微生物試験とリアルタイムモニタリング
大阪大学大学院 薬学研究科遺伝情報解析学分野(衛生化学)
山口 進康,那須 正夫
培地の種類が変われば結果が変わる...
細菌
数(lo
g ce
lls /
100
ml)
R2ASCDB SCDA1
2
3
4
試料:医薬品製造用水(イオン交換水); 30℃で2週間培養
Kawai, et al. Appl. Environ. Microbiol., 68: 699 (2002)
R2A Bradyrhizobium sp. 23/48 (48%)
SCDA Xanthomonas sp. 36/46 (78%)
Stenotrophomonas sp. 39/46 (85%)SCDB
培地 優占種 検出率
16S rRNA遺伝子の部分配列を(position 933-1387)を解析
検出種
5
4
8
Kawai, et al. Appl. Environ. Microbiol., 68: 699 (2002)
培地の種類が変われば結果が変わる...
試料:医薬品製造用水(イオン交換水);30℃で2週間培養後、コロニーを分離
環境中の細菌検出における培養法の課題
①水環境中の細菌の多くは,一般的な条件下ではコロニーを形成しにくい
②培養条件により,増殖可能な細菌種が変化
↓
培養法のみでは細菌モニタリングは不十分
培養操作に依存することなく,
細菌をいかにしてとらえるのか?
↓
細菌:「遺伝子情報および生理活性をもつ粒子」
↓
細胞内成分や遺伝子(核酸)を指標として可視化
直接計数法による細菌の現存量測定
全菌数(総菌数)の測定
酵素活性をもつ細菌数の測定
分裂・増殖する細菌数の測定
蛍光染色法による細菌数の迅速測定
染色(3分)
ろ過により細菌をフィルター上に捕集
観察
試料:医薬品製造用水(イオン交換水);DAPIで染色
FITC
Rhodamine 123
Acridine orangeChromomycin A3DAPIHoechst 33258Ethidium bromidePropidium iodideSYTOX GreenSYBR Green I
CFDACalcein-AMCTC
TRITCTexas RedCy3Cy5
490
507
490450358352545530502497
495490488
542568550649
520
529
526, 650570461461605615523520
520515602
572610570670
タンパク質(α-アミノ基)
細胞膜
一・二本鎖核酸G-C領域A-T領域A-T領域二本鎖核酸二本鎖核酸DNADNA
esteraseesterase呼吸
細胞内タンパクの定量,蛍光抗体の標識
細胞膜の活性評価
核酸染色,RNA/DNA比測定DNA定量DNA定量DNA定量DNA定量,死細胞検出DNA定量,死細胞検出DNA定量,死細胞検出DNA定量,ウイルスの計数
生細胞の検出生細胞の検出生細胞の検出
FISH用プローブの標識FISH用プローブの標識FISH用プローブの標識FISH用プローブの標識
蛍光染色剤励起(nm)
蛍光(nm) 主な用途染色対象
微生物検出に利用される蛍光染色剤
エステラーゼ活性をもつ細菌全細菌
DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindoleCFDA: 6-carboxyfluorescein diacetate
試料:ナチュラルミネラルウォーター
Blue excitationUV excitation青色励起UV励起
蛍光活性染色法による生きている細菌と死菌の区別
培地上に静置
フィルター上に捕集
蛍光染色
観察・計数
マイクロコロニー法
増殖能を指標とした微生物の迅速計数法
0
1
2
3
4
5
6
7
医薬品製造用水(イオン交換水)中の細菌数
全菌数(DAPI,3分間染色)
細菌
数(lo
g ce
lls /
100
ml) 酵素活性をもつ細菌数
(CFDA,3分間染色)
呼吸能をもつ細菌数(CTC,30分間染色)
マイクロコロニー形成細菌数(R2A培地,24時間静置)
コロニー形成細菌数(1/100 SCD培地,3日間培養)
*SCD培地ではコロニーを検出できず
Kawai, et al. J. Appl. Microbiol., 86: 496 (1999)
25 mm
50 m
m
sheathsheath
waste
sampledye
混合部
検出部
On-chip染色・計数用マイクロ流路デバイス
材質
デバイス:polydimethylsiloxane (PDMS)カバー:ガラス
流路
幅: 100 µm(検出部)
500 µm (混合部)
深さ:20 µm
On-chip染色・計数用マイクロ流路システムによる飲用水中の細菌の検出
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
1 2
6
0
5
4
3
2
1
■ 蛍光顕微鏡
■ マイクロ流路システム
7
研究室内の水道水 湧水
細菌
数(lo
g 10 ce
lls/m
l)
蛍光染色:DAPI