PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI Part I Modul Respirasi 2011

SEKSI PENDIDIKAN 2009

Ade Ilyas Mukmin Anggi Puspita Nalia Pohan

Dessy Framita Dina elita

Enninurmita Hazrudia Fitria Chandra

Gusti Rizky Teguh Riyanto Kabisat Febiachrulia

Karina Kalani Firdaus Monika Besti Yolanda Naela Himayati Afifah

Qam Qam Qurratul Aini Riska Wahyuningtyas

Rizka Ramadhani Tika Ayu Pratiwi

Wahyu Permata Sari Zahra Suhardi

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2011

Praktikum Mikrobiologi Part I

Berikut ini adalah spesimen yang dapat digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis berdasarkan lokasi dan mikroorganismenya:

A. Infeksi saluran pernapasan atas

Faringitis: o Streptococcus hemolitikus grup A

Penyebab faringitis akut Spesimen berasal dari Swab kemudian dikultur dan

o Bordetella pertussis Merupakan mikroorganisme yang cepat mat Spesimen yang digunakan a

o Corynebacterium diptheriae Spesimen: swab nares posterior dan faring

o Viral Spesimen: swab nasal/

Laryngitis o Terutama disebabkan oleh viruso Spesimen: swab/nasal washing

Praktikum Mikrobiologi Part I

Berikut ini adalah spesimen yang dapat digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis berdasarkan lokasi dan mikroorganismenya:

Infeksi saluran pernapasan atas

hemolitikus grup A akut

swab dinding faring bagian posterior ultur dan dilakukan uji deteksi antigen secara langsung

ikroorganisme yang cepat mati, sehingga harus segera diSpesimen yang digunakan adalah mukus yang berasal dari nasofaring posterior

Corynebacterium diptheriae wab nares posterior dan faring posterior

nasal/nasal washing yang disimpan dalam medium transport virus

Terutama disebabkan oleh virus nasal washing dengan medium transport virus

Berikut ini adalah spesimen yang dapat digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis

langsung

segera dikultur nasofaring posterior

medium transport virus

Epiglottitis o Bukan indikasi kultur swab, karena menyentuh epiglotis yang inflamasi dapat

menyebabkan obstruksi total saluran napas o Pilihan spesimen: kultur darah

Sinusitis o Spesimen: aspirasi sinus dengan jarum setelah dekontaminasi rongga hidung o Spesimen lain selain aspirasi tidak direkomendasikan

B. Infeksi saluran pernapasan bawah

Pneumonia o Spesimen:

Sputum Aspirasi/biopsi paru Bronchial lavage Aspirasi transtrakea Darah Pada pneumonia bakteri sputum bukanlah pilihan spesimen yang tepat

untuk menentukan agen etiologis, karena sputum dapat terkontaminasi dengan flora normal mulut

Penampakan tenggorokan pasien faringitis dan tonsillitis. Faring dan tonsil menjadi merah terang (eritem) dan supuratif. Nodul pus berwarna keputihan juga tampak pada tonsil.

Whitish pus

Diagnosis dipteri. Penampakan klinis infeksi dipteri, di antaranya inflamasi luas faring dan tonsil yang ditandai dengan bercak keabu-abuan (berupa pseudomembran) dan pembengkakan pada seluruh area.

Cara mengambil spesimen yang tepat, yaitu:

A. Swab tenggorokan

Dengan menggunakan tongue blade untuk menjaga lidah tetap di bawah dan tidak menghalangi faring, lihat bagian belakang tenggorokan dan area tonsil untuk melokalisasi area inflamasi dan eksudat, kemudian swab pada area tersebut. Kedua area tersebut (dinding faring posterior dan tonsil) merupakan area yang paling produktif, sehingga dapat digunakan untuk kultur agen etiologis faringitis akut.

Berikan label pada kontainer swab dengan data pasien, termasuk waktu pengambilan sampel. Kirimkan swab ke laboratorium secepat mungkin (jika transport ditunda lebih dari 1 jam, simpan swab pada pendingin).

