pewarnaan tunggal dan differensial_popy sarah c_260110130136
TRANSCRIPT
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
1/22
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN SEDERHANA
Senin, 2 Maret 2015
Kelompok I
Senin, Pukul 13.0016.00 WIB
Nama NPM
Popy Sarah Chairunnisa 260110130136
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN2015
Nilai TTD
(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
2/22
I.
Tujuan
Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan
menggunakan satu macam zat pewarna.
II. Prinsip
1. Ikatan ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen seluler
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler
maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini maka dapat
dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya
terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut ya
3.
Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi
bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang
percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun
praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.
III. Teori Dasar
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan.
Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di
identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut
berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro,
1998).
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
3/22
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah
pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanyadigunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya
bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu
fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian
dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat
juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu
spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad reniklain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-
bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan
struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora, flagella dan pengecatan kapsul (waluyo, 2010).
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
4/22
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya
sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan
zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan
inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003).
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam
zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk
mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakanpewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol ,
fuchsin , dan safranin (lay ,1994).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk
dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang
mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Lestari,
2013)
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif) (Lestari, 2013)
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
5/22
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran,
bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna
khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal
terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion
positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer,
1998).
IV.Alat dan Bahan
Alat
1. Bak pewarna
2. Cawan petri
3. Kaca obyek
4. Kapas
5. kertas saring
6. Mikroskop majemuk
7. Ose
8.
pembakar spirtus
Bahan
1. Zat warna karbol fuksin, biru metilen dan karbol gentian violet
2. Sampel air liur
3. Alkohol 70 %
4. air suling dalam botol semprot
5.
minyak celup.
Gambar Alat
1. Bak Pewarna
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
6/22
2.
Cawan petri
9.
4.
kaca obyek
5.
Kapas
6. Kertas Saring
7.
Mikroskop Majemuk
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
7/22
8.
Ose
9. Pembakar Spiritus
V. Prosedur
Alat dan bahan mula-mula disiapkan. Dimasukkan air liur dari
relawan secukupnya dalam cawan petri yang telah disterilkan dan dalam tertutup.
Kemudian diambil kaca preparat yang telah direndam dalam alkohol, dilap
menggunakan kapas yang telah ditetesi etanol 95% hingga kesat (bebas lemak).
Setelah itu dibuat olesan bakteri secara aseptis di dekat api setipis-tipisnya
menggunakan ose yang telah dibakar hingga berpijar sebelumnya dan didinginkan
di dekat api, kemudian digambar lingkaran tempat mengoeskan bakteri di
permukaan bawah kaca preparat menggunakan spidol. Kemudian difiksasikan
dengan melewatkan kaca di dekat api. Setelah dingin, kaca preparat diletakkan
diatas bak pewarnaan, daerah yang telah diolesi sampel air liur diteteskan dengan
salah satu zat warna, kemudian dibiarkan selama beberapa waktu. Bila digunakan
karbol fuksin, dibiarkan olesan terwarnai selama 5 menit. Bila digunakan biru
metilen, dibiarkan olesan terwarnai selama 1-2 menit, Sedang bila digunakan karbol
gentian violet, biarkan olesan terwarnai selama 15-30 detik.
Setelah ditetesi zat warna dan dibiarkan selama beberapa waktu, preparat
dimiringkan agar cairan pewarna mengalir ke bak pewarnaan, setelah itu preparat
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
8/22
dibilas dengan air suling dengan cara dilewatkan dari salah satu sisi preparat ke sisi
yang lain. Preparat kemudian dikeringkan dengan kertas saring. Setelah itu diteteskan
sedikit minyak emersi pada preparat, dan bakteri dilihat dengan menggunakan
mikroskop. Hasil yang terlihat pada mikroskop kemudian digambar pada buku
gambar sesuai dengan warna yang dihasilkan dari setiap pewarna.
VI.Data Pengamatan
VII. Pembahasan
Pada praktikum Mikrobiologi Farmasi kali ini dilakukan pewarnaan tunggal
dari sampel bakteri yang diperoleh dari air liur relawan. Air liur atau saliva adalah cairan
bening yang dihasilkan dalam mulut manusia yang disekresikan dari kelenjar ludah.
