unud-320-1860003455-tesisgabung

7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung

1/78

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek

yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang

cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki

keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan

(Shitandi et al.,2007; Dommels et al.,2009; Weichselbaum, 2009).

Probiotik umumnya dari golongan bakteri asam laktat (BAL), khususnya

genus Lactobacillus dan Bifidobacterium yang merupakan bagian dari flora

normal pada saluran pencernaan manusia (Sujaya et al. 2008b). Lactobacillus

merupakan probiotik yang dapat memberikan efek yang menguntungkan bagi

kesehatan seperti penanggulangan diare (Salazar et al.,2007; Pant et al.,2007 ;

Tabbers dan Benninga, 2007; Collado et al., 2009 ), menstimulasi sistem

kekebalan (immune) tubuh (Isolauri et al.,2001 ; Isolauri dan Salminen, 2008),

menurunkan kadar kolesterol (Pereira et al.,2003; Yulinery et al., 2006; Belviso

et al.,2009; Lee et al.,2010), pencegahan kanker kolon dan usus (Brady et al.,

2000; Pato, 2003; Liong, 2008), dan penanggulangan dermatitis atopik pada anak-

anak (Betsi et al.,2008; Torii et al.,2010).

Menurut Food and Agriculture Organization/World Health Organization

(FAO/WHO) (2001), idealnya strain probiotik seharusnya tidak hanya mampu

bertahan melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk


2/78

2

berkembang biak dalam saluran pencernaan, tahan terhadap cairan lambung dan

cairan empedu dalam jalur makanan yang memungkinkan untuk bertahan hidup

melintasi saluran pencernaan dan terkena paparan empedu. Selain itu probiotik

juga harus mampu menempel pada sel epitel usus manusia, mampu membentuk

kolonisasi pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan zat anti mikroba

(bakteriosin), dan memberikan pengaruh yang menguntungkan kesehatan

manusia. Syarat lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi.

Strain probiotik juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan

makanan dan penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan

tahan terhadap proses psikokimia pada makanan (Prado et al.,2008).

Lactobacillus rhamnosus SKG34 yang diisolasi dari susu kuda Sumbawa

sangat berpotensi dikembangkan sebagai probiotik. Lactobacillus rhamnosus

SKG34 memiliki daya hambat yang besar terhadap pertumbuhan bakteri patogen.

(Sujaya et al. 2008b). Uji in vitro L. rhamnosus SKG34 mampu melewati

simulasi kondisi lambung dengan pH 3 dan 4, tidak mengubah asam kolat primer

(kolat) menjadi asam kolat skunder (deoksikolat), serta dapat menghidrolisis

garam empedu (Sujaya et al.,2008a).

Pengujian secara in vivo terhadap L. rhamnosus SKG34 perlu dilakukan

untuk menindaklanjuti hasil penelitian secara in vitro yang sudah dilaksanakan,

untuk mengetahui populasi L. rhamnosus SKG34 pada sekum dan pengaruhnya

terhadap kadar kolesterol serum darah dengan menggunakan hewan coba tikus

tutih (R. norvegicus), sebelum L. rhamnosus SKG34 dikembangkan dan

dikomersialkan sebagai probiotik.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130


3/78

3

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah yang diangkat dalam penelitian ini adalah :

1. Bagaimanakah populasiL. rhamnosus SKG34 pada sekum tikus putih (R.

norvegicus)

2. Bagaimanakah pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 terhadap kadar

kolesterol serum darah tikus putih (R. norvegicus)

1.3Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

1. Untuk mengetahui populasi L. rhamnosus SKG34 pada sekum tikus putih

(R. norvegicus)

2. Untuk mengetahui pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 terhadap

kadar kolesterol darah tikus putih (R. norvegicus)

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah :

1. Memberikan informasi tentang populasi L. rhamnosus SKG34 pada

sekum tikus putih (R. norvegicus)

2. Memberikan informasi pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34

terhadap kadar kolesterol pada darah tikus putih (R. norvegicus)


4/78

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Probiotik

Lilly dan Stillwell memperkenalkan istilah "probiotik" pada tahun 1965

untuk nama bahan yang dihasilkan oleh mikroba yang mendorong pertumbuhan

mikroba lain (FAO/WHO, 2001). Probiotik merupakan organisme hidup yang

mampu memberikan efek yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila

dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002;

ISAPP, 2009) dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora intestinal pada saat

masuk dalam saluran pencernaan (Shitandi et al.,2007; Dommels et al.,2009;

Weichselbaum, 2009).

Probiotik telah banyak dimanfaatkan untuk penanggulangan penyakit

gastroenteritis seperti diare (Salazar et al.,2007; Pant et al.,2007 ; Tabbers dan

Benninga, 2007; Collado et al.,2009 ), menstimulasi sistem kekebalan (immune)

tubuh (Isolauri et al., 2001 ; Isolauri dan Salminen, 2008), menurunkan kadar

kolesterol (Pereira et al.,2003; Yulinery et al., 2006; Belviso et al.,2009; Lee et

al.,2010), pencegahan kanker kolon dan usus (Brady et al.,2000; Pato, 2003;

Liong, 2008), penanggulangan dermatitis atopik pada anak-anak (Betsi et al.,

2008; Torii et al., 2010), menanggulangi penyakit irritable bowel syndrome

(Malinen et al.,2010; Lyra et al.,2010), penatalaksanaan alergi (Vanderhoof,

2008), pencegahan dan penanganan penyakit infeksi (Wolvers et al., 2010).

Probiotik dapat memproduksi bakteriosin untuk melawan pathogen yang

bersifat selektif hanya terhadap beberapa strain patogen. Probiotik juga


5/78

5

memproduksi asam laktat, asam asetat, hidrogen peroksida, laktoperoksidase,

lipopolisakarida, dan beberapa antimikrobial lainnya. Probiotik juga

menghasilkan sejumlah nutrisi penting dalam sistem imun dan metabolisme host,

seperti vitamin B (Asam Pantotenat), pyridoksin, niasin, asam folat, kobalamin,

dan biotin serta antioksidan penting seperti vitamin K (Adams, 2009).

Manfaat probiotik bagi kesehatan tubuh dapat melalui 3 (tiga) mekanisme

fungsi: (1) fungsi protektif, yaitu kemampuannya untuk menghambat patogen

dalam saluran pencernaan. Terbentuknya kolonisasi probiotik dalam saluran

pencernaan, mengakibatkan kompetisi nutrisi dan lokasi adhesi (penempelan)

antara probiotik dan bakteri lain, khususnya patogen. Pertumbuhan probiotik juga

akan menghasilkan berbagai komponen anti bakteri (asam organik, hidrogen

peroksida, dan bakteriosin yang mampu menekan pertumbuhan patogen)

(Rahayu, 2008; Collado et al.,2009) ; (2) fungsi sistem imun tubuh, yaitu dengan

peningkatan sistem imun tubuh melalui kemampuan probiotik untuk menginduksi

pembentukan IgA, aktivasi makrofag, modulasi profil sitokin, serta menginduksi

hyporesponsiveness terhadap antigen yang berasal dari pangan.; (3) fungsi

metabolit probiotik yaitu metabolit yang dihasilkan oleh probiotik, termasuk

kemampuan probiotik mendegradasi laktosa di dalam produk susu terfermentasi

sehingga dapat dimanfaatkan oleh penderita lactose intolerance(Rahayu, 2008).

Efek probiotik terhadap kesehatan dan mekanismenya dalam tubuh

disajikan pada Tabel 2.1.


6/78

6

Tabel 2.1.

Efek probiotik terhadap kesehatan dan mekanismenya dalam tubuh

Manfaat Fungsi Mekanismenya

1.Membantupencer-naan

a.Irritable bowel syndrome,mengurangigejala saluran cerna (konstipasi, diarenon patogenik, flatulensi, kram, nafasyang berbau penyebab dari gangguanpencernaan)

b. Intoleran terhadap laktosa

- Perubahan populasi atau aktivitasdari mikroflora usus

- Pemindahan mikroba laktase ke

usus halus2. Sebagai

pertahanantubuh

a. Alergi (eksema atopik, alergi terhadap

susu, rematik artritis)

- Translokasi, efek barrier

b. Kariogenik - Perubahan populasi, aktivitasmikroflora oral atau yangmenempel pada gigi

c.Karsinogenik, mutagenik, tumor - Penyerapan mutagen, merangsang

sistem imun, penghambatanproduksi karsinogen olehmikroflora usus

d. Diare karena penggunaan antibiotika,diare yang disebabkan olehRotavirus, Kolitis yang disebabkanoleh C. difficile, diare nosokomial

- Kompetisi pengeluaran,translokasi/efek barrier,meningkatkan respon imun

e. Peradangan usus, Kolitis ulserasi,Penyakit Crohns

- Penurunan regulasi respon imun

f. Pertumbuhan bakteri usus yangberlebihan

- Aktivitas antimikroba,pengeluaran kompetisi

g. Imunomodulasi (status imun, responvaksin)

h. Vaginosis, infeksi saluran kemih

- Interaksi dengan sel imun untukmeningkatkan aktivitas pagositosisdari sel darah putih, meningkatkanIgA setelah kontak dengan antigen.Meningkatkan proliferasi lekositintra epitel, regulasi Th1/Th2,induksi sitosis sitokin

- Aktivitas antipatogenik,pengeluran kompetisi3. Manfaatyang lain

a. Menurunkan kolesterol darah - Dekonjugasi garam empedu

b. Endotoksemia dengan sirosis - Penghambatan produksiendotoksin oleh mikroflora usus

c. Hipertensi - Unsur seluler atau peptida yangberasal dari aktivitas fermentasisebagai penghambatan ACE(Angiotensin Converting Enzyme)

d. Batu ginjal - Perubahan pencernaan yangmempengaruhi pemecahan oksalat

Sumber : Sanders (2003) dalamToma dan Pokrotnieks (2006)


7/78

7

Konsumsi probiotik biasanya diaplikasikan pada pembuatan produk

pangan olahan seperti; yogurt, keju, minuman penyegar, es krim, yakult, permen

dan yogurt beku (Senok, 2009; Granato et al., 2010). Jumlah minimal strain

probiotik yang ada dalam produk makanan adalah sebesar 106CFU/g atau jumlah

strain probiotik yang harus dikonsumsi setiap hari sekitar 108 CFU/g, dengan

tujuan untuk mengimbangi kemungkinan penurunan jumlah bakteri probiotik pada

saat berada dalam jalur pencernaan (Shah, 2007).

Beberapa jenis bakteri probiotik yang sering digunakan dalam industri

makanan seperti : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus

johnsonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus

reuteri, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum,

Bifidobacterium longum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis,

Bifidobacterium animalis (Granato et al., 2010), Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium, Sporolactobacillus inulinus (Holzapfel dan Schillinger,

2002),Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, dan Streptococcus

thermophilus (Senok, 2009). Mikroba yang sering digunakan sebagai probiotik

dapat dilihat pada Tabel 2.2.