B. Sputum

Sebelum mengambil sputum, siapkan kontainer untuk menyimpan sputum tersebut. Syarat kontainer yang baik, yaitu:

Steril (kecuali untuk tuberculosis, gak tau deh kenapa??? Di slide nya kyk gtu) Bersih Memiliki lubang/mulut yang luas (wide mouth) Jernih/transparan Memiliki tutup yang rapat Tidak bocor

Cara mengambil sputum yang benar, yaitu:

Jelaskan kepada pasien mengenai cara mengambil sputum dengan benar Pasien diberi waktu untuk mengeluarkan sputum bronchial dari tenggorokan bagian

dalam Jangan pernah mengambil spesimen sputum di dalam klinik atau laboratorium

ataupun dalam ruangan dengan sirkulasi yang tertutup Pengambilan sputum dilakukan di luar ruangan (outdoor) dan jauh dari orang lain Tempelkan mulut kontainer ke bibir bagian bawah, keluarkan sputum, dan tutup

segera kontainer.

Berikut ini merupakan contoh-contoh sputum yang benar.

Mukoid Purulen Berdarah Saliva

Setelah mendapatkan sputum yang benar, berikan label pada kontainer, yang terdiri dari:

Data pasien: nama, umur, jenis kelamin Jam dan tanggal pengambilan spesimen, nomer spesimen, nama dokter Request form harus disertakan pada setiap specimen Informasi pada formulir harus sama dengan informasi pada kontainer Selalu berikan label pada sisi kontainer, bukan pada tutupnya, karena kata

dosennya tutupnya itu sering ketuker-tuker Gunakan spidol permanen, tulis nama tersangka TB, tangggal pengambilan, dan

institusi kesehatan

Spesimen sebaiknya dikirim secepat mungkin ke laboratorium. Bila terjadi keterlambatan pengiriman, atau pengiriman memerlukan waktu lebih dari 12 jam setelah pengambilan sputum, maka simpan sputum pada suhu 4C.

Catatan:

Untuk pemeriksaan infeksi saluran napas bawah bakterialis, pengambilan spesimen cukup dilakukan 1 kali

Untuk pemeriksaan Mycobacteria atau jamur, pengambilan sputum dilakukan pada pagi hari 3 kali berturut-turut (pagi-pagi-pagi), sehingga memerlukan waktu 3 hari. Namun, untuk mempermudah, pengambilan sputum untuk pasien tersangka TB dapat dilakukan 3 kali dengan urutan sewaktu-pagi-sewaktu (SPS), sehingga cukup dilakukan selama 2 hari (hari pertama sewaktu, hari kedua pagi dan sewaktu)

Pemeriksaan mikroorganisme anaerob pada sputum TIDAK DILAKUKAN

Deteksi langsung atau uji molekuler terhadap sputum dapat dilakukan pada beberapa pemeriksaan tertentu dan pada laboratorium yang kompeten

Pemeriksaan mikroskopik sputum dengan pewarnaan tertentu dilakukan dengan terlebih dahulu membuat apusan pada slide. Slide yang digunakan harus slide yang baru, terutama ketika membuat apusan basil tahan asam (BTA). Jangan pernah menggunakan kembali slide apusan sputum yang pernah digunakan untuk mendeteksi tuberkulosis.

Slide harus dibersihkan dengan alkohol dan dilap hingga kering, atau dilewatkan pada api. Hal ini akan menghilangkan berbagai residu minyak yang dapat mengganggu pewarnaan.

Setelah dibersihkan, berikan data yang tepat pada setiap slide dengan nama pasien, tanggal, and nomer spesimen. Gunakan pensil untuk menulis nomer tersebut pada ujung slide

yang permukaaannya kasar, kemudian buatlah daerah berbentuk oval berukuran 3x2 cm di tengah slide.