Saliva mengandung zat-zat seperti elektrolit, mukosa, enzim, dan beberapa senyawa
antibakteri seperi tiosianat dan imunoglobulin. Namun selain zat-zat tersebut, saliva juga
mengandung bakteri flora normal yang tidak menggangu sistem imun manusia.
Prosedur pelaksanaan praktikum dimulai dari pemindahan air liur relawan
dari mulut ke cawan petri yang telah disterilisasi, kemudian ditutup untuk mencegah
adanya kontak dengan udara yang apabila terdapat mikroorganisme didalamnya dapat
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
9/22
mempengaruhi hasil yang diamati. Digunakan kaca preparat yang telah disterilisasi
dengan direndam dalam alkohol dan disapukan dengan kapas yang telah ditetesi alkohol
agar kotoran-kotoran berupa lemak atau material lainnya di permukaan preparat dapat
disingkirkan.
Metode pelaksanaan praktikum ini dilakukan secara aseptis dimana setiap
perlakuan yang melibatkan alat yang bersentuhan langsung dengan sampel harus
disterilkan terlebih dahulu dan selalu di dekat api, agar tidak adanya kontaminan yang
mempengaruhi hasil pengamatan. Untuk cawan petri harus disterilkan dengan autoklaf,
sedangkan ose dibakar di api hingga berpijar, kemudian didinginkan di dekat api. Ose
penting untuk didinginkan agar ketika menyentuh sampel tidak membunuh bakteri yang
terdapat pada sampel tersebut.
Maka sebelum pengolesan sampel ke kaca preparat, terlebih dahulu
pembakar spiritus dinyalakan. Ose kemudian dibakar di api hingga berpijar dan
didinginkan, setelah itu cawan petri dibuka dan lubangnya difiksasikan di dekat api agar
tidak ada bakteri yang masuk. Sampel diambil dengan ose yang telah dingin, kemudian
dioleskan diatas kaca preparat, pengolesan sampel harus setipis mungkin agar tidak ada
bakteri yang menumpuk dan bakteri mudah dilihat, setelah dioleskan lubang pada cawan
kembali difiksasikan dan segera ditutup. Tempat pengolesan sampel tadi ditandai dengan
spidol di permukaan bawah preparat, agar pada saat pemberian zat pewarna dan
pengamatan melalui mikroskop lebih mudah. Setelah itu preparat dilewatkan di api agar
bakteri menempel pada permukaan preparat. Preparat tidak boleh dilewatkan di api terlalu
lama, karena dapat membunuh bakteri.
Setelah preparat yang mengandung sampel tersedia, diambil pewarna karbon
gentian violet dan diteteskan diatas permukaan preparat yang telah diolesi sampel dan
didiamkan selama 30 detik. Pendiaman ini dilakukan agar warna dapat diabsorbsi oleh
bakteri sehingga dapat dilihat bentuknya di mikroskop. Prosedur yang sama juga
dilakukan untuk pewarna metilen blue hanya saja didiamkan selama 2 menit agar warna
dapat diabsorbsi.
Hasil pengamatan menunjukkan adanya bakteri berbentuk cocci yang
menyerap warna biru dari metilen blue dan warna merah-ungu dari karbol gentian violet.
Hasil ini dapat diamati karena Selsel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila
pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
10/22
dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan
berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan
antara zat warna dan sel bakteri
Pewarnaan tunggal ini merupakan teknik pewarnaan sederhana yang
bertujuan untuk melihat bentuk sel, bentuk, dan ukurannya dan tidak membutuhkan reaksi
kompleks, sehingga prosesnya tidak panjang. Namun karena keterbatasan alat, perbesaran
yang digunakan pada mikroskop tidak begitu memadai untuk melihat struktur yang jelas
dari suatu bakteri
VIII. Kesimpulan
Ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan
menggunakan satu macam zat pewarna.
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
11/22
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro. 1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Penerbit Djambatan.
Entjang, I. 2003.Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan.
Citra Aditya Bakti. Bandung.