Aspek keamanan dan fungsional menjadi pertimbangan utama dalam

proses seleksi mikroba probiotik. Aspek keamanan seperti : menyehatkan saluran

pencernaan), bersifat non patogen, dan tahan terhadap antibiotik. Aspek

fungsional seperti kemampuan hidup dan tahan dalam saluran pencernaan,dapat

diaplikasikan pada dunia industri, dan tidak menimbulkan aroma yang

menyimpang pada makanan (Saarela et al.,2000; Prodo et al., 2008).
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b149http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b149


8/78

8

Tabel 2.1.

Mikroba yang sering digunakan sebagai Probiotik

BALSelain spesies

BALLactobacillus Bifidobacterium Spesies BAL yang

lain

Lactobacillus

acidophilus

Bifidobacterium

adolescentis

Enterococcus

faecalis

Bacillus cereus

var. toyoi

Lactobacillus

casei

Bifidobacterium

animalis

Enterococcus

faecium

Escherichia coli

strain nissle

Lactobacillus

amylovorus

Bifidobacterium

bifidum

Lactococcus lactis Propionibacterium

freudenreichii

Lactobacillus

delbrueckii subsp

bulgaricus

Bifidobacterium

breve

Leuconostoc

mesenteroides

Saccharomyces

cerevisiae

Lactobacillus

gallinarum

Bifidobacterium

infantis

Pediococcus

acidilactici

Saccharomyces

boulardii

Lactobacillus

gasseri

Bifidobacterium

lactis

Steptococcus

thermophilus

Lactobacillus

johnsonii

Bifidobacterium

longum

Sporolactobacillus

inulinus

Lactobacillus

paracasei

Lactobacillus

plantarum

Lactobacillusreuteri

Lactobacillus

rhamnosusSumber : Holzapfel et al. (2001).

Menurut Food and Agriculture Organization/World Health Organization

(FAO/WHO) (2001), mikroba probiotik, seharusnya tidak hanya mampu

bertahan melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk


9/78

9

berkembang biak dalam usus. Ini berarti mikroba probiotik harus tahan terhadap

cairan lambung dan dapat tumbuh dalam cairan empedu yang terdapat dalam

saluran pencernaan, atau dikonsumsi dalam jalur makanan yang memungkinkan

untuk bertahan hidup melintasi saluran pencernaan dan terkena paparan empedu.

Selain itu probiotik juga harus mampu menempel pada permukaan enterosit,

mampu membentuk kolonisasi pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan

zat anti mikroba (bakteriosin), dapat berkembang biak dengan baik, dan

memberikan pengaruh yang menguntungkan kesehatan manusia. Hal yang penting

lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi. Strain probiotik

juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan makanan dan

penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan tahan terhadap

proses psikokimia pada makanan (Prado et al.,2008).

2.2 Kolesterol

Kolesterol merupakan produk khas hasil metabolisme hewan. Oleh karena

itu kolesterol terdapat dalam makanan yang berasal dari hewan seperti kuning

telur, daging, hati, dan otak (Murray et al., 2003). Kolesterol banyak terdapat

pada membran sel. Kolesterol berwarna putih dan bersifat larut dalam air

(Hofmann, 2004). Kolesterol merupakan prekursor senyawa steroid lainnya

dalam tubuh, seperti: kortikosteroid, hormon seks, asam empedu dan vitamin D

(Murray et al., 2003), hormon adrenokortikoid, progesteron, esterogen, dan

testosteron (Hirakawa, 2005).

Sebagian besar kolesterol dibentuk di hati, walaupun semua sel mampu

memproduksi kolesterol (Hirakawa, 2005). Hati mensintesis sekitar 20 %


10/78

10

kolesterol dalam tubuh. Total produksi kolesterol termasuk yang diserap dari

makanan dan hasil sintesa dalam tubuh kira-kira 1 g/hari. Jumlah kolesterol yang

direkomendasikan sekitar 300 mg/hari. (Gropper et al., 2005). Orang dewasa

normal, mensintesa kolesterol sekitar 1g/hari, dan mengkonsumsinya sekitar 0,3

g/hari. Kadar kolesterol dalam tubuh sekitar 150-200 mg/dl, yang digunakan

untuk mengatur sintesa de novo. Kecepatan sintesa kolesterol tergantung pada

intake kolesterol dari makanan (King, 2010).

Kolesterol dalam makanan diserap dari usus bersama lipid lainnya,

termasuk kolesterol yang disintesis dalam usus, diinkorporasikan ke dalam

kilomikron dan Very Low Density Lipoprotein (VLDL). Sebanyak 80-90%

kolesterol yang diserap, diesterifikasikan dengan asam lemak rantai panjang

dalam getah bening (Murray et al., 2003). Potter (2007) menyatakan bahwa

kolesterol dari makanan sebesar 335 mg/hari masuk ke saluran pencernaan dalam

bentuk kilomikron. Selanjutnya masuk ke hati dan mengalami sintesa sebanyak

800 mg/hari. Kilomikron yang masuk ke hati disintesa menjadi HDL dan VLDL.

Very Low Density Lipoprotein selanjutnya diubah menjadi LDL, dan bersama

dengan HDL masuk ke jaringan periperal, kulit, dan kelenjar endokrin. Diagram

peredaran kolesterol dalam tubuh disajikan pada Gambar 2.1.


11/78

11

KOLESTEROL

Gambar 2.1. Peredaran kolesterol dalam tubuh (Potter, 2007).

Kolesterol dalam tubuh diserap dalam bentuk asam kolat di hati yang

dikonjugasikan dengan bahan lain membentuk garam empedu. Garam empedu

membantu pencernaan dan penyerapan lemak (Hofmann, 2004; Hirakawa, 2005).

Kolesterol dari makanan dan hasil sintesa digunakan dalam pembentukan

membran dan sintesa hormon steroid dan asam empedu. Sebagaian besar jumlah

kolesterol digunakan dalam proses sintesis asam empedu (King, 2010).

Berdasarkan kerapatannya (densitas), kolesterol dapat di bedakan menjadi:

kilomikron, Very Low Density Lipoprotein (VLDL), Low Density Lipoprotein

(LDL),High Density Lipoprotein(HDL). Dari keempat jenis lipoprotein tersebut,

LDL memiliki kadar kolesterol yang paling tinggi, sedangkan kadar protein

Saluran

Pencernaan

Sterol Kulit

(85mg/hari)

HormonSteroid

(50mg/hari)

Kelenjar

Endokrin

Kulit

Asam

Empedu

(400mg/hari)

Feses

Makanan

Jaringan

Periperal

Hati

Sintesa

Kolesterol

(800mg/hari)

Kilomikron

LDL

VLDL

HDL

Kolesterol

makanan

(335mg/hari

Kolesterol

Empedu

(600mg/har


12/78

12

tertinggi terdapat pada HDL (Gropper et al.,2005; Hirakawa, 2005). Selain itu

ada juga Intermediate Density Lipoprotein (IDL), yang memiliki densitas antara

VLDL dan LDL. Kilomikron merupakan lipoprotein pertama yang dibentuk dari

konsumsi lemak. Selain kilomikron, lipoprotein lainnya merupakan hasil sintesa

lemak dalam tubuh (Gropper et al.,2005).

Kolesterol diedarkan ke seluruh sel oleh LDL dan HDL (Hirakawa, 2005).

Low Density Lipoprotein merupakan komponen lipoprotein yang terbesar

membawa kolesterol (60% total serum kolesterol), ke jaringan tubuh, yang

digunakan untuk pembentukan membran atau dimetabolisme menjadi hormon

steroid. High Density Lipoprotein memiliki peran yang bertentangan dengan

LDL, yaitu mengangkut kolesterol dan lipoprotein lainnya yang sudah

terakumulasi dari sel dan mengembalikan kolesterol ke hati untuk selanjutnya

diekskresikan dalam empedu (Gropper et al.,2005).

Jumlah LDL yang berlebihan dapat menyebabkan penyumbatan arteri dan

meningkatkan resiko penyakit jantung dan stroke. Sebaliknya konsentrasi HDL

yang tinggi dalam darah dapat menurunkan resiko penyakit jantung. Penyakit

jantung koroner dan stroke merupakan penyebab utama kematian dan kejadian

cacat di seluruh dunia. Tingginya kandungan total kolesterol darah sangat

berhubungan dengan peningkatan resiko penyakit jantung koroner. Kadar LDL

diatas 100 mg/dl dan kadar HDL dibawah 40 mg/dl dapat meningkatkan resiko

penyakit kardiovaskular (Hirakawa, 2005; Baigent dan Clarke, 2008).

Beberapa strain BAL mampu memetabolisme kolesterol dari makanan

dalam usus halus sehingga tidak diserap oleh tubuh. Lactobacillus sp F2.13,


13/78

13

strain endogen Indonesia mampu menurunkan kadar kolesterol total sebesar 33%

(Nursini, 2010). Bifidobacterium infantis 17930, memiliki kemampuan

dekonjugasi garam empedu paling tinggi dan aktivitas Bile salt hydrolase (BSH)

lebih baik (Liong dan Shah, 2005).

Mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan oleh

enzim BSH yang mendekonjugasi garam empedu, dimana glisin atau taurin

dipisahkan dari steroid, sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau

terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan garam empedu terdekonjugasi dalam

bentuk asam kolat bebas yang kurang diserap oleh usus halus. Dengan demikian

garam empedu yang kembali ke hati selama sirkulasi enterohepatik menjadi

berkurang, sehingga total kolesterol dalam tubuh menjadi berkurang. Beberapa

jenis BAL memiliki dinding sel yang mampu mengikat kolesterol dalam usus

halus sebelum kolesterol diserap oleh tubuh (Surono, 2004; Ooi dan Liong, 2010).

Enzim BSH akan memberikan keuntungan khusus bagi strain bakteri

probiotik yang tumbuh pada lingkungan yang penuh persaingan dalam saluran

pencernaan dengan memberikan daya tahan yang lebih baik terhadap garam

empedu, serta membantu dalam menurunkan kadar kolesterol darah (Begley et

al.,2006; Noriega et al.,2006; Patel et al., 2010). Bile salt hydrolasedimiliki

oleh beberapa strain bakteri saluran pencernaan seperti: Lactobacillus,

Enterococcus, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus, danBacteroides

(Ooi dan Liong, 2010)


14/78

14

2.3 Empedu

Pembentukan empedu sangat penting dalam pencernaan dan penyerapan

lemak, ekskresi xenobiotik larut lemak dan racun dalam tubuh, dan keseimbangan

kadar kolesterol. Garam empedu secara alamiah bersifat amphipilik karena

memiliki gugus polar dan non polar. Gugus polar memiliki permukaan yang

bersifat hidrofilik yang mengandung gugus hidroksil dan gugus karbonil,

sedangkan gugus non polar bersifat hidropobik (Salen dan Batta, 2004).

Cairan empedu merupakan gabungan antara asam empedu dan garam

empedu. Bilirubin tetrapyrrole (berwarna coklat), merupakan komponen pemberi

warna terbesar pada empedu dan merupakan produk akhir dari metabolisme heme.

Apabila bilirubin mengalami oksidasi akan berubah menjadi biliverdin (berwarna

hijau) (Bijl et al.,2009).