Ose itu semacam tongkat yang dipake buat ngambil sputum sama ngoles-ngolesin sputumnya di slide gitu Bahannya dari logam, gak tau besi gak tau apa..

Apusan yang baik adalah apusan yang merata dan tipis, sehingga tulisan pada gambar di atas masih bisa dibaca walaupun tertutup apusan sputum. Apusan yang terlalu tebal akan mudah terbilas ketika dilakukan pewarnaan. Selain itu, apusan yang terlalu tebal juga akan lebih sulit dilihat pada mikroskop.

Setelah dilakukan pengapusan sputum, keringkan apusan, dengan catatan:

Untuk pewarnaan basil tahan asam (BTA): o Slide yang basah dapat membentuk aerosol jika terganggu. Aerosol itu

maksudnya sebagian kecil dari sputumnya terbang2 di udara gitu, terutama bakterinya sih, bukan sputumnya

o Tempatkan slide pada area yang aman di mana slide tersebut dapat kering selama 15-30 menit

o Hindari kontak langsung dengan sinar matahari o Jangan mempercepat pengeringan dengan memanaskannya. Pemanasan juga

dapat menyebabkan terbentuknya aerosol. Untuk pewarnaan lain:

o Pengeringan dengan pemanasan dapat dilakukan

Setelah kering, fiksasi apusan dengan memanaskannya menggunakan api biru pembakar Bunsen. Dengan forceps (pinset), lewatkan slide pada api dengan cepat sebanyak 3 kali. Pastikan apusan menghadap ke atas (tidak terkena api secara langsung). Fiksasi pemanasan ini memastikan sputum akan menempel pada slide kaca. Pemanasan ini harus dilakukan dengan tepat, karena pemanasan yang berlebihan dapat merusak struktur bakteri, sedangkan pemanasan yang kurang akan menyebabkan fiksasi yang kurang, sehingga

beberapa bagian sputum akan terbilas selama pewarnaan. Pemanasan yang tidak tepat (berlebihan maupun kurang) akan memberikan hasil negatif palsu.

Pewarnaan yang biasa dilakukan, di antaranya

1) Pewarnaan gram

Untuk memeriksa mikroorganisme pada sputum secara mikroskopis Untuk mengevaluasi baik tidaknya spesimen, serta memastikan spesimen adalah

sputum dan bukan saliva Kualitas pewarnaan gram sputum yang baik, yaitu:

o PMN > 25 (pembesaran 40x10) o Tidak terdapat sel epitel Ditemukan satu jenis mikroorganisme

Sputum dikatakan terkontaminasi dengan flora normal mulut, jika: o Sel epitel > 25 (pembesaran 40x10) o Polymorphonuclear (PMN) < 10 (pembesaran 40x10) o Ditemukan beragam jenis mikroorganisme o PMN < 10 per 1 sel epitel

Berikut ini adalah contoh pewarnaan gram sputum yang tidak dapat diterima. (gak tau deh kenapa??? Maaf y)

2) Pewarnaan tahan asam (acid-fast staining/Ziehl Neelsen staining)

Reagen standar yang digunakan untuk pewarnaan tahan asam, yaitu: o 0.3% Carbol fuchsin (primary stain/warna primer/warna utama) o 3% Asam alcohol/HCl Alcolhol (larutan yang menghilangkan

warna/decolorizing solution) o 0.3% Methylene blue (counter stain/warna sekunder)

Hasil pewarnaan dikatakan basil tahan asam (BTA) negatif jika tidak ditemukan organisme pada 100 lapang pandang.

