Download - Laporan Biomol Fix
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
1/33
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar BelakangGen adalah bagian dari DNA kromosom yang mengkode satu buah molekul RNA
spesifik, yang selanjutnya mengkode untuk polipeptida tertentu. Gen tersusun dari DNA
(Deoxy-ribo Nucleic Acid). DNA bersama-sama dengan protein histon dan non histon
membentuk benang-benang kromatin yang selanjutnya menyusun kromosom. DNA
merupakan dasar secara kimiawi dari hereditas. Percobaan yang membuktikan bahwa DNA
mengandung informasi genetik, dilakukan pertama kali oleh Frederick Griffith dan co-
workers (Priyani, 2004).
Untuk mengidentifikasi keragaman DNA bakteri dapat dilakukan dengan teknik PCR.
PCR-RAPD merupakan salah satu teknik molekuler berupa penggunaan penanda tertentu
untuk mempelajari keanekaragaman genetika. Dasar analisis RAPD adalah menggunakan
mesin PCR yang mampu mengamplifikasi sekuen DNA secara in vitro(Suryanto, 2003).
Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat
keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Teknik ini berkembang setelah orang
menciptakan mesin DNA sequencer. Pada prinsipnya polimorfisme dilihat dari urutan atau
sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme. Untuk melihat
keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-rRNA bagi organisme
prokaryota atau 18S-rRNA bagi organisme eukaryota. Perbandingan sekuen rRNA
merupakan alat yang baik untuk mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi di antara
organisme bacteria, archaebacteria, dan eukaryot (Weisburg et al., 1991).
Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya
diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer
yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak
rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak
rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP
(nukleotida berbasa Adenine), dCTP (nukleotida berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida
berbasa Thymine) (Muladno, 2002).
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
2/33
2
Produk hasil PCR tersebut kemudian dipisahkan dengan elektroforesis. Selama
elektroforesis, medan listrik diterapkan sehingga DNA bermuatan negatif fragmennya
bergerak menuju elektroda positif. Kecepatan di mana suatu fragmen DNA bergerak melalui
medium berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Proses elektroforesis dapat
memisahkan produk ekstensi dengan ukuran pada satu resolusi. Metode elektroforesis mulai
berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya
penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-
molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Metode elekroforesis
telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi
dan genetika. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak
digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan (O
Vesterberg, 1993).
1.2Rumusan MasalahAdapun rumusan masalah yang kami angkat pada praktikum ini adalah bagaimana
rangkaian proses pengisolasian dan amplifikasi gen 16s rRNA dari DNA bakteri endofit?
1.3TujuanAdapun tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
a. Mengetahui cara mengisolasi DNA bakteri endofitb. Mengetahui cara mengamplifikasi DNA bakteri endofit dengan teknik PCRc. Mengetahui cara elektroforesis DNA bakteri dengan penanda 16s rRNA
1.4 Manfaat
Adapun manfaat dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
a. Dihasilkan DNA yang dapat dipakai untuk keperluan penelitian lanjutan seperti identifikasibakteri menggunakan molecular.
b. Memberikan informasi ilmiah pada mahasiswa dan masyarakat dalam bidang molekuler,khususnya isolasi DNA
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
3/33
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1Isolasi DNAAsam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-
unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA).
DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat
memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk
memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan
sintesis molekul RNA. DNA merupakan rantai rantai nukleutida yang secara kimia hampir
tidak saling berbeda, sedangkan sebaliknya protein dari campuran 20 macam amino yang sangat
berlainan, masing masing dengan sifat kimianya yang khas. Keragaman inilah yang
memungkinkan sifat kimia yang serba canggih dimiliki oleh setiap protein, dan ini diduga dapat
menjelaskan mengapa evolusi telah memilih protein daripada molekul RNA sebagai katalisator
yang terbesar reaksinya di dalam sel (Pratiwi, 2001).