Garam empedu bersama pospolipid dan kolesterol merupakan cairan

organik terbesar dalam empedu dan merupakan kunci kekuatan dalam

pembentukan empedu pada saat di sekresikan ke canalikuli empedu melewati

membran apikal hepatosit(Beuers dan Pusl, 2004)

Komponen utama asam empedu dalam empedu manusia yaitu asam

xenodeoksikolat (45%) dan asam kolat (31%). Sebelum sebagian besar garam

empedu disekresikan ke lumen canalikuli, terlebih dulu terjadi konjugasi dengan

ikatan amida pada terminal gugus karboksil dengan asam amino glisin dan taurin.

Reaksi konjugasi ini menghasilkan glycoconjugates dan tauroconjugates.

Sebanyak 95% dari total garam empedu yang disintesa di hati diserap oleh usus

distal dan dikembalikan lagi ke hati. Proses sekresi dari hati ke gallbladder,


15/78

15

kemudian ke usus, dan akhirnya diserap kembali disebut siklus enterohepatik.

Jumlah total garam empedu yang mengalami siklus berulang-ulang melalui siklus

enterohepatik sekitar 3,5 g. Jumlah tersebut bersirkulasi dua kali per makan dan 6-

8 kali per hari. Apabila empedu tidak ada di usus, maka hapir 50% lemak yang

dimakan akan keluar melalui feses (Ganong, 2002; King, 2010). Siklus

enterohepatik garam empedu dapat dilihat pada Gambar 2.2.

Gambar 2.2. Siklus enterohepatik garam empedu (Ganong, 2002)

Produk akhir dari penggunaan kolesterol adalah asam empedu. Sintesa

asam empedu merupakan mekanisme utama untuk mengeluarkan kelebihan

kolesterol. Ekskresi kolesterol dalam bentuk asam empedu tidak cukup untuk

mengimbangi kelebihan intake kolesterol dari makanan. Walaupun sintesa asam

empedu merupakan jalan untuk proses katabolisme kolesterol, campuran terlarut

antara kolesterol dari makanan, lemak, dan zat gizi essensial juga penting untuk

memperlancar transportnya ke hati. Proses sintesa asam empedu membutuhkan

Garis yang tidak terputusyang masuk ke dalam sistem

portal merupakan garam

empedu yang berasal dari

hati, sedangkan garis

terputus-putus menunjukkan

garam empedu yang

terbentuk akibat aktivitas

bakteri

Kandung kemihSistem portal


16/78

16

kerja 17 enzim dan berlangsung di beberapa bagian intraseluler termasuk sitosol,

retikulum endoplasma, mittokondria, dan peroxisom (King, 2010).

2.4 Bakteri Asam Laktat

Mikroba yang terdapat di dalam saluran pencernaan sangat kompleks dan

merupakan komunitas yang dinamis. Total mikroba yang terdapat di saluran

pencernaan diperkirakan mencapai 1012 sel setiap gram isi dengan total sekitar

1015 yang terdiri dari lebih 1000 spesies, atau diperkirakan sekitar 3000-4000

spesies. Berat mikroorganime ini mencapai 1,5 kg di dalam tubuh dan

menyumbang 60% berat feses (Rahayu, 2008).

Bakteri asam laktat merupakan famili yang bersifat heterogenus, gram

positif, anaerob, tidak berspora, dan merupakan bakteri yang tahan terhadap

asam. Bakteri asam laktat dapat memfermentasi berbagai jenis zat gizi baik

secara homofermentatif maupun heterofermentatif terutama menghasilkan asam

laktat, selain itu juga dapat mengasilkan asam asetat, asam format, etanol, dan

CO2. Bakteri asam laktat tidak hanya dapat mengubah rasa makanan menjadi

asam dalam waktu singkat, tetapi juga akan merubah flavor, tekstur, dan

kandungan zat gizi makanan tersebut. Bakteri asam laktat secara alami ditemukan

pada tanaman, daging, susu dan hasil olahannya, dan hasil fermentasi serealia, dan

sudah lama digunakan dalam industri makanan dalam skala besar atau industri

rumah tangga, serta makanan hasil fermentasi. Bakteri asam laktat digunakan

sebagai starter untuk fermentasi sayur atau daging (Liu et al., 2005;

Klaenhammer et al.,2005).


17/78

17

Bakteri asam laktat termasuk golongan bakteri mikroaerofilik, yang

memfermentasi heksosa menghasilkan asam laktat. Bakteri asam laktat yang

banyak digunakan dalam dunia industri adalah spesies Lactococcus,

Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Leuconostoc, dan

Lactobacillus (Makarova et al., 2006 ; O'Sullivan et al., 2009). Spesies BAL

dalam memetabolisme hexosa dapat melalui dua proses fermentasi, yaitu

homofermentatif, dimana BAL hanya menghasilkan asam laktat, dan

heterofermentatif, dimana selain menghasilkan asam laktat BAL juga

menghasilkan CO2, asam asetat, dan etanol (Makarova et al.,2006).

Bakteri asam laktat juga dapat menghasilkan peptida antimikroba seperti

bakteriosin, sebagai contoh adalah L. salivarius UCC118, yang sangat efektif

untuk menekan pertumbuhan L. monocytogenes. Beberapa spesies yang biasa

ditemukan pada saluran pencernaan manusia dan hewan, kadang-kadang juga

dapat menimbulkan penyakit. Penyakit yang disebabkan oleh kolonisasi BAL

patogen seperti; infeksi saluran kencing, bakterimia, endokarditis, divertikulatis,

dan meningitis (O'Sullivan et al., 2009).

2.5 Lactobacillus

Genus Lactobacillus terdiri atas banyak kelompok termasuk beberapa

spesies yang digunakan untuk fermentasi dan pengawetan makanan. Beberapa

Lactobacillus merupakan probiotik, yang dapat memberikan efek yang

menguntungkan bagi kesehatan hostnya (Claesson et al.,2007). Lactobacillusdi

tubuh manusia biasanya ditemukan pada vagina dan saluran pencernaan, dimana

bisanya bersimbiosis menjadi bagian kecil dari mikroflora usus. Asam laktat


18/78

18

yang dihasilkan membuat lingkungan menjadi asam, yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri berbahaya (Wikipedia, 2010).

Lactobacillus merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang

termasuk dalam kelompok (BAL). Lactobacillus memiliki karakter tergantung

spesies seperti obligat/fakultatif, homo/heterofermentatif dalam perannya

mengubah susu menjadi asam dan sering dimanfaatkan untuk membuat produk

olahan terfermentasi seperti keju, yogurt, dan susu terfermentasi lainnya.

Lactobacillus merupakan kelompok bakteri heterogenus yang terdiri atas 135

spesies dan 27 subspesies (Bernardeau et al.,2008).

Lactobacillusdiisolasi dari isi perut orang sehat, pertama kali pada tahun

1983, pada saat itu menunjukkan ketahanan yang luar biasa terhadap asam kuat

yang biasa terdapat pada saluran pencernaan. Lactobacillus dapat menurunkan

kolesterol dan memberikan efek hipokolesterolemia (Lye et al., 2010).

Lactobacillus sp. Dad 13 yang diisolasi dari dadih terbukti ampuh menurunkan

kolesterol (Rusfidra, 2006). Lactobacillusrhamnosus akan memberikan pengaruh

yang menguntungkan pada saluran pencernaan, sangat berperan dalam

peningkatan sistem imun, terutama dalam melawan patogen yang ada dalam

saluran pencernaan dan saluran kencing (Adams, 2009).

Antarini (2010) menyatakan bahwa pada produk susu terfermentasi

pertumbuhanL. rhamnosus SKG34 sebesar 2,5 x 108 sampai 7,6 x 109 cfu/ml,

serta peningkatan protein terlarut 0,046% - 0,084%, peningkatan asam amino

bebas seperti asam aspartat, asam glutamat, serin, histidin, glisin, treonin, alanin,

tirosin, metionin, isoleusin, leusin, dan lisin.


19/78

19

BAB III

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep

Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek

yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang

cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki

keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan

(Shitandi et al.,2007; Dommels et al.,2009; Weichselbaum, 2009).

Bakteri asam laktat termasuk golongan bakteri mikroaerofilik, gram

positif yang memfermentasi heksosa menghasilkan asam laktat. Bakteri yang

termasuk BAL, sering digunakan dalam dunia industri (Makarova et al.,2006).

Beberapa jenis BAL seperti L. rhamnosus ATCC 53013 dan L. acidophilus

NCFM, merupakan bakteri probiotik (O'Sullivan et al., 2009). Sujaya et al.

(2008b) menyatakan bahwa bakteri probiotik yang banyak beredar di pasaran

umumnya dari golongan BAL. Adanya klaim menyehatkan, telah memicu

perburuan strain BAL dari berbagai sumber alami, seperti saluran pencernaan,

susu manusia dan hewan serta makanan terfermentasi tradisional.

Beberapa aspek seperti keamanan, fungsional, dan karakterisasi teknologi

menjadi pertimbangan utama dalam proses seleksi mikroba probiotik. Aspek

keamanan termasuk spesifikasi seperti : kemurniannya (menyehatkan saluran

pencernaan), bersifat non patogenik, dan tahan terhadap antibiotik. Aspek

fungsional seperti kemampuan hidup dan tahan dalam saluran pencernaan,

imunomodulation, bersifat antagonis, dan tidak mengalami mutasi (Saarela et al.,


20/78

20

2000). Strain probiotik juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan

makanan dan penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan

tahan terhadap proses psikokimia pada makanan (Prado et al.,2008).

FAO/WHO (2002) menyatakan bahwa sebelum dapat dinyatakan sebagai

bakteri probiotik, kandidat probiotik harus melewati uji in vitro dan uji in vivo.

Uji in vitro meliputi uji ketahanan pada saluran cerna termasuk resistensi terhadap

asam lambung dan asam empedu, uji aktivitas antimikrobial, uji adhesif pada sel

eritrosit, uji aktivitas enzim bile salt hydrolase, dan kemampuan untuk

menurunkan jumlah bakteri patogen. Uji-uji tersebut dilakukan untuk

menghindari terjadinya efek negatif akibat mengkonsumsi probiotik.

Lactobacillus rhamnosus SKG34 yang diisolasi dari susu kuda Sumbawa,

merupakan kandidat probiotik lokal Indonesia yang sangat berpotensi untuk

dikembangkan sebagai probiotik.Lactobacillus rhamnosus SKG34 telah melewati

uji in vitrodiantaranya, memiliki daya hambat yang besar terhadap pertumbuhan

bakteri pathogen (Sujaya et al., 2008b), mampu melewati simulasi kondisi

lambung, dengan pH 3 dan 4 tidak mengubah asam kolat primer (kolat) menjadi

asam kolat skunder (deoksikolat), serta mampu menghidrolisis garam empedu

Sujaya et al. (2008a)

Saat ini perlu dilakukan uji lanjutan untuk mengetahui populasi L.

rhamnosus SKG34 pada sekum tikus putih (R. norvegicus) dan kemampuannya

untuk menurunkan kadar kolesterol darah tikus putih (R. norvegicus). Diagram

kerangka konsep penelitian disajikan pada Gambar 3.1.