Hasil pewarnaan dikatakan BTA positif jika ditemukan minimal 1 BTA pada 100 lapang pandang. Jumlah BTA yang ditemukan dapat mewakili derajat infeksi maupun keparahan penyakit, sehingga jumlah BTA yang ditemukan harus dikuantisasi sebagai berikut. o Lebih dari 10 BTA pada setiap lapangan di dalam 20 lapangan (+++) o 1-10 BTA pada setiap lapangan di dalam 50 lapangan (++) o 10-99 BTA pada 100 lapangan (+) o 1-9 BTA pada 100 lapangan tulis jumlah BTA yang ditemukan (ulangi

pemeriksaan dengan spesimen baru) Hasil pewarnaan ini tidak boleh dilaporkan sebagai M. tuberculosis, tetapi

hanya dapat dilaporkan sebagai basil tahan asam. Positif palsu dapat terjadi jika:

o Salah dalam menangani spesimen (baik pengambilan maupun penyimpanan) atau menyimpan informasi

o Penggunaan ulang kontainer maupun slide yang BTA positif o Fuchsin tidak terbilas dengan baik o Terkontaminasi minyak imersi o Dekolorisasi tidak adekuat

Negatif palsu dapat terjadi jika: o Salah dalam menangani spesimen (baik pengambilan maupun penyimpanan)

atau menyimpan informasi

o Kualitas sputum kurang baik o Dekolorisasi berlebihan o Pembacaan kurang dari 100 lapang pandang

Selain Mycobacterium, pathogen lain yang dapat menyebabkan penyakit pada saluran pernapasan, yaitu:

A. Streptococcus

Berdasarkan aktivitas hemolitiknya, Streptococcus diklasifikasikan menjadi: 1) Streptococcus alpha-haemolyticus

Koloni Streptococcus spesies ini dikelilingi oleh area hemolysis parsial yang berwarna coklat kehijauan. Warna tersebut berasal dari hemoglobin tereduksi

Sangat umum terdapat dalam saluran pernapasan sebagai flora normal Terdapat dua spesies, yaitu:

o S. viridians (kiri) Tidak terjadi inhibisi pada Optochin disk o Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus) (kanan) sensitif terhadap

optochin (ethyl hydrocupreine), sehingga zona inhibisi akan terbentuk di sekitar disk di mana bakteri mengalami lisis. Zona ini biasanya berukuran > 14mm.

Hasil Tes Quellung yang positif, berupa pembengkakan kapsul, dengan menggunakan precipitins antikapsul menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah Streptococcus pneumonia. Reaksi antibodi dengan polisakarida pada kapsul akan memperbesar kapsul tersebut.

Optochin disk

Zona inhibisi

2) Streptococcus beta-hemolyticus Koloni dikelilingi oleh zona hemolysis sempurna dengan hemoglobin yang transparan

Dikenal sebagai S. pyogenes (kiri), merupakan Streptococcus yang sensitif terhadap bacitrasin disk. Zona inhibisi akan terbentuk di sekitar disk.

Bacitracin disk

Zona inhibisi

Non-pyogenes

3) Streptococcus gamma-haemolyticus (non-hemolitik) Koloni tidak menunjukkan sifat hemolitik dari alpha maupun beta-hemolyticus.

Meskipun demikian, mungkin akan terlihat sedikit perubahan warna pada medium.

Selain berdasarkan aktivitas hemolitiknya, Streptococcus juga dapat diklasifikasikan berdasarkan aktivitas antigennya. Klasifikasi ini disebut dengan klasifikasi Lancefield. Klasifikasi tersebut dilakukan dengan uji aglutinasi dengan memanfaatkan antigen permukaannya (berupa karbohidrat), dan mengelompokkan Streptococcus menjadi grup A sampai O. Salah satu Streptococcus grup A adalah Streptococcus pyogenes.