Lay, Bibiana. 1994 .Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali
Lestari, Rina. 2013. MAKALAH PEWARNAAN SEDERHANA, NEGATIF,
KAPSUL dan GRAM. Tersedia online dihttps://www.academia.edu/10414811/Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAA
N_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAM
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998.Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta :
Erlangga.
Waluyo, Iud. 2004.Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.
https://www.academia.edu/10414811/Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAAN_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAMhttps://www.academia.edu/10414811/Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAAN_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAMhttps://www.academia.edu/10414811/Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAAN_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAMhttps://www.academia.edu/10414811/Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAAN_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAMhttps://www.academia.edu/10414811/Pewarnaan_Bakteri_1_MAKALAH_PEWARNAAN_SEDERHANA_NEGATIF_KAPSUL_dan_GRAM -
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
12/22
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN DIFFERENSIAL
Senin, 2 Maret 2015
Kelompok I
Senin, Pukul 13.0016.00 WIB
Nama NPMPopy Sarah Chairunnisa 260110130136
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
13/22
IX.
Tujuan
Mengamati dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif,
dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan
reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
X.
Prinsip
1. Ikatan ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya
terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut ya
3. Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi
bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang
percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun
praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.
4. Absorpsi
suatu fenomena fisika/kimia atau proses atom, molekul, dan ion
memasuki suatu fase besar gas, cair, atau padat.
XI.
Teori Dasar
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik
lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
14/22
bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan
struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora, flagella dan pengecatan kapsul (waluyo, 2010).
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi
atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan
bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna
ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna(decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna
dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila
warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil
akhir tetap warna dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop
cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara
sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri
sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup.
Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai
dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer,
1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir
tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hinggasukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama
dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-
zat warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus
diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
15/22
tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan
ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna
dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa.
Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebutkromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian
yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa
lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada
permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene
Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa
antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus
yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena
pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel
bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral.
Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun
negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat
ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakansuspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka
akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi
bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass
tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
16/22
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
(Irawan, 2008).
XII. Alat dan Bahan
Alat
1. Bak pewarna
2.
Cawan petri
3. Kaca obyek
4.
Kapas
5. kertas saring
6.
Mikroskop majemuk7. Ose
8. pembakar spirtus
Bahan
2.
Zat warna karbol gentian violet, lugol (iodium : kalium iodium : air
suling 1 : 2: 100) dan air fuksin.
3.
Suspensi campuran bakteriE. coli dan S. aureus.4.
Alkohol 70 %
5. air suling dalam botol semprot
6.
minyak emersi,
Gambar Alat
1. Bak Pewarna
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
17/22
2.
kaca obyek
3.
Kapas
4. Kertas Saring
5. Mikroskop Majemuk
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
18/22
6.
Ose
7.
Pembakar Spiritus
XIII.
Prosedur
Alat dan bahan mula-mula disiapkan. Diambil kaca preparat yang
telah direndam dalam alkohol, dilap menggunakan kapas yang telah ditetesi etanol
95% hingga kesat (bebas lemak). Setelah itu dibuat olesan bakteri dari suspensi
campuran bakteriE. coli dan S. aureussecara aseptis di dekat api setipis-tipisnya,
kemudian digambar lingkaran tempat mengoeskan bakteri di permukaan bawah
kaca preparat menggunakan spidol. Kemudian difiksasikan dengan melewatkan
kaca di dekat api. Setelah dingin, kaca preparat diletakkan diatas bak pewarnaan,
daerah yang telah diolesi sampel diteteskan dengan pewarna karbol gentian violet,
setelah itu didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit preparat dimiringkan agar
cairan pewarna mengalir ke bak pewarnaan, setelah itu preparat dibilas dengan air
suling dengan cara dilewatkan dari salah satu sisi preparat ke sisi yang lain.
Daerah yang diolesi bakteri kemudian diteteskan dengan cairan lugol
dan didiamkan selama 2 menit, setelah itu preparat dimiringkan agar cairan
pewarna mengalir ke bak pewarnaan, setelah itu preparat dibilas dengan air suling.
Daerah yang diolesi bakteri kemudian dicuci dengan pemucat alkohol
95% tetes demi tetes selama 30 detik lalu dibilas dengan air suling. Setelah itu
daerah tadi diteteskan dengan cairan fuksin dan didiamkan selama 30 detik lalu
dibilas dengan air suling.