21/78

21

Gambar 3.1. Kerangka konsep pengembangan probiotik L .rhamnosus

SKG34

Keterangan :

Tulisan tebal dan digarisbawahi merupkan variable yang diteliti

Parameter yang diteliti dalam penelitian ini, yaitu :

1. Populasi L. rhamnosusSKG34 pada sekum tikus putih (R. norvegicus)

2. Kemampuan L. rhamnosus SKG34 menurunkan kadar kolesterol darah

tikus putih (R. norvegicus)

Kandidat probiotik

Lactobacillus rhamnosusSKG34

Uji in vivo :

A. Ketahanan pada saluran cerna

Populasi pada sekum

B. Efek fungsional :

Kadar kolesterol

Sistem imunAlergi

Konstipasi

Kanker kolon

dan lain sebagainya

Uji in vitro :

A. Ketahanan pada saluran cerna

Resistensi asam lambung

Resistensi asam empedu

B. Aktivitas antimikrobial

C. Adhesif pada sel eritrositD. Bile salt hydrolase

E. dan lain sebagainya

Probiotik potensial

Lactobacillus rhamnosusSKG34


22/78

22

3.2 Hipotesis Penelitian

Hipotesis penelitian ini yaitu :

1. Lactobacillus rhamnosus SKG34 dapat bertahan dan melewati

percernaan bagian atas dan ditemukan pada sekum tikus putih (R.

norvegicus).

2. Lactobacillus rhamnosus SKG34 berpengaruh terhadap kadar kolesterol

darah tikus putih (R. norvegicus).


23/78

23

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium untuk menghitung

populasi L. rhamnosusSKG34 pada sekum dan mengukur kadar kolesterol darah

tikus putih (R. norvegicus). Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini

adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua perlakuan, yaitu kontrol dan

perlakuan pemberianL. rhamnosusSKG34. Setiap perlakuan diulang 6 kali.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di UPT Laboratorium Biosain dan

Bioteknologi Universitas Udayana. Penelitian ini berlangsung selama 5 bulan

dari bulan MaretJuli 2011.

4.3 Alat Penelitian

Jenis peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain:

a. Pemeliharaan hewan coba (tikus putih)

Alat yang dipergunakan adalah: kandang, timbangan, selop tangan, masker,

sonde, keranjang, kawat, tempat makan dan minum, dan sekam padi

(Lampiran 8).

b. Penyegaran materi hidup, penghitungan koloni bakteri dan pembuatan

suspensi bakteri

Alat yang digunakan adalah: tabung reaksi (iwaki-pyrex), Erlenmeyer (iwaki-

pyrex), gelas beaker (iwaki-pyrex), gelas ukur (iwaki-pyrex), magnetic stirrer,


24/78

24

stirer bar (iwaki BS-38), cawan petri (iwaki-pyrex), batang kaca bengkok,

kaca objek, cover glass, tabung eppendorf 1,5 ml, timbangan (Shimadzu

AUX 220), autoklaf (all American modelno. 1925), kompor (Rinai, RI 522

C), luminar air flow cabinet (ESCO), inkubator (Memmert), mikroskop

(Olympus), jarum ose, pipetman (Gilson) ukuran 1000 l, 200 l, tips biru,

kuning (porex bio product), sentrifugasi (Hitachi), vortex (Labinco), kulkas

(Toshiba), frezzer -20oC, chamber anaerobic(Oxoid), dan kertas tissue.

c. Pengukuran pH

Alat yang digunakan adalah: pH meter (TOA ion meter IM 40S), tabung

reaksi (iwaki-pyrex), vortex (Labinco), dan kertas tissue.

d. Pengujian RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dan PCR

(Polymerase Chain Reaction) sel lisat hasil isolasi.

Alat yang digunakan adalah: tabung eppendorf 1,5 ml, microtube 100 l

(Treff), pipetman (Gilson) ukuran 20 l, 200 l, tips biru, kuning, kristal

(porex bio product), sentrifuge (Hitachi), vortex (Labinco), freezer -20o C,

microwave (Samsung), mesin PCR (Invinegen), mesin elektroforesis set

(Cosmo bio), UV transluminator (Edvotek model TM-10), selop tangan, dan

kertas tissue.

e. Pengukuran kadar kolesterol

Alat yang digunakan adalah: tabung reaksi (iwaki-pyrex), sentrifuge,

spektrofotometer (Genesys20 model 4001/4), dan kertas tissue.


25/78

25

4.4 Bahan Penelitian

Jenis bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain:

a. Pemeliharaan tikus

Bahan yang diperlukan adalah: jagung, kacang hijau, telur, dan air. Hewan

percobaan yang digunakan adalah tikus putih (R. norvegicus) jantan yang

berumur 5 minggu dengan bobot 40-50 gram yang diperoleh dari tempat

penangkaran di Jalan Ceningan Sari, Gang Anyar Sari, Sesetan, Denpasar

(Bapak Minggu).

b. Penyegaran materi hidup, penghitungan koloni bakteri, dan pembuatan

suspensi bakteri

Bahan yang digunakan adalah: materi hidup L. rhamnosus SKG34

(UNUDCC), media deMan Rogosa Sharpe broth (MRS) broth (Pronadisa)

media MRS agar (Pronadisa), anaerob agar (Pronadisa),Bromo cresol purple

(BCP), gliserol (Pronadisa), anaerob gas generating kit (oxoid), gram stein

(Bio analitika), hydrogen peroksida (H2O2) (Reidel-de Haen), NaCl (Merck),

alkohol 70% (Brataco chemical), dan aquades.

c. Pengukuran pH

Bahan yang digunakan adalah: buffer pH 4 dan 7, aquades, dan kertas tissue.

d. Pengujian RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sel lisat hasil isolasi

Bahan yang digunakan adalah: agarose (Pronadisa),PCR mix (Intron), primer

M 13F dengan urutan basa (sequences) 5-CGA CGT TGT AAA ACG ACG

GCC AGT-3, deionize water, DNA, Tris Acetic EDTA (TAE) 1X, loading


26/78

26

buffer, ethidium bromide (Bio rad), kit isoplant II (isoplant code no. 310-

04151, Nippon Gene, Toyama, Japan), dan kertas tissue

e. Pengujian PCR sel lisat hasil isolasi

Bahan yang digunakan 0,2 mM dNTPs, 1 X PCR Buffer 10 X, 0,6 mM

MgCl2, 0,9 U AmpliTaq, primer spesifik Lactobacillus rhamnosus; Lu5 F

(5-CTA GCG GGT GCG ACT TTG TT-3) dan Rhall R (5-GCG ATG

CGA ATT TCT ATT ATT-3), masing-masing 10 pmol, deionize water,

DNA, TAE 1X, loading buffer, ethidium bromide (Bio rad), DNA marker

(Amresco, Solon, Ohio), dan kertas tissue.

Tabel 3.1

Primer yang dipergunakan dalam penelitian

Primer Sequence (5-3) Sumber Pustaka

M 13

LU5

RhaII

CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT

CTAGCGGGTGCGACTTTG TT

GCGATGCGAATTTCTATTATT

Vassart, et al., 1987

Song et al., 2000

Song et al., 2000

f. Pengukuran kadar kolesterol

Bahan yang digunakan adalah: kit kolesterol (Analyticon 200 mg/dl) aquades,

dan kertas tissue.

4.5 Penyegaran Materi Hidup

Stok isolat L. rhamnosus SKG34 yang disimpan dalam gliserol 30%

pada suhu -20o C, diambil sebanyak satu loop ose dan diinokulasikan dalam

tabung reaksi yang berisi 5 ml media MRS broth. Tabung reaksi diinkubasi pada

suasana aerob selama 24 jam pada suhu 37oC. Hasil positif ditunjukkan dengan


27/78

27

timbulnya kekeruhan pada tabung reaksi. Selanjutnya dilakukan uji konfirmasi

untuk memastikan bahwa isolat tidak mengalami perubahan. Uji ini diantaranya:

uji gas, katalase, pengecatan gram, dan morfologi. Bila tidak terjadi perubahan,

maka hasil positif ini (kultur) akan dipergunakan untuk tahap pengujian

selanjutnya (Portugal et al.,2006).

4.5.1 Uji Gas

Uji produksi gas dilakukan untuk mengetahui BAL bersifat

homofermentatif atau heterofermentatif. Uji gas dilakukan dengan mencelupkan

ose dalam keadaan panas ke dalam kultur BAL yang telah tumbuh pada media

MRS broth. Kultur BAL bersifat heterofermentatif jika pada saat ose panas

dicelupkan terbentuk buih seperti soda yang dikocok.

4.5.2 Uji Katalase

Pengujian katalase dilakukan dengan meneteskan larutan H2O23% di atas

gelas objek, selanjutnya satu loop ose isolat BAL yang diuji diambil dan

dimasukkan ke dalam larutan H2O2 3% yang ada di gelas objek. Hasil positif

dinyatakan dengan adanya gelembung-gelembung gas, sedangkan apabila tidak

terbentuk gelembung-gelembung gas dinyatakan negatif (Lay, 1994).

4.5.3 Uji Morfologi dan Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram dilakukan dengan membuat preparat ulas pada gelas

objek. Gelas objek dibersihkan dengan kapas yang sudah dibasahi dengan alkohol.

Tabung reaksi berisi isolat BAL divortek, diambil satu loop ose, kemudian

diusapkan pada bagian tengah gelas objek. Preparat difiksasi diatas api untuk

membunuh dan melekatkan bakteri pada gerlas objek. Setelah kering diberi


28/78

28

larutan kristal violet (sebagai zat warna) selama satu menit, kemudian dicuci

dengan air mengalir. Selanjutnya diberi larutan lugol (mordan), selama satu menit,

dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian diberi larutan pemucat (aseton

alkohol) selama 5-10 detik, kemudian dibilas lagi dengan air mengalir. Setelah itu

preparat diberi larutan safranin selama 15 detik, dicuci dengan air mengalir,

kemudian dikeringkan dengan cara difiksasi di atas api. Uji morfologi dilakukan

dengan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 100 kali. Hasil

pengamatan berupa morfologi sel dan perbedaan warna, dimana warna ungu

kebiruan menunjukkan bakteri bersifat Gram positif, sedangkan warna merah

atau merah muda menunjukkan bakteri bersifat gram negatif (Lay, 1994).

4.6 Perlakuan pada Tikus Putih (R. norvegicus)

4.6.1 Tahap aklimatisasi tikus putih (R. norvegicus)

Pada penelitian ini akan dipergunakan 20 ekor Tikus Putih (R. norvegicus)

jantan yang berumur 5 minggu dengan bobot 40-50 gram yang diperoleh dari

tempat penangkaran di Jalan Ceningan Sari, Gang Anyar Sari, Sesetan, Denpasar

(Bapak Minggu). Sebelum diberikan perlakuan, hewan percobaan diaklimatisasi

selama 19 hari, yang meliputi; kandang, umur, diet, dan bobot tubuh. Pada tahap

aklimatisasi ini, tikus diberikan makanan standar berupa campuran jagung giling,

kecambah kacang hijau, minyak dari lemak babi dan kuning telur (50:30:10:10).