B. Staphylococcus 1) Staphylococcus aureus

Terdapat di dalam hidung pada 40% atau lebih orang yang sehat Berwarna kuning sampai krem, atau kadang-kadang putih, pada agar darah Berupa coccus gram positif dengan ukuran yang seragam, biasanya berkelompok,

tetapi dapat juga soliter

2) Staphylococcus epidermidis Koloni biasanya non-hemolytik

Untuk membedakan Staphylococcus aureus dengan Staphylococcus epidermidis, dapat digunakan Mannitol Salt Agar (MSA). MSA merupakan agar nutrien yang selektif dan dapat menjadi indikator keasaman, karena mengandung 1% mannitol, 7.5% NaCl, dan

0.0025% phenol merah yang merupakan indikator asam-basa. Hampir seluruh S. aureus akan memfermentasikan mannitol, sehingga akan menyebabkan daerah di sekeliling koloni menjadi asam. Asam tersebut akan mengubah warna phenol merah menjadi kuning. Sementara itu, spesies Staphylococcus yang lain gagal memfermentasikan mannitol, sehingga membentuk koloni dengan zona yang tetap berwarna merah atau ungu.

Selain MSA, uji koagulase juga dapat membedakan kedua spesies Staphylococcus tersebut. S. aureus merupakan strain yang memproduksi koagulase, sehingga akan membentuk gumpalan (clot) ketika ditumbuhkan dalam plasma. Koagulase yang bebas akan mengubah plasma menjadi bentuk gel, sedangkan koagulase yang terikat pada bakteri (faktor clumping/penggumpal) akan menyatukan bakteri yang satu dengan bakteri lainnya. Satu-satunya Staphylococcus non-aureus yang memproduksi koagulase adalah parasit binatang, yaitu S. intermedius dan S. hyicus yang jarang ditemukan pada manusia. Selain itu, S. aures yang gagal memproduksi koagulase sangat jarang ditemukan. Oleh karena itu, uji koagulase ini merupakan uji yang paling baik untuk mengidentifikasi spesies Staphylococcus aureus.

A. Koagulase positif S.aureus

B. Koagulase negatif S.epidermidis

C. Kontrol

C. Haemophilus

Haemophilus tumbuh sebagai satelit di sekitar lapisan (streak) S.aureus. Secara mikroskopis, bakteri ini berukuran kecil, non-motil, berbentuk batang gram negatif atau coccobasil, atau berbentuk seperti benang panjang (long thread-like form) jika berasal dari cairan serebrospinal.

Salah satu spesies Haemophilus adalah H.influenzae. H.influenzae tumbuh dengan adanya kedua faktor X dan V, sementara Haemophilus spesies lain dapat tumbuh dengan adanya faktor X saja maupun faktor V saja pada agar nutrient.

Faktor X atau hemin dihasilkan oleh eritrosit yang lisis di sekitar lapisan Staphylococcus, sementara Staphylococcus sendiri menghasilkan faktor V NAD (Nikotinamida Adenin Dinukleotida). Kedua faktor tersebut memungkinkan koloni Haemophilus yang kecil dan tipis untuk tumbuh di sekitar lapisan Staphylococcus. Tes

Satellite growth of Haemophilus

Streak of S. aureus

dengan menggunakan lapisan S. aureus ini merupakan identifikasi presumptive adanya Haemophilus, tetapi tidak dapat menentukan spesiesnya. Penentuan spesies Haemophilus influenza dapat dilakukan dengan uji ketergantungan pertumbuhan terhadap kedua faktor X dan V. Tes tersebut biasanya dilakukan pada pada agar nutrient yang tidak mengandung kedua faktor X dan V, tetapi diberikan paper disk yang mengandung faktor X saja, faktor V saja, dan faktor X sekaligus V. H. influenza hanya akan tumbuh di sekitar paper disk yang mengandung kedua faktor sekaligus.

D. Klebsiella pneumonia

Klebsiella menghasilkan koloni mukoid yang besar ketika dikultur pada agar darah.

Faktor Y saja

Faktor X saja

Faktor X dan Y

Koloni H. influenza

Gambar kiri: Batang gram negatif. Gambar kanan: batang gram negatif berkapsul (khas untuk Klebsiella pneumonia)

Daftar Pustaka

1. Retno Kadarsih S. Introduction to microbiology laboratory practice: respiratory tract infection. Slide kuliah pengantar praktikum mikrobiologi; 2011.

2. Penjelasan dosen.

Oleh : Ade Ilyas Mukmin