DNA dapat dipisahkan menggunakan agarose. Faktor-faktor yang mempengaruhi
pergerakan DNA dalam gel adalah ukuran DNA, konsentrasi agarose, konformasi DNA,
tegangan arus listrik yang digunakan, arah pergerakan medan listrik, susunan basa DNA dan
suhu, adanya pewarnaan pada gel, dan komposisi bufer. Visualisasi (pewarnaan) pada hasil
running elektroforesis dihasilkan dengan menggunakan EtBr (Ethidium Bromide). EtBr
digunakan untuk mengurangi waktu yang diperlukan antara penyelesaian proses running dan
pengamatan hasil. Metode yang paling cocok untuk visualisasi DNA dalam gel agarosa adalah
staining dengan EtBr yang menghasilkan fluoresensi warna. EtBr dapat digunakan untuk
mendeteksi adanya asam nukleat (DNA dan RNA) baik yang single maupun double strand (
Sambrook, et al, 1990).
Isolasi DNA dilakukan berdasarkan metode standar menurut Sambrook & Russell (2001)
dari kultur Escherichia coli. DNA genom yang diperoleh kemudian diperbanyak dengan
menggunakan PCR dan dideteksi dengan elektroforesis. DNA genom kemudian dijadikan
sebagai template PCR untuk memperbanyak gen penyandi yang dituju. Pendeteksian gen
tersebut kemudian dilakukan dengan menggunakan elektroforesis. Adapun urutan teknik isolasi
DNA dapat dilihat pada Gambar 2.1 (Muttaqin, 2011).
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
4/33
4
Gambar 2.1 Teknik Isolasi DNA
Sumber:http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Calista, 2010).
2.2 Isolasi DNA Bakteri
Isolasi DNA kromosom bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenansel,
(2) perusakan dan pembuangan dinding sel, (3) lisis sel, (4) pembuangan remukan sel, serta (5)
pemisahan DNA dari protein dan RNA. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah
diinkubasi sebelumnya. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian
dielektroforesis,untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Elektroforesis merupakan
teknik biologi sel untuk analisis DNA. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya
melalui medium gel agarosa, suatu bahan semi-padat berupa polisakarida. Elektroforesis
dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul
http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/ -
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
5/33
5
pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk
molekulnya. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat, sedangkan fragmen yang berukuran lebih
besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono, 2008).
2.3Poli ymerase Chain Reaction(PCR)Rantai polimerase reaksi (PCR) adalah teknik ilmiah dalam biologi molekuler untuk
memperkuat tunggal atau beberapa salinan sepotong DNA di beberapa kali lipat, menghasilkan
ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu.
Dikembangkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, PCR sekarang teknik umum dan sering sangat
diperlukan digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai aplikasi.
Reaksi berantai polimerase dapat digunakan untuk memperkuat DNA beruntai ganda dan tunggal
kedua. Untuk melakukan PCR, orang harus tahu setidaknya sebagian dari urutan molekul DNA
target yang harus disalin. Umumnya, PCR menggunakan DNA kecil target 100-1000 pasangan
basa (bp) panjang. Ini secara teknis sulit untuk memperkuat target lebih dari 5000 bp panjang.
Sepasang primer oligonukleotida tunggal terdampar, yang memiliki urutan DNA melengkapi
daerah mengapit dari urutan target, harus disintesis. Primer yang melengkapi kedua ujung urutan
target, tetapi terletak pada untaiyang berlawanan. Primer biasanya 20-30 nukleotida panjang dan
mengikat ke wilayah mengapit komplementer pada ujung 3 ' (Rao, 2006).
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA
secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu (Wolfe, 1993). PCR
menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara
in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer
oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan diamplifikasi (Davis et al,
1994). Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase yang
digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan (Wolfe, 1993).
2.4Komponen PCRPada proses PCR selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA
polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
6/33
6
1. PrimerPrimer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi
sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan
membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang
panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah
tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000
bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi
dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
2. dNTP (deoxynucleoside tr iphosphate)dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas
4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
3. BufferBuffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar
berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
4. Ion LogamIon logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA
polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam
monovalen, kalsium (K+) (Innis, MA, et al, 1994).
2.5Tahapan ReaksiBerdasarkan Mullis, et al, 1987 setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
1. DenaturasiDenaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 90C-95c selama 30-60 detik. Pada suhu
ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu
denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi
polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.
2. AnnealingSetelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40C-60C selama 20-40
detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di
tempat yang komplemen dengan sekuen primer. Pada tahap penempelan primer (annealing),
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
7/33
7
primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada
proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan
komplemen pada template. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan
hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan
reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.