Tikus diberi tanda dengan cat kuku pada bagian kuku kaki belakang, ekor dan

telinga. Tikus ditempatkan pada kandang yang terbuat dari bak plastik dengan

ukuran 50 cm x 30 cm x 10 cm. Bak diisi dengan penutup kawat dan pada dasar

bak diisi dengan sekam padi sebagai penyerap urin dan kotoran tikus seperti


29/78

29

terlihat pada Lampiran 8 (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988). Bagan penelitian

dengan hewan coba tikus putih dapat dilihat pada Gambar 4.1.

Gambar 4.1. Bagan penelitian dengan hewan coba tikus putih

4.6.2 Persiapan suspensi bakteri L . rhamnosusSKG34

Biakan yang telah tumbuh pada media MRS broth (sub bab 4.5), divortex

(untuk mendapatkan biakan yang homogen), kemudian diambil sebanyak 1 ml

dengan pipet mikro, dimasukkan ke dalam eppendorf dan disentrifugasi dengan

kecepatan 5000 rpm selama 7 menit untuk memisahkan massa sel dengan

supernatan. Supernatan dibuang dan massa sel yang diperoleh dicuci sebanyak 2

kali dengan larutan salin (NaCL 0,85%) untuk menghilangkan sisa-sisa media.

Pencucian dilakukan dengan menambahkan 1 ml salin pada massa sel, divortex

hingga homogen, disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 7 menit. Pada

tahap akhir, massa sel dilarutkan dengan 1 ml salin, sehingga diperoleh

konsentrasi suspensi kurang lebih 108cfu/ml (Sujaya, 2009 dalam Nursini, 2010).

4.6.3 Perlakuan in vivopada tikus putih (R. norvegicus)

Suspensi bakteri L. rhamnosus SKG34 yang diperoleh (anak sub bab

4.6.2), diberikan pada tikus putih dengan metode oral gavage, yaitu dengan cara

memberikan suspensi masing-masing sebanyak 0,5 ml ( 9,2 x108sel/ml) kepada

10 ekor tikus putih dengan metode sonde. Sebagai kontrol 10 ekor tikus lainnya

diberikan salin. Perlakuan ini dilakukan selama 3 minggu dengan frekuensi

Pemberian diet

hiperkolesterol

Pemberian L .

rhamnosus SKG34

Pembedahan

tikus

19 hari 21 hari


30/78

30

pemberian sekali dalam sehari (pada jam 13.00 13.30 WITA). Perlakuan

diberikan setelah pemberian makan pada tikus putih. Setiap hari selama

perlakuan, berat makanan yang diberikan dan pertambahan berat badan tikus

selalu di timbang (Sujaya, 2009 dalam Nursini, 2010).

4.6.4 Pengukuran pH sekum

Isi sekum diukur pHnya menggunakan pH meter (TOA ion meter IM 40S)

yang sebelumnya telah dikalibrasi dengan buffer pH 4 dan pH 7. Isi sekum yang

telah diencerkan sebanyak 1 kali (1:1), kemudian dihomogenkan dengan divortex.

Selanjutnya pH isi sekum diukur dengan mencelupkan elektroda pH meter ke

dalam sampel dan hasilnya dicatat.

4.6.5 Penghitungan populasi bakteri

Setelah 3 minggu perlakuan, tikus putih yang diambil sekumnya dibius

dengan kloroform 10%, dibedah dan diambil bagian sekumnya. Sekum yang

diperoleh diletakkan pada cawan petri steril, kemudian isinya dikeluarkan dan

ditampung dalam tabung steril dan ditambahkan larutan fisiologis (NaCl 0,85%)

sesuai dengan berat isi sekum (pengenceran 1:1) dan dihomogenkan. Selanjutnya

0,5 ml suspensi isi sekum dimasukkan ke dalam tabung pengencer yang berisi 4,5

ml salin sehingga diperoleh pengenceran 10-1, divortex hingga homogen,

kemudian diencerkan lagi sampai diperoleh pengenceran 10-7. Untuk penentuan

total BAL digunakan metode permukaan. Sebanyak 0,1 ml sampel yang telah

diencerkan (pengenceran 10-3 10-5) disebar pada permukaan media MRS agar

yang telah ditambahkan dengan Bromo Cresol Purple (BCP), kemudian

diinkubasi secara anaerob selama 48 jam pada suhu 37o

C. Metode yang sama


31/78

31

dilakukan untuk penghitungan total bakteri anaerob, penanaman dilakukan pada

media anaerob agar (pengenceran 10-4

10-7

) dan diinkubasi secara anaerob

dengan menggunakan anaerobic gas pouchdalam anaerobic chamber (Lampiran

10). Setelah diinkubasi selama 48 jam, dilakukan penghitungan jumlah koloni

yang tumbuh. Total populasi bakteri diperoleh dengan mengalikan jumlah koloni

yang tumbuh dengan faktor pengencernya dikalikan 10 (Fardiaz, 1993).

4.6.6 Analisis kolesterol darah tikus putih (R. norvegicus)

Kadar kolesterol total pada serum tikus putih diukur dengan metode

enzimatik Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin (CHOD-PAP) yang

dikembangkan oleh Roche Diagnostic, Germany (Analyticon 200 mg/dl) dan

diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 510 nm.

Sampel darah tikus diambil pada awal penelitian, setelah masa

aklimatisasi, dan setelah perlakuan pemberian L. rhamnosus SKG34. Darah

diambil dari medial canthus sinus orbitalis menggunakan mikrohematokrit atau

tabung kalpiler, ditampung dalam tabung eppendorf. Sampel kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit, sehingga serumnya

terpisah dari sel darahnya. Selanjutnya serum darah dipindahkan ke tabung

eppendorf baru dan disimpan pada suhu -20o C, untuk selanjutnya dianalisis

(Smith dan Mangkoewidjojo, 1988).

Langkah-langkah dalam pengukuran kolesterol :

a. Larutan standar kolesterol 50 mg/dl

Dipipet sebanyak 50 l standar kolesterol dengan pipet mikro ke dalam

eppendorf, kemudian ditambahkan 150 l aquadest steril untuk mendapatkan


32/78

32

konsentrasi larutan baku 50 mg/dl. Larutan baku tersebut dipipet sebanyak 10

l kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol.

Selanjutnya larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit.

Tahap selanjutnya adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang 510 nm.

b. Larutan standar kolesterol 100 mg/dl



konsentrasi larutan baku 100 mg/dl. Larutan baku tersebut dipipet sebanyak

10 l kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol.




c. Larutan standar kolesterol 150 mg/dl



konsentrasi larutan baku 150 mg/dl. Larutan baku tersebut dipipet sebanyak

10 l kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol.





33/78

33

d. Larutan standar kolesterol 200 mg/dl


eppendorf, kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol

untuk mendapatkan konsentrasi larutan baku 200 mg/dl. Selanjutnya larutan

tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit. Tahap selanjutnya

adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 510 nm.

e. Larutan blanko

Sebanyak 10 l aquadest steril dipipet dengan pipet mikro kemudian

ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol. Selanjutnya larutan

tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit. Tahap selanjutnya

adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 510 nm.

f. Larutan sampel

Dipipet sebanyak 10 l serum dengan pipet mikro kemudian ditambahkan

1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol. Selanjutnya larutan tersebut

diinkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit. Tahap selanjutnya pengukuran

absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 510 nm.

Nilai absorban yang muncul dicatat dan konsentrasi kolesterol total

dihitung dengan cara membagi nilai absorban sampel dengan nilai absorban

blanko dan dikalikan dengan absorban standar kolesterol.


34/78

34

4.7 Analisis Populasi L. rhamnosusSKG34

4.7.1 Isolasi genomik DNA

Isolasi genomik DNA BAL menggunakan kit isoplant II. Diambil 1 ml

kultur yang telah tumbuh pada 5 ml MRS broth (sub bab 4.5), kemudian

disentrifugasi pada 5000 rpm selama 7 menit untuk mendapatkan massa sel.

Massa sel yang diperoleh dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali untuk

menghilangkan sisa media. Massa sel yang telah dicuci divortex, ditambahkan

dengan 300 l solution I, divortex selama 1-3 detik, ditambahkan 150 l solution

II dan divortex selama 5-6 detik. Selanjutnya adalah penambahan solution IIIA

dan IIIB masing-masing sebanyak 75 l dan divortex selama 1-2 detik kemudian

diletakkan di atas es selama 15 menit. Selanjutnya campuran disentrifugasi pada

15.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Sebanyak 200-400 l cairan DNA

yang telah terpisah diambil dan ditambahkan etanol 99% sebanyak 2 2,5 kali

cairan DNA, kemudian disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 30 menit pada

suhu 4oC, sehingga diperoleh DNA pellet dan ditambahkan 100 l alkohol 70%

kemudian disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4o C.

Langkah selanjutnya adalah DNA pellet dievavorasi dan ditambahkan 20-25 l

TE pH 7,5 dan divortex. Selanjutnya dilektroforesis untuk memastikan berhasil

tidaknya isolasi DNA.

4.7.2 RAPD DNA L . rhamnosusSKG34

Tahapan RAPD dilakukan mengacu pada prosedur Ivanova et al. (2008).

Campuran reaksi RAPD merupakan campuran pada total volume 12,5 l dengan

komposisi 6,25 l Master Mix Solution Intron Biotechnology, 1,00 l primer


35/78

35

M13F dengan urutan basa (sequences) 5-CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC

AGT-3, 4,25 l air steril , dan 1,00 l DNA sehingga total volume reaksi 12,5

l. Aplifikasi dilakukan pada mesin Infinigen Thermocycler, dengan kondisi satu

siklustahap pre denaturasi pada 95oC selama 5 menit, diikuti dengan 40 siklus

tahap denaturasi pada 95oC selama 20 detik, tahap annealing pada 40o C selama 2

menit, dan tahap ekstensi 72oC selama 30 detik, serta tahap akhir yaitu elongasi

tambahan pada 72oC selama 5 menit. Setelah reaksi selesai, sampel dikeluarkan

dari mesin dan dielektroforesis.

4.7.3 RAPD koloni biakan yang diisolasi dari sekum tikus

Koloni tunggal terpisah yang telah tumbuh pada cawan petri setelah

diinkubasi (hasil pengerjaan anak sub bab 4.6.5) yang telah dibuat stock culture

pada MRS agar, selanjutnya dibiakkan dalam MRS broth sebanyak 10 koloni

untuk setiap perlakuan dan kontrol, diinkubasi secara aerob selama 24-48 jam

pada suhu 37o C. Koloni yang tumbuh ditandai dengan terjadinya kekeruhan,

selanjutnya 1 ml dan ditampung pada eppendorf kemudian disentrifugasi pada

kecepatan 5000 rpm selama 7 menit. Selanjutnya supernatant dibuang dan massa

sel dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali untuk menghilangkan sisa media.

