微生物試験とリアルタイムモニタリング

大阪大学大学院 薬学研究科遺伝情報解析学分野（衛生化学）

山口 進康，那須 正夫

培地の種類が変われば結果が変わる．．．

細菌

数(lo

g ce

lls /

100

ml)

R2ASCDB SCDA1

2

3

4

試料：医薬品製造用水（イオン交換水）； 30℃で２週間培養

Kawai, et al. Appl. Environ. Microbiol., 68: 699 (2002)

R2A Bradyrhizobium sp. 23/48 (48%)

SCDA Xanthomonas sp. 36/46 (78%)

Stenotrophomonas sp. 39/46 (85%)SCDB

培地 優占種 検出率

16S rRNA遺伝子の部分配列を（position 933-1387）を解析

検出種

5

4

8

Kawai, et al. Appl. Environ. Microbiol., 68: 699 (2002)

培地の種類が変われば結果が変わる．．．

試料：医薬品製造用水（イオン交換水）；30℃で２週間培養後、コロニーを分離

環境中の細菌検出における培養法の課題

①水環境中の細菌の多くは，一般的な条件下ではコロニーを形成しにくい

②培養条件により，増殖可能な細菌種が変化

↓

培養法のみでは細菌モニタリングは不十分

培養操作に依存することなく，

細菌をいかにしてとらえるのか？

↓

細菌：「遺伝子情報および生理活性をもつ粒子」

↓

細胞内成分や遺伝子（核酸）を指標として可視化

直接計数法による細菌の現存量測定

全菌数（総菌数）の測定

酵素活性をもつ細菌数の測定

分裂・増殖する細菌数の測定

蛍光染色法による細菌数の迅速測定

染色（3分）

ろ過により細菌をフィルター上に捕集

観察

試料：医薬品製造用水（イオン交換水）；DAPIで染色

FITC

Rhodamine 123

Acridine orangeChromomycin A3DAPIHoechst 33258Ethidium bromidePropidium iodideSYTOX GreenSYBR Green I

CFDACalcein-AMCTC

TRITCTexas RedCy3Cy5

490

507

490450358352545530502497

495490488

542568550649

520

529

526, 650570461461605615523520

520515602

572610570670

タンパク質（α-アミノ基）

細胞膜

一・二本鎖核酸G-C領域A-T領域A-T領域二本鎖核酸二本鎖核酸DNADNA

esteraseesterase呼吸

細胞内タンパクの定量，蛍光抗体の標識

細胞膜の活性評価

核酸染色，RNA/DNA比測定DNA定量DNA定量DNA定量DNA定量，死細胞検出DNA定量，死細胞検出DNA定量，死細胞検出DNA定量，ウイルスの計数

生細胞の検出生細胞の検出生細胞の検出

FISH用プローブの標識FISH用プローブの標識FISH用プローブの標識FISH用プローブの標識

蛍光染色剤励起(nm)

蛍光(nm) 主な用途染色対象

微生物検出に利用される蛍光染色剤

エステラーゼ活性をもつ細菌全細菌

DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindoleCFDA: 6-carboxyfluorescein diacetate

試料：ナチュラルミネラルウォーター

Blue excitationUV excitation青色励起UV励起

蛍光活性染色法による生きている細菌と死菌の区別

培地上に静置

フィルター上に捕集

蛍光染色

観察・計数

マイクロコロニー法

増殖能を指標とした微生物の迅速計数法

0

1

2

3

4

5

6

7

医薬品製造用水（イオン交換水）中の細菌数

全菌数（DAPI，3分間染色）

細菌

数(lo

g ce

lls /

100

ml) 酵素活性をもつ細菌数

（CFDA，3分間染色）

呼吸能をもつ細菌数（CTC，30分間染色）

マイクロコロニー形成細菌数（R2A培地，24時間静置）

コロニー形成細菌数（1/100 SCD培地，3日間培養）

＊SCD培地ではコロニーを検出できず

Kawai, et al. J. Appl. Microbiol., 86: 496 (1999)

25 mm

50 m

m

sheathsheath

waste

sampledye

混合部

検出部

On-chip染色・計数用マイクロ流路デバイス

材質

デバイス：polydimethylsiloxane (PDMS)カバー：ガラス

流路

幅： 100 µm（検出部）

500 µm （混合部）

深さ：20 µm

On-chip染色・計数用マイクロ流路システムによる飲用水中の細菌の検出

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

10000000

1 2

6

0

5

4

3

2

1

■ 蛍光顕微鏡

■ マイクロ流路システム

7

研究室内の水道水 湧水

細菌

数(lo

g 10 ce

lls/m

l)

蛍光染色：DAPI