3. Ekstensi/elongasiDilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase,
biasanya 70C-72C. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang
sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP,
begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya).
Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi
bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit
untuk setiap 1000 bp. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada
sisi 3nya. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer
akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda),
sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah
jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA
sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan
menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini
akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA
polimerasepada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A
pada ujung 3 dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat
di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung
5-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
4. Pra-denaturasiDilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih
dahulu).
5. Final Elongasi
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
8/33
8
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk
memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.
Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. PCR dilakukan dengan menggunakan
mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat
sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water
bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari
satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Sekarang mesin Thermal Cycler sudah
terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan (Mullis, et al, 1987). Untuk lebih
jelasnya mengenai tahapan PCR beserta siklus termal dan proses ampifikasinya dapat dilihat
pada Gambar 2.2, Gambar 2.3 dan Gambar 2.4.
Gambar 2.2 Tahapan PCR
Sumber:http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html
Gambar 2.3. Siklus termal suhu profil untuk PCR.
http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://3.bp.blogspot.com/_r3N6PvKLvx8/Rp11pRrWuxI/AAAAAAAAAAc/aI4UHkbC6UI/s1600-h/PCR+1.JPGhttp://lh5.ggpht.com/_qqJS-uiVmpI/SgKLr1XXTgI/AAAAAAAABi0/Pt8JWTW3SF0/pcrsteps.jpg?imgmax=640http://3.bp.blogspot.com/_r3N6PvKLvx8/Rp11pRrWuxI/AAAAAAAAAAc/aI4UHkbC6UI/s1600-h/PCR+1.JPGhttp://lh5.ggpht.com/_qqJS-uiVmpI/SgKLr1XXTgI/AAAAAAAABi0/Pt8JWTW3SF0/pcrsteps.jpg?imgmax=640http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html -
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
9/33
9
Sumber:http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html
Siklus termal biasanya melibatkan tiga suhu yang berbeda yang diulang-ulang sebanyak
25-35 kali. Pada 95C, untaian DNA dipisahkan atau denaturasi. Pada 60C, primer mengikat
atau 'annealing' ke template DNA dan wilayah target yang diperkuat. Pada 72C, para polimerase
DNA memperpanjang primer dengan menyalin wilayah target menggunakan blok bangunan
tripospatedeoxynucliotide. Proses PCR dilakukan selama 3 jam dengan siklus masing-masing
mengambil 5 menit pada cyclerstermal konvensional: 1 menit masing-masing pada 94C, 60C
dan 72C dan sekitar 2 menit ramping antara tiga suhu.
Gambar 2.4. Proses amplifikasi DNA dengan reaksi berantai polimerase
Sumber:http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html
Dalam siklus setiap dua untai DNA template pertama-tamadipisahkan(terdenaturasi) oleh
panas. Sampel kemudian didinginkan kesuhu yang sesuai untuk mengikat(anneal) primer
oligonukleotida. Akhirnya suhu sampeldinaikkan ketemperatur optimal untuk polimerase DNA
dan yang meluas primer untuk menghasilkan salinan dari masing-masing untai DNA cetakan.
Untuk setiap siklus, jumlah molekul DNA (dengan urutan antara dua primer PCR) ganda.
http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://4.bp.blogspot.com/_r3N6PvKLvx8/Rp1zlhrWuwI/AAAAAAAAAAU/_-607mwl6XM/s1600-h/PCR+2.JPGhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html -
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
10/33
10
2.5ElektroforesisElektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan
partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis
berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA,
yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif
(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk
mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah
terbentuknya bandyang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-
potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings, 1994).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan
partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel,
komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin
kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel
mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat
bergerak melalui matriks tersebut (Klug & Cummings, 1994).
Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk
elektroforesis (Comb, Well, platformdan cetakan wadah gel), larutan buffer(bufferionik
danloading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel. Elektroforesis digunakan dengan
tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain
itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi
masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan
mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk
mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug &
Cummings, 1994).
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-
partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif
(anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil
elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil
amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
11/33
11
digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA
dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan
untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika,
kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika,
digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA
tertentu (Ward, 1998).
Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara
langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel
poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat
divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr),
kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet
sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga
molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul
bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari
kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii)
prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan
molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat
media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi.
Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis
digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi
berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis
berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis
mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika
diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi
kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus
ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA
akan selalu berada di dasar well; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke
dalam well, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga
dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah
bromophenol blue dan xylene cyanol. (Zumft, 1997)
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
12/33
12
2.6 Elektroforesis Gel AgaroseMetoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan
dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum
digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara
horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara
vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA
(sekuensing).
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat
pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan
larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam
medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh
ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih
cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen
DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium
bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan
kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya
dengan pita DNA standar (Mahmuddin, 2010).
2.7 16s rRNA16s rRNA merupakan salah satu penyusun subunit 30S, yang penting untuk translasi, dan
terdiri dari 1542 pasangan basa.16s rRNA adalah suatu jenis RNA yang dilibatkan dalam
produksi protein. Di antara berbagai teknik yang digunakan, RNA ribosomal paling banyak
digunakan sebagai penanda molekuler. Padaprokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu
5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Molekul
5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika,
sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang
sehingga menyulitkan analisis. Sekuens gen 16S rRNA ini dapat digunakan untuk identifikasi
bakteri yang mengalami penyimpangan strain fenotip. Berikut potongan gen pada Prokariot
beserta nama, ukuran dan lokasi terdapatnya dapat dilihat pada Tabel 1.
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
13/33
13
Tabel 1. s RNA Ribosom Pada Prokaryotik
Nama Ukuran Lokasi
5S 120
16S 1500
23S 2900
Besar
Kecil
Besar
Subunit Ribosom
Subunit Ribosom
Subunit Ribosom
Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon
filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi
evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak
keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Jika urutan basa 16S rRNA
menunjukkan derajat kesamaan yang rendah antara dua taksa, deskripsi suatu takson baru dapat
dilakukan tanpa hibridisasi DNA-DNA. Biasanya jika derajat kesamaan urutan basa gen
penyandi 16S rRNA kurang dari 97% dapat dianggap sebagai spesies baru. Analisis gen
penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena molekul ini bersifat ubikuitus,sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh kelompok. Penentuan
spesies baru pun dapat dilakukan tanpa mengisolasi mikroorganisme yang bersangkutan.
(Stackebrandt dan Goebel, 1995)Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA memungkinkan digunakan untuk
mengkonstruksi pohon filogenetik yang dapat menunjukkan nenek moyang dan hubungan
kekerabatan organisme, tetapi organisme yang sekerabat atau identik berdasarkan parameter ini
belum tentu memiliki kesamaan secara fisiologi. Hal ini disebabkan gen penyandi 16S rRNA
bukan merupakan suatu gen yang fungsional untuk kelangsungan hidup dan adaptasi prokaryota
pada lingkungan tertentu. ESC menggabungkan informasi peranan mikroorganisme dalam
lingkungannya dengan informasi genetik, berdasarkan pemikiran bahwa fenotipe merupakan
kombinasi dari ekspresi genetik dan pengaruh lingkungan. (Boddinghaus et al., 1990)
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
14/33
14
BAB III
METODE KERJA
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Hari, tanggal : Kamis, 5,12 dan 19 September 2013
Waktu : 09.30 s/d selesai
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi FPMIPA UPI
3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Isolasi DNA Bakteri
Tabel 1. Daftar Nama Alat yang Digunakan
No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1 Tabung ependorf Ukuran 1,5 ml 4