Selanjutnya massa sel ditambahkan 200 l air steril dan dihomogenkan, kemudian

dilakukan pemanasan pada suhu 100o C selama 10 menit dan perlakuan pada

suhu rendah (-20oC) selama 20 menit. Perlakuan ini dilakukan sebanyak 2 kali

untuk melisiskan dinding sel dan mengeluarkan DNA bakteri. Selanjutnya

dilakukan RAPD dengan kondisi yang sama dengan anak sub bab 4.7.2. Setelah

reaksi selesai, 5 l sampel diambil untuk dielektroforesis (Sujaya et al.,2005).


36/78

36

4.7.4 Elektroforesis

Elektroforesis menggunakan 1,5% agarose. Sebanyak 1,5 g agarose

disuspensikan dalam 98,5 ml buffer TAE IX dan dipanaskan dalam microwave

sampai larut sempurna. Selanjutnya agarose ini distirer sambil menunggu sampai

suhunya 50oC untuk dituang pada cetakan yang sudah dilengkapi sisir (comb)

untuk membuat sumur (well), tebal gel 2/3 dari cetakan dan ditunggu sampai gel

padat. Setelah padat, gel agarose dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis

yang telah diisi buffer TAE IX, dengan tinggi permukaan larutan buffer 2-3 mm

di atas agar. Selanjutnya setiap suspensi DNA hasil RAPD dipipet sebanyak 3 l

dan ditambahkan 1 l loading buffer 6X yang diteteskan pada parafin film,

kemudian dihomogenkan dengan pipet berulang kali. Sampel-sampel DNA yang

telah homogen dimasukkan secara vertikal ke dalam sumur-sumur gel. Pada gel

elektroforesis ini, dimasukkan juga DNA ladderpada salah satu sumur gel untuk

menentukan panjang pita yang terbentuk. Elektroforesis dilakukan selama 40

menit pada tegangan 100 volt. Visualisasi hasil elektroforesis dapat dilihat dengan

UV Transluminator setelah gel terendam dalam larutan ethidium bromide (5

g/100 ml air steril) (staining) selama 10 menit dan direndam dalam aquadest

selama 2 menit (distaining) untuk mencuci kelebihan ethidium bromide.

Dokumentasi pola band dilakukan dengan mengambil gambar menggunakan

kamera digital Panasonic DMC-FS15 (Sujaya et al.,2005).

4.7.5. Pengamatan mikroskopis pada konsorsium bakteri sekum tikus putih

Konsorsium bakteri yang tumbuh pada media MRS agar, dikerok

denganose kemudian ditumbuhkan pada media MRS brothdan diinkubasi dalam


37/78

37

lingkunagan anaerob selama 48 jam. Pewarnaan gram dilakukan dengan membuat

preparat ulas pada gelas objek. Gelas objek dibersihkan dengan kapas yang sudah

dibasahi dengan alkohol. Tabung reaksi berisi isolat BAL divortek, diambil satu

loop ose, kemudian diusapkan pada bagian tengah gelas objek. Preparat difiksasi

diatas api untuk membunuh dan melekatkan bakteri pada gerlas objek. Setelah

kering diberi larutan kristal violet (sebagai zat warna) selama satu menit,

kemudian dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya diberi larutan lugol (mordan),

selama satu menit, dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian diberi larutan

pemucat (aseton alkohol) selama 5-10 detik, kemudian dibilas lagi dengan air

mengalir. Setelah itu preparat diberi larutan safranin selama 15 detik, dicuci

dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dengan cara difiksasi di atas api. Uji

morfologi dilakukan dengan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada

pembesaran 100 kali. Hasil pengamatan berupa morfologi sel dan perbedaan

warna, dimana warna ungu kebiruan menunjukkan bakteri bersifat Gram positif,

sedangkan warna merah atau merah muda menunjukkan bakteri bersifat gram

negatif (Lay, 1994).

4.7.6 PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus konsorsium bakteri

sekum tikus putih

Sebanyak 1 l lisat sel di pergunakan sebagai sumber DNA dalam reaksi

PCR dengan mempergunakan primer spesifik L. rhamnosus. Reaksi campuran

PCR dengan volume total 12,5 l yang mengandung; 0,2 mM dNTPs, 1 X PCR

Buffer 10 X, 0,6 mM MgCl2, 0,9 U AmpliTaq, primer spesifik L. rhamnosus;

Lu5 F dan Rhall R, masing-masing 10 pmol. Reaksi amplifikasi dilakukan


38/78

38

sebagai berikut: satu siklus pada suhu 95oC selama 5 menit, diikuti dengan 35

kali siklus pada 95o

C selama 30 detik, 57o

C selama 40 detik, dan 72o

C selama

30 detik. Pada tahap akhir ditambahkan satu siklus pada suhu 72 o C selama 5

menit. Produk PCR selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 2%

dengan TAE buffer 1 X. selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan EtBr, kemudian

produk PCR divisualisasikan pada transluminator dengan sinar UV dan difoto

(Aryantini, 2008).

4.8 Penyajian dan Analisis Data

Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel, grafik, dan gambar.

Data populasi L. rhamnosusSKG34 dalam saluran pencernaan, total BAL, total

bakteri anaerob, dan pH dianalisis secara deskriptif. Data hasil kadar kolesterol

darah dianalisis menggunakan Uji Hipotesis Beda Rataan untuk dua populasi yang

saling bebas (T-test Independent) (Steel dan Torrie, 1993).


39/78

39

BAB V

HASIL PENELITIAN

5.1. Kolonisasi Lactobacil lus rhamnosus SKG34 pada Saluran Pencernaan

Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Pengujian secara in vivo bertujuan untuk mengetahui kemampuan suatu

strain untuk dikembangkan sebagai probiotik yang potensial. Pengujian in vivo

dapat menjelaskan kemampuan suatu strain yang dianggap potensial sebagai

probiotik, mampu untuk melewati barrier saluran pencernaan bagian atas, mampu

mencapai usus dalam keadaan hidup dan dalam jumlah yang ditetapkan, mampu

berkolonisasi di usus, dan mampu memberikan efek yang menguntungkan bagi

pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme yang terdapat dalam usus.

Hasil RAPD koloni Lactobacillus rhamnosus SKG34 pada sekum tikus

dapat dilihat pada Gambar 5.1. Berdasarkan hasil deteksi L. rhamnosus SKG34

dari 10 koloni BAL yang diambil secara acak pada MRS agar tidak ditemukan

adanya DNA yang menggambarkan koloni L. rhamnosus SKG34. Akan tetapi

berdasarkan pengecatan Gram yang dilakukan terhadap kultur sekum tikus putih

yang diberikan L. rhamnosus SKG34 yang dibiakkan pada media MRS agar

menunjukkan adanya morfologi sel yang menyerupai L. rhamnosus SKG34,

seperti terlihat pada Gambar 5.2. Hasil pengecatan gram yang dilakukan terhadap

kultur sekum tikus putih yang tidaki diberikan L. rhamnosus SKG34 yang

dibiakkan pada media MRS agar tidak ditemukan adanya koloni BAL yang

morfologinya mirip dengan morfologiL. rhamnosus SKG34, seperti terlihat pada

Gambar 5.3.


40/78

40

Gambar5.1.

RAPD

kolon

iBALpadasekumtikusyang

diberikanLactobacillusrhamnosusSKG34yangdiambil

secaraacakpadaMRSaga

r..

M,

Marker100bp;K,

Kon

trolpositif(L.rhamnosusSKG34);1-10,

kulturBALP1;

11-30,

kulturBALP2;21-30,

kulturBALP6;31-40,

kulturBALP7;41-50kulturBAL

P9;dan51-60kulturBAL

P10.

tandapanahmenunjukkanpanjangpita(bp)

1

2

3

5

6

8

9

10

000

3000

500

500

1500

31

32333

35363

3839

0

1000

HasilRAPDkoloniBALpadasekumtikusperlakuan,dari10koloniBALyangdiamb

ilsecaraacakpadaMRS

agartidakditemukanadanyaDNAyangmenggambarkan

koloniL.rhamnosusSKG34(tidakditemukanpolaband

yangsamadenganpolaban

dpadalajurK


41/78

41

Gambar5.2.

Cat

Gram

konsorsium

bakteripadasekum

tikusperlakuany

ang

ditumbuhkanpada

MRSbroth.

1-6,

tikusperlakuan;7,

Lactobacillusrhamno

sus

SKG34;bar10m

denganpembesaran1000kali

2

1

3

4

5

6

7

Padasekumtikusperlakuanditemukanadanyam

orfologiselyangmenyerupai

L.

rhamnosusSKG34

(panel7),yangditunjukkano

lehtandapanahmerah(

)


42/78

42

Gambar5.3.

CatGramkonsorsiumbakteripada

sekumtikuskontrolyangditumbuhkan

padaMRSbroth.

1-6,

tikuskontrol;7,

LactobacillusrhamnosusSKG34;ba

r10m

denganpembesaran1000kali

2

1

3

4

5

6

Padasekumtikus

kontroltidakditemukanmorfo

logiselyangmenyerupai

Lactobacillusrha

mnosusSKG34(panel7)


43/78

43

Berdasarkan data Gambar 5.2 dan 5.3,, selanjutnya dilakukan PCR kultur

sekum tikus putih dengan menggunakan primer spesifik Lactobacillus rhamnosus.

Hasil PCR kultur sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosus SKG34 dan

yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34 dapat dilihat pada Gambar 5.4. Hasil

PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus menunjukkan bahwa dalam

sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosus SKG34 dapat dideteksi adanya

DNA L. rhamnosus yang diduga merupakan koloni L. rhamnosus SKG34,

sedangkan pada sekum tikus putih yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34,

tidak ditemukan adanya DNAL. rhamnosus.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

110 bp

1000 bp

500 bp

3000 bp

Gambar 5.4. PCR bakteri sekum perlakuan dan kontrol yang ditumbuhkan padaMRS agar dengan primer spesifikLactobacillus rhamnosus. M, Marker 100 bp;

1, Kontrol positif (L. rhamnosus SKG34); 2-7, Tikus perlakuan; 8-13, Tikus

kontrol; Tanda panah menunjukkan panjang pita (bp)

Hasil PCR menggunakan primer spesifik L.rhamnosus, menunjukkan bahwa

pada sekum tikus perlakuan yang diberikan L. rhamnosus SKG34 (2-7) dapat

dideteksi DNA yang diduga merupakan koloni L. rhamnosus SKG34

(ditunjukkan oleh pita yang terbentuk pada lajur 2-7 sama dengan pita yang

terbentuk pada lajur 1), sedangkan pada sekumtikus kontrol (8-12) tidak

terdeteksi adanya DNAL. rhamnosus SKG34 (tidak terbentuk pita sama sekali)


44/78

44

5.2 Populasi Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Anaerobpada Sekum Tikus

Putih (R. Norvegicus)

Pemberian Lactobacillus rhamnosus SKG34 sebanyak 108sel/ ml selama

3 (tiga) minggu berpengaruh terhadap populasi BAL dan total bakteri

anaerobyang tumbuh dalam sekum tikus. Populasi BAL pada sekum tikus yang

diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 4,1 x 107 cfu/g, sedangkan populasi

BAL pada sekum tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus SKG34 sebanyak 1,1 x