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
19/22
Preparat kemudian dikeringkan dengan kertas saring. Setelah itu
diteteskan sedikit minyak emersi pada preparat, dan bakteri dilihat dengan
menggunakan mikroskop. Hasil yang terlihat pada mikroskop kemudian digambar
pada buku gambar sesuai dengan warna yang dihasilkan dari setiap pewarna.
XIV. Data Pengamatan
XV.Pembahasan
Pada praktikum Mikrobiologi Farmasi kali ini dilakukan pewarnaan
differensial dari sampel suspensi bakteri E.coli dan S.aureus. Kedua bakteri ini
memiliki komponen dinding sel yang berbeda sehingga dalam tahapan
pewarnaannya akan menghasilkan warna yang berbeda.
Prosedur pelaksanaan praktikum dimulai dari pembersihan kaca
preparat yang telah disterilisasi dengan direndam dalam alkohol dan disapukan
dengan kapas yang telah ditetesi alkohol agar kotoran-kotoran berupa lemak atau
material lainnya di permukaan preparat dapat disingkirkan.
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
20/22
Metode pelaksanaan praktikum ini dilakukan secara aseptis dimana
setiap perlakuan yang melibatkan alat yang bersentuhan langsung dengan sampel
harus disterilkan terlebih dahulu dan selalu di dekat api, agar tidak adanya
kontaminan yang mempengaruhi hasil pengamatan. Ose harus dibakar di api
hingga berpijar, kemudian didinginkan di dekat api. Ose penting untuk
didinginkan agar ketika menyentuh sampel tidak membunuh bakteri yang terdapat
pada sampel tersebut.
Maka sebelum pengolesan sampel ke kaca preparat, terlebih dahulu
pembakar spiritus dinyalakan. Ose kemudian dibakar di api hingga berpijar dandidinginkan, setelah itu penyumbat tabung suspensi dibuka dan lubangnya
difiksasikan di dekat api agar tidak ada kontaminan yang masuk. Sampel diambil
dengan ose yang telah dingin, kemudian dioleskan diatas kaca preparat,
pengolesan sampel harus setipis mungkin agar tidak ada bakteri yang menumpuk
dan bakteri mudah dilihat, setelah dioleskan lubang tabung kembali difiksasikan
dan segera ditutup. Tempat pengolesan sampel tadi ditandai dengan spidol di
permukaan bawah preparat, agar pada saat pemberian zat pewarna dan
pengamatan melalui mikroskop lebih mudah. Setelah itu preparat dilewatkan di
api agar bakteri menempel pada permukaan preparat. Preparat tidak boleh
dilewatkan di api terlalu lama, karena dapat membunuh bakteri.
Setelah preparat yang mengandung sampel tersedia, diambil pewarna
karbon gentian violet dan diteteskan diatas permukaan preparat yang telah diolesi
sampel dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu preparat dimiringkan untuk
mengalirkan pewarna ke bak pewarnaan dan preparat dibilas dengan air suling
Hasil pengamatan menunjukkan adanya bakteri berbentuk cocci yang
menyerap warna biru dan bakteri berbentuk basil yang menyerap warna merah-
ungu.
Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram positif dan gram
negative berdasarkan kemampuannya untuk menahan pewarna primer (kristal
ungu) atau kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan (safranin).
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
21/22
Bakteri gram positif menunjukkan warna biru atau ungu dengan pewarnaan ini,
sedangkan bakteri gram negatif menunjukkan warna merah.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram
positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam
presentase lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada
praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan fuksin masuk ke dalam sel
dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatifsedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan
alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun
sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu, yang
merupakan warna dari Kristal Violet.
XVI. Kesimpulan
Dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatifdapat diamati
dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, serta setiap langkah dan reaksi-
reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut dapat dipahami.
-
7/23/2019 Pewarnaan Tunggal Dan Differensial_Popy Sarah C_260110130136
22/22
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005.Biologi Jilid 2.Erlangga. Jakarta.Hadioetomo, R, S., 1990.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998.Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta :
Erlangga.
Waluyo, Iud. 2004.Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.