2 Centrifuge Hettigen Zentrifuge 1
3 Mikro pipet berbagai ukuran Gilson, Nesco 3
4 Lemari es - 1
5 Tips mikropipet berbagai
ukuran
- 5
6 Beaker glass - 1
7 Sendok - 1
8 Water bath EYELA NTS-1300 1
9 Vortex SIBATA TTM-1 2
10 Spidol marker Snowmann 1
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
15/33
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
16/33
16
3.2.2. Tahap PCR
Tabel 3. Daftar Nama Alat yang Digunakan
No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1 PCR - 1
3 Mikro pipet Gilson, Nesco 1
4 Tips mikropipet - 3
Gambar. Alat PCR
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)
Tabel 4. Daftar Bahan yang Digunakan
No. Nama Bahan Jumlah
1 Dream taq buffer 10x 25 l
2 dNTPs 2 mM 25 l
3 Primer forward 10 Mm 12,5 l
4 Primer reverse 10 Mm 12,5 l
5 DNA template 2,5 l
6 Dream taq polymerase 1,25 N 1,6 l
7 ddH2O 160,9 l
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
17/33
17
3.2.3. Tahap Spektrofotometer
Tabel 5. Daftar Nama Alat yang Digunakan
No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1 Spektrofotometer 1
2 Cuvet - 1
3 Mikro pipet digital Gilson, Nesco 1
4 Tips mikropipet - 3
Gambar. Spektrofotometer
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)
Tabel 6. Daftar Bahan yang Digunakan
No. Nama Bahan Jumlah
1 Sampel DNA 2,5 l
2 ddH2O Secukupnya
3 Alkohol Secukupnya
4 Kertas saring Secukupnya
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
18/33
18
3.2.4. Elektroforesis
Tabel 7. Daftar Nama Alat yang Digunakan
No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1 Elektroforesis unit Meliputi comb dan tray 1
2 Power supply - 1
3 Mikro pipet digital Gilson, Nesco 2
4 Transilluminator UV - 1
Gambar. Elektroforesis
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)
Tabel 8. Daftar Bahan yang Digunakan
No. Nama Bahan Jumlah
1 Sampel DNA 5 l
2 Buffer TE 10x (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8) 10x
3 Etidium Bromida 2 l
4 Loading dye 1 l
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
19/33
19
5 DNA Marker 2 l
6 Agarose 3 gr
7 ddH2O 3 l
3.3. Langkah Kerja
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu tahap isolasi DNA bakteri, tahap PCR,
tahap spektrofotometer serta tahap elektroforesis.
3.3.1. Isolasi DNA Bakteri
Pada praktikum isolasi DNA bakteri ini, kelompok kami menggunakan kultur bakteri
G11 dan B15. Langkah kerja yang dilakukan pertama yaitu kultur bakteri dimasukkan ke dalam
tabung eppendorf sebanyak 3 ml, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 2
menit. Supernatan yang terpisah dibuang lalu resuspensi pelet dengan 500 l TE pH 8,0 atau
NaCl 0,85%. Setelah itu ditambahkan 100 l SDS 10% kemudian dihomogenkan dengan cara
dibolak-balik secara perlahan, setelah homogen ditambahkan 10 l proteinase-K. Kemudian
diinkubasi pada waterbath dengan suhu 370C selama 1 jam, selama proses inkubasi tabung
dibolak-balik selama 15 menit sekali.
Ditambahkan NaCl 5 M sebanyak 100 l, kemudian 100 l CTAB yang telah dipanaskan
sebelumnya pada suhu 650C selama 5 menit untuk menghancurkan makromolekul sel. Kemudian
isolat DNA diinkubasi pada suhu 650C selama 20 menit. Ditambahkan 500 l Chloroform :
Isoamil alkohol untuk membantu proses denaturasi protein. Selain itu Cl berfungsi sebagai anti
buih ketika dikocok. Isolat kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.
Supernatan kemudian diambil dan ditambahkan 500 l Chloroform : Isoamil alkohol, dilanjutkan
dengan sentrifugasi kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.
Dipindahkan fasa cair dengan ujung tips yang steril ke tabung ependorf yang baru dan
ditambahkan ethanol absolut dingin sebanyak 2x volume fasa cair. Tabung ependorf digoyang
pelan lalu disimpan dalam suhu -200C selama 20 menit untuk melepas molekul air. Setelah
proses pendinginan kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan
dibuang sehingga yang tersisa hanya pelet DNA. Pelet ini kemudian ditambahkan 1 ml Ethanol
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
20/33
20
70% dingin. Setelah itu, disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit kemudian setelah
disentrifugasi supernatan dibuang dan dikeringkan selama 30 menit sampai 1 jam untuk
menguapkan sisa-sisa ethanol. Setelah itu, ditambahkan ddH2O steril untuk melarutkan DNA,
kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit. Kemudian DNA genom bakteri tersebut
disimpan pada suhu -200C.
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
21/33
21
Kultur bakteri sebanyak 3 ml dimasukkan ke tabung ependorf.
Kultur bakteri tsb. disentrifugasi kecepatan 5000 rpm, 2 menit.
Resuspensi pelet dengan 500 l TE pH 8, ditambahkan 100 l SDS10%.