107 cfu /g (Lampiran 2). Populasi bakteri anaerobpada sekum tikus yang

diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 8,3 x 107 cfu /g, sedangkan populasi

bakteri anaerobpada sekum tikus yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34

sebanyak 3,7 x 109cfu /g (Lampiran 3). Pada Gambar 5.5 dapat dilihat pemberian

L. rhamnosus SKG34 mampu mengurangi pertumbuhan bakteri anaerob.

Gambar 5.5. Grafik populasi BAL dan bakteri anaerobpada sekum tikus yang

tidak diberikan L. rhamnosus SKG34 (Kontrol) dan yang diberikan

L. rhamnosus SKG34 (Perlakuan)

3,7E+09

8,3E+07

1,1E+07

4,1E+07

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

1,E+09

1,E+10

Kontrol Perlakuan

PopulasiBALdanBakteriAnaerob

padaSekum(

cfu/g)

Bakteri anaerob

BAL


45/78

45

5.3 Kadar kolesterol serum darah tikus putih (Rattus norvegicus)

Pengukuran kadar kolesterol serum tikus dilakukan dengan membuat

kurva standar terlebih dahulu. Hasil penghitungan regresis standar Lampiran 4)

menunjukkan bahwa (P


46/78

46

Gambar 5.6. Grafik uji kenormalan kadar kolesterol serum darah tikus putih

(Rattus norvegicus)

Berdasarkan grafik pengujian (Gambar 5.6) tersebut diperoleh (P = 0,147)

berarti P > 0,01, sehingga dapat dikatakan bahwa data yang dianalisis memenuhi

asumsi yaitu data menyebar secara normal (lampiran 7). Selanjutnya dilakukan

uji beda rataan untuk dua populasi saling bebas (T-Test Independent)

(Lampiran 8). Pada uji ini masing-masing menggunakan enam ekor tikus kontrol

dan enam ekor tikus perlakuan. Pemberian L. rhamnosus SKG34 secara in vivo

memberikan pengaruh yang nyata (P < 0,05) terhadap penurunan kadar kolesterol

serum darah tikus pada keadaan hiperkolesterolemia, sebesar 28,5% dibandingkan

dengan serum darah tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus SKG34.

325300275250225200175150125

kadar kolesterol akhir

0.350

0.325

0.300

0.275

0.250

0.225

0.200

0.175

0.150

0.125

0.100

absorbansiserum

R Sq Linear = 1

P = 0,147

Mean = 206,50

St Dev = 62,069

N = 12

(mg/dl)


47/78

47

Gambar 5.7. Grafik perubahan kadar kolesterol serum darah tikus yang tidak

diberikan L. rhamnosus SKG34 (Kontrol) dan yang diberikan L.

rhamnosus SKG34 (Perlakuan); huruf a dan huruf b menyatakan

berbeda nyata (P 0,05)

Dari gambar di atas dapat dilihat terjadi penurunan kadar kolesterol serum

darah tikus perlakuan yang signifikan dibandingkan dengan tikus kontrol yang

mengalami peningkatan kadar kolesterol serum darah.

Gambar 5.8. Grafik perubahan berat badan tikus yang tidak diberikan L.

rhamnosus SKG34 (Kontrol) dan yang diberikan L. rhamnosus

SKG34 (Perlakuan)

131,67

234,17

240,83

128,50

249,33

172,17

0

50

100

150

200

250

300

sebelum pemberiandiet hiperkolesterol

setelah pemberiandiet hiperkolesterol

setelah pemberian L.rhamnosus SKG34

KadarKolesterolSerumDarahTikus

(mg/dL)

Kontrol

Perlakuan

53,1

72,0

112,4

48,2

62,6

97,8

00

20

40

60

80

100

120

sebelum pemberian

diet hiperkolesterol

setelah pemberian

diet hiperkolesterol

setelah pemberian L.

rhamnosus SKG34

BeratBa

danTikus(gram

Kontrol

Perlakuan

a

b


48/78


49/78

49

BAB VI

PEMBAHASAN

6.1. Kolonisasi L.rhamnosusSKG34 pada Saluran Pencernaan Tikus Putih

(R. norvegicus)

KolonisasiL. rhamnosusSKG34 pada sekum tikus putih, dideteksi dengan

melakukan RAPD. Koloni BAL sekum yang ditumbuhkan pada media MRS agar

dipilih secara acak. Berdasarkan hasil deteksi L. rhamnosusSKG34 pada sekum

tikus putih setelah perlakuan in vivo, tidak ditemukan adanya DNA L. rhamnosus

SKG34 pada sekum tikus putih dari 10 koloni yang diambil secara acak. Akan

tetapi berdasarkan hasil PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus,

menunjukkan bahwa dalam sekum tikus perlakuan dapat dideteksi adanya DNA

L. rhamnosus. Hal ini menunjukkan L. rhamnosus SKG34 memang ada pada

sekum tikus putih, tetapi dalam populasi yang belum bias ditentukan secara pasti.

KoloniL. rhamnosusSKG34 pada sekum tikus putih tidak dapat dideteksi

dengan RAPD disebabkan karena L. rhamnosusSKG34 bukan merupakan strain

yang berasal dari saluran pencernaan sehingga kemungkinan besar L. rhamnosus

SKG34 kurang tahan terhadap kondisi lingkungan pada saluran pencernaan tikus,

tidak dapat beradhesi pada dinding saluran pencernaan, tidak mampu

berkolonisasi pada saluran pencernaan, dan L. rhamnosus SKG34 kurang dapat

berkompetisi dengan bakteri endogen yang terdapat pada saluran pencernaan. Hal

ini sesuai dengan hasil penelitian Suryadarma (2008), yang menyatakan bahwa L.

rhamnosus SKG34 kurang dapat bersaing atau berkompetisi dengan bakteri


50/78

50

endogen saluran pencernaan, karena memiliki daya adhesi yang rendah pada

enterosit, yang disebabkan karenaL. rhamnosusSKG34 tidak memiliki molekul

adhesin yang dapat mendeteksi reseptor pada permukaan enterosit yang

memungkinkan bakteri untuk dapat melekat dan membentuk kolonisasi pada

permukaan enterosit.

Mikroba yang terdapat di dalam saluran pencernaan sangat kompleks dan

merupakan komunitas yang dinamis dan terjadi persaingan hidup di antara

komunitas tersebut. Menurut Rahayu (2008), total mikroba yang terdapat dalam

saluran pencernaan diperkirakan mencapai 1012 sel setiap gram isi perut yang

terdiri atas lebih dari 1000 spesies, atau diperkirakan sekitar 3000-4000 spesies.

Beberapa genus bakteri yang hidup di saluran pencernaan antara lain :

Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Viellonella, Enterobacteria,

Enterococcus, Bacteroides, Clostridium, Eubacterium, Peptococci,

Desulfovibrios, Actinomyces, Fusobacteria, Bifidobacterium, Ruminococcus,

Peptostreptococcus, Propionibacterium, Escherichia, dan Methanobrevibacter

(Young dan Huffman, 2003; Ridlon, et al., 2006; Vernazza, et al., 2006).

Hasil pengecatan Gram yang dilakukan untuk melihat secara morfologi

keberadaan L. rhamnosus SKG34 yang ditumbuhkan pada media MRS agar,

menunjukkan adanya morfologi pertumbuhan koloni BAL positif berbentuk

batang yang mirip dengan morfologi L. rhamnosus SKG34 (Gambar 5.2).

Berdasarkan hasil ini, maka untuk lebih menegaskan keberadaan L. rhamnosus

SKG34 pada sekum tikus putih dilakukan pengujian lanjutan dengan PCR dengan

menggunakan primer spesifikL. rhamnosus.


51/78

51

Hasil PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus (Gambar 5.4),

menunjukkan bahwa dalam sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosus

SKG34 dapat dideteksi adanya DNA L. rhamnosus, sedangkan pada sekum tikus

putih yang tidak diberikanL. rhamnosusSKG34, tidak ditemukan adanya DNAL.

rhamnosus. Dari hasil penelusuran pustaka, tidak ada yang menyatakan L.

rhamnosus dapat diisolasi dari saluran pencernaan tikus. Wood dan Holzapfel

(1995) menyatakan bahwa L. rhamnosusumumnya diisolasi dari susu dan hasil

olahannya, manusia, limbah, dan bahan-bahan medis. Hal ini menunjukkan DNA

yang terdeteksi pada hasil PCR spesifik merupakan DNAL. rhamnosus SKG34

yang terdapat pada sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosusSKG34, tetapi

populasinya belum bisa ditentukan secara pasti.

6.2 Populasi Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Anaerobpada Sekum Tikus

Putih (R. norvegicus)

Populasi BAL pada tikus yang diberikanL. rhamnosusSKG34 lebih tinggi

jika dibandingkan dengan tikus yang tidak diberikan L. rhamnosusSKG34. Hal

ini diduga disebabkan oleh keberadaan L. rhamnosus SKG34 yang mampu

menciptakan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan BAL lainnya dalam

saluran pencernaan. Sehubungan dengan hal ini Vernazza et al. (2006)

menyatakan bahwa, keberadaan BAL sebagai probiotik di dalam saluran

pencernaan dapat menstimulasi populasi BAL lainnya dalam saluran pencernaan.

Hal ini disebabkan karena bakteri probiotik dapat memodifikasi lingkungan

mikroekosistem usus dengan memproduksi asam laktat, sehingga dapat

menurunkan pH. Penurunan pH akan mengakibatkan pertumbuhan BAL dalam


52/78

52

saluran pencernaan akan mengalami peningkatan. Hal ini juga didukung oleh hasil

pengecatan Gram yang dilakukan untuk mengetahui morfologi sel yang tumbuh

pada sekum tikus putih (Gambar 5.2), dimana didominasi oleh pertumbuhan sel

gram positif berbentuk batang. Setelah dilakukan pengujian dengan metode PCR

dengan menggunakan primer spesifik L. rhamnosus untuk memastikan

keberadaan L. rhamnosus SKG34, diperoleh hasil bahwa pada sekum tikus

perlakuan memang terdeteksi adanya DNAL. rhamnosus.

Populasi bakteri anaerobpada sekum tikus yang diberikan L. rhamnosus

SKG34 mengalami penurunan dibandingkan dengan populasi bakteri anaerob

pada sekum tikus yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34. Populasi bakteri

anaerobpada sekum tikus yang tidak diberikan L. rhamnosusSKG34 sebanyak

3,7 x 109 cfu/g, sedangkan populasi bakteri anaerob pada sekum tikus yang

diberikan L. rhamnosusSKG34 sebanyak 8,3 x 107cfu/g, Hal ini menunjukkan

pemberianL. rhamnosusSKG34 pada tikus perlakuan dapat menurunkan populasi

bakteri anaerob.

