carilah di literatur dan diskusikan dengan dosen pembimbing praktikum.

Pereaksi penampak atau cara deteksi

12

Gunakan pereaksi penampak bercak yang sesuai untuk masing-masing kandungankimia yang diperiksa. Pehatikan skema sistem KLT, bila tidak ada yang sesuai, carilahdi literatur dan diskusikan dengan dosen pembimbing praktikum.

Skema KLTGunakan sistem KLT seperti pada percobaan sebelumnya (Unit I) atau mengikutiskema seperti dibawah ini.

13AlkaloidAntrakuinonFase diamSilika gel F 254Silika gel F 254Fase gerakToluena-etilasetat-dietilamina (7:2:1v/v)Etil asetat-metanol-air (100:13,5:10v/v)DeteksiDragendorff dilanjutkan natriumnitritKOH 5% etanolikKeteranganBercak berwarna jingga sampaimerah tua di bawah sinar tampakBercak di bawah sinar tampakberwarna merah menunjukkan adanyaantrakuinonStandarKinin atau piperinIstizin

KumarinTanin dan senyawa fenolik lainFase diamSilika gel F 254Silika gel F 254Fase gerakDietil eter-toluena (1:1 v/v)dijenuhkan dengan asam asetat 10%Etil asetat-metanol-air (100:13,5:/v v)DeteksiKOH 5% etanolikFeCl3KeteranganBiru muda atau sawo matangDi bawah sinar tampak, senyawafenolik akan berwarna hijau hinggabiru kehitamanStandarKumarinKatekin atau asam galat

Minyak atsiri (terpenoid)FlavonoidFase diamSilika gel F 254Silika gel F 254Fase gerakToluen : etil asetat (9:1 v/v)Etil asetat-asam format-asam asetatglasial-air (100:11:11:27 v/v)PembandingTimolQuercetin atau rutinDeteksiAnisaldehida asam sulfat dipanaskano100 CDi bawah UV 366 berpendar kuningintensif, hijau atau jinggaKeteranganBercak berwarna biru/merahdibawah sinar tampakAlCl3

SaponinFase diamSilika gel F 254Fase gerakKloroform-metanol-air (64:50:10 v/v)DeteksioAnisaldehida asam sulfat dipanaskan 100 CKeteranganBercak berwarna biru dibawah sinar tampakStandarSaponin

DAFTAR PUSTAKA

1. Depkes RI, Materia Medika Indonesia, jilid I-VI, Jakarta.

2. Depkes RI, 2008, 2010, 2011, Farmakope Herbal Indonesia dan SuplemenFarmakope Herbal Indonesia, Edisi I, Jakarta

3. Jork, H., Funk, W., Ficher, W., Wimmer, H., 1990, Thin Layer Chromatography, vol.1a, VCH, NewYork

4. Wagner H., ang Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis., Springer-Verlag., Berlin.

5. Wall, P.E., Thin-layer Chromatography, A Modern Practical Approach, 2005, TheRoyal Society of Chemistry, Cambridge.

6. Waksmundzka-Hajnos,

M., Sherma, J., Kowalska, T.,

2008,

Thin

Layer

Chromatography in Phytochemistry, CRC Press, New York.

14

15