Penurunan pupulasi ini disebabkan karena L. rhamnosusSKG34 memiliki

kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Menurut Sujaya et

al. (2008b), L. rhamnosus SKG34 memiliki daya hambat yang luas terhadap

pertumbuhan bakteri patogen (Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella

thypimurium, dan Shigella flexneri)dengan diameter zone hambat sebesar 0,8

1,2 cm. Selain itu penurunan populasi bakteri anaerobpada tikus yang diberikan

L. rhamnosusSKG34, disebabkan oleh terjadinya penurunan pH. Penurunan pH

akan meningkatkan populasi BAL yang dapat menekan pertumbuhan bakteri


53/78

53

anaerob, selain itu penurunan pH juga dapat mengurangi populasi bakteri

patogen yang tidak tahan terhadap pH yang rendah (Vernazza et al., 2006).

Bakteri anaerob yang tumbuh di dalam saluran pencernaan terdiri atas

bakteri yang menguntungkan kesehatan (Bifidobacterium, Eubacterium, dan

Lactobacillus) dan bakteri yang dapat membahayakan kesehatan. Bakteri yang

membahayakan kesehatan, antara lain: Clostridia, Veillonella, Staphylococci,

Proteus, P. aeruginosa, Bacteroides, Eubacteria, Fusubacteria, E. coli, dan

Enterobacteria(Bourliux et al., 2003). Vernazza et al. (2006) menyatakan bahwa,

dominasi bakteriE colidan Clostridium dapat meningkatkan pengaruh patogenik,

seperti terjadinya diare akut dan proses pembusukan dalam saluran pencernaan.

Keberadaan BAL dalam saluran pencernaan dapat memodulasi saluran

pencernaan menjadi lebih stabil, mencegah pertumbuhan bakteri patogen, dan

meningkatkan sistem pertahanan tubuh terhadap penyakit (Vaughan et al., 2002).

6.3. Pengaruh Pemberian L . rhamnosus SKG34 terhadap Kadar Kolesterol

Serum Darah Tikus Putih (R. norvegicus)

Pada Gambar 5.7 dapat dilihat kadar kolesterol serum darah tikus yang

diberikan L. rhamnosus SKG34 mengalami penurunan yang signifikan,

dibandingkan dengan tikus kontrol yang mengalami peningkatan kadar kolesterol

serum darah. Pemberian L. rhamnosus SKG34 selama tiga minggu mampu

menurunkan kadar kolesterol serum darah tikus sebesar 28,5 %. Akan tetapi

pemberianL. rhamnosusSKG34 pada tikus perlakuan tidak mampu menurunkan

berat badan tikus putih. Hal ini sejalan dengan yang diungkapkan oleh

Hardiningsih dan Nurhidayat (2006), yang menyatakan bahwa pemberian


54/78

54

Lactobacillustidak dapat menurunkan pertambahan berat badan tikus putih wistar

yang diberikan diet tinggi kolesterol.

Pemberian Lactobacillus untuk menurunkan kadar kolesterol dapat

melalui beberapa mekanisme. Menurut Lee, et al. (2009), terdapat beberapa

mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL. Mekanisme pertama yaitu

produk hasil fermentasi oleh BAL menghambat sintesa kolesterol sehingga

menurunkan produksi kolesterol. Mekanisme kedua adalah melalui pembuangan

garam empedu melalui feses, dimana garam empedu yang terdekonjugasi tidak

diserap oleh usus, dan lebih mudah terbuang dari saluran pencernaan

dibandingkan dengan garam empedu yang terkonjugasi. Hal ini mengakibatkan

semakin banyak kolesterol yang dibutuhkan untuk mensintesis garam empedu lagi

sehingga akan menurunkan kadar kolesterol. Mekanisme ketiga adalah

kemampuan BAL untuk mengikat kolesterol sehingga mencegah penyerapan

kolesterol kembali ke hati (Lee, et al., 2009). Beberapa jenis BAL memiliki

dinding sel yang mampu mengikat kolesterol dalam usus halus sebelum kolesterol

diserap oleh oleh tubuh (Usman dan Hasono, 1999; Surono, 2004). Mekanisme

penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan oleh enzim Bile salt

hydrolase(BSH) yang mendekonjugasi garam empedu, dimana glisin atau taurin

dipisahkan dari steroid, sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau

terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan garam empedu terdekonjugasi dalam

bentuk asam kolat bebas yang kurang diserap oleh usus halus. Dengan demikian

garam empedu yang kembali ke hati selama sirkulasi enterohepatik menjadi

berkurang, sehingga total kolesterol dalam tubuh menjadi berkurang. Bile salt


55/78

55

hydrolase dimiliki oleh beberapa strain bakteri saluran pencernaan seperti:

Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus,

danBacteroides(Surono, 2004; Ooi dan Liong, 2010).

Penurunan kadar kolesterol serum darah tikus yang diberikan L.

rhamnosusSKG34, diduga karena adanya pengaruh produk hasil fermentasi oleh

BAL dalam sekum tikus. Hasil fermentasi oleh BAL dalam saluran pencernaan

dapat menurunkan pH, yang dapat mengakibatkan terjadinya pengendapan garam

empedu dalam saluran pencernaan, sehingga sulit untuk diserap kembali dalam

siklus enterohepatik dan akan ikut terbuang bersama feses. Hal ini mengakibatkan

semakin banyak kolesterol yang dibutuhkan untuk mensintesis garam empedu,

lagi sehingga akan menurunkan kadar kolesterol (Yulinery et al., 2006; Lee et al.,

2009). Dari hasil penelitian yang dilakukan, diperoleh hasil dengan pemberian L.

rhamnosus SKG34 dapat menurunkan pH sekum dari 6,65 menjadi 6,55

(Gambar5.9). Apabila penurunan nilai pH ini dihubungkan dengan populasi BAL

pada sekum (Gambar 5.5) dan data perubahan kadar kolesterol serum darah tikus

putih (Gambar 5.7), menunjukkan tikus yang diberikan L. rhamnosus SKG34

mengalami peningkatan populasi BAL, memiliki pH yang lebih rendah, dan

mengakibatkan penurunan kadar kolesterol yang signifikan, dibandingkan dengan

tikus yang tidak diberikanL. rhamnosusSKG34. Jadi peningkatan populasi BAL

akan menurunkan pH pada saluran pencernaan yang diduga bisa mengakibatkan

terjadinya pengendapan garam empedu, sehingga akan menurunkan kadar

kolesterol serum darah tikus yang diberikanL. rhamnosusSKG34.


56/78

56

BAB VII

SIMPULAN DAN SARAN

7.1. Simpulan

1. Populasi L. rhamnosus SKG34 dalam saluran pencernaan tikus putih (R.

norvegicus), tidak bisa ditentukan secara pasti, tetapi keberadaannya dapat

diduga dengan PCR spesifik L. rhamnosus, setalah pemberian L. rhamnosus

SKG34 sebanyak 108sel/ hari selam 3 (tiga) minggu.

2. PemberianL. rhamnosusSKG34 sebanyak 108sel/ hari selam 3 (tiga) minggu

berpengaruh terhadap populasi BAL dan total bakteri anaerobyang tumbuh

dalam saluran pencernaan tikus putih (R. norvegicus). Populasi BAL pada

sekum tikus yang diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 4,1 x 107cfu/g,

sedangkan populasi BAL pada sekum tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus

SKG34 sebanyak 1,1 x 107cfu /g. Populasi bakteri anaerobpada sekum tikus

yang diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 8,3 x 107 cfu /g, sedangkan

populasi bakteri anaerobpada sekum tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus

SKG34 sebanyak 3,7 x 109cfu /g

3. PemberianL. rhamnosusSKG34 sebanyak 10

8

sel/ hari selam 3 (tiga) minggu

berpengaruh terhadap kadar kolesterol serum darah tikus putih (R.

norvegicus), dimana terjadi penurunan kadar kolesterol serum darah yang

signifikan sebesar 28,5%.


57/78

57

7.2. Saran

1. untuk meningkatkan jumlah L. rhamnosus SKG34 yang mampu melewati

saluran pencernaan bagian atas dan mampu untuk berkompetisi pada saluran

pencernaan, perlu perlindungan yang lebih baik terhadap L. rhamnosus

SKG34 sebelum diadministrasikan secara oral gavage dengan teknik

mikroenkapsulasi.

2. untyuk pengembanganL. rhamnosusSKG34 sebagai probiotik yang potensial,

perlu dilakukan pengujian secara in vivotentang efek fungsional pemberianL.

rhamnosus SKG34 untuk mencegah alergi, mencegah konstipasi, dan

meningkatkan sisten imun.


58/78

58

DAFTAR PUSTAKA

Adams, C. 2009. Probiotics - Protection Against Infection: Using Nature's Tiny

Warriors To Stem Infection. Available at: http://probiotic.org/

lactobacillus-rhamnosus.htm.Opened : Nopember 24, 2010

Ajmal, S. and N. Ahmed. 2009. Probiotic potential of lactobacillus strains in

human infections. African Journal of Microbiology Research. 3(12):851-

855

Antarini, A. A. N. 2010. Populasi Lactobacillus rhamnosusSKG34 dalam susu

terfermentasi selama penyimpanan. Tesis S2 Program Studi BioteknologiPertanian, Universitas Udayana. Tidak dipublikasikan.

Aryantini, N P. D. 2008. Identifikasi Bifidobacterium Isolat Feses Bayi yang

Berpotensi Dikembangkan sebagai Probiotik Isolat Lokal Asli Indonesia.

Skripsi S1 Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat, Universitas

Udayana. Tidak dipublikasikan.

Baigent, C. and R. Clarke, 2008. Cholesterol and Lipids. International

Encyclopedia of Public Health,Pages 693-704, Elsevier Inc, USA

Begley, M., C. Hill, and C. G. M. Gahan. 2006. Bile Salt Hydrolase Activity in

Probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 72 (3):1729-1738.

Belviso, S., M. Giordano, P. Dolci and G. Zeppa. 2009. In vitro cholesterol-

lowering activity of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus

paracasei strains isolated from the Italian Castelmagno PDO cheese.

Dairy Sci. Technol. 89 : 169-176

Bernardeau, M., J. P. Vernoux, S. H. Dubernet, and M. Guguen. 2008. Safety

assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus.

International Journal of Food Microbiology126 : 278-285.

Betsi G. I., E. Papadavid and M.E. Falagas. 2008. Probiotics for the Treatment or

Prevention of Atopic Dermatitis: A Review of the Evidence From

Randomized Controlled Trials. Am. J. Clin. Dermatol. 9(2) : 93 - 103.

Beuers, U. and T. Pusl. 2004. Bile Salts and their Metabolism.Encyclopedia of

Biological Chemistry,Pages 159-163, Elsevier Inc, USA

Bijl, N., A. v.d. Velde, and A. K. Groen. 2009. Bile Acids and Their Role in

Cholesterol Homeostasis. Biomedical and Life Sciences -Cellular Lipid

Metabolism,Pages : 107-129
http://probiotic.org/%20lactobacillus-rhamnosus.htmhttp://probiotic.org/%20lactobacillus-rhamnosus.htmhttp://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/9780123739605http://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/9780123739605http://www.sciencedirect.com/science/journal/01681605http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235061%232008%23998739996%23696746%23FLA%23&_cdi=5061&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=11c2a343c71d4030f6030cc4bceaf902http://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/97801244

unud-320-1860003455-tesisgabung

Documents