Dihomogenkan, lalu ditambahkan 10 l proteinase-K
Diinkubasi 370C, 1 jam, setiap 15 menit sekali tabung dibolak-balik.
Dimasukkan 100 l NaCl 5M kemudian setelah dipanaskanditambahkan 100 l CTAB
Diinkubasi 370C, 1 jam, setiap 15 menit sekali tabung dibolak-balik.
Ditambahkan 500 l Chloroform isoamil alkohol
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
22/33
22
Gambar. Diagram Alir Isolasi DNA Bakteri
Disentrifugasi kecepatan 13000 rpm, 20 menit
Ditambahkan 500 l Chloroform isoamil alkohol, supernatandibuang.
Disentrifugasi kecepatan 13000 rpm, 5 menit
Lapisan atas dipindahkan ke tabung baru, ditambah etanolabsolut,dihomogenkan. Kemudian disimpan pada suhu -20 0C,20 menit
Ditambahkan 1 ml ethanol 70% dingin. Supernatan dibuang.
Disentrifugasi kecepatan 13000 rpm, 5 menit
Supernatan dibuang hingga tersisa pelet DNA di tabung,ditambahkan 20 l ddH2O.
Diinkubasi 37 0C, 30 menit. Kemudian disimpan pada suhu -20
0C
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
23/33
23
3.3.2. Tahap PCR
Dalam proses PCR, materi pokok berupa DNA utas ganda hasil isolasi bakteri
direaksikan dengan enzim DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), MgCl2,
dan primer (potongan pendek DNA utas tunggal, yang mengawali sintesis DNA). Setelah larutan
mix PCR tersebut homogen, larutan itu siap dimasukkan ke dalam mesin PCR. PCR yang
digunakan pada praktikum kali ini ada 2 yaitu, PCR 16 s rRNA dan PCRKetosynthase.
Dalam mesin PCR terjadi proses sintesis dan penggandaan DNA yang terdiri dari 3
tahap : Denaturation, Annealing, dan Extension. Sintesis DNA tersebut akan terus berlanjut
melalui ketiga tahapan tersebut secara berulang. Pada akhirnya akan diperoleh produk PCR
berupa sekuen DNA yang diinginkan dalam jumlah yang berlipat ganda, yakni sebanyak 2n
(n=banyaknya siklus PCR yang digunakan). Selanjutnya produk PCR yang diperoleh dapat
disimpan pada suhu 40C, sampai saatnya tiba untuk dianalisis lebih lanjut.
Pada praktikum ini digunakan dua jenis PCR yang berbeda, yaitu PCR 16 s rRNA dan
PCR Ketosynthase. Perbedaan dua jenis PCR ini pada suhu yang digunakan dalam proses mesin
PCR. Adapun urutan proses yang terjadi dalam PCR 16 s rRNA yaitu pre denaturasi pada suhu
950C selama 5 menit, lalu denaturasi pada suhu 94
0C selama 2 menit, dimana ikatan hidrogen
pada DNA lepas ketika proses ini. Setelah itu Annealing/renaturasi pada suhu 570C, 1 menit,
pada tahap annealing ini primer yang berukuran kecil mulai menempel, lalu proses sintesis DNA
pada suhu 720C selama 1 menit kemudian post PCR pada suhu 720C selama 10 menit.
Sedangkan proses PCR pada PCR ketosynthase yaitu pertama pre-denaturasi pada suhu 940C, 5
menit, lalu tahap denaturasi pada suhu 940C selama 2 menit, Annealing 51
0C selama 1 menit,
kemudian sintesis DNA 720C, 1 menit, dan terakhir tahap post PCR pada suhu 72
0C selama 7
menit.
3.3.3. Spektrofotometer
Sebelumnya mesin spektrofotometer dikalibarsi dahulu, dengan cara tabung cuvet diisi
dengan ddH2O dan dimasukkan ke dalam mesin tersebut, lalu DNA sampel uji dimasukkan ke
dalam tabung ependorf sebanyak 5l diencerkan ke dalam 500 l ddH2O. Masing-masing isolat
DNA bakteri G11 dan B15 yang telah divortex diambil sebanyak 2,5 l kemudian dimasukkan
ke dalam cuvet dan ditambahkan ddH2O, lalu bagian luar cuvet dibersihkan dengan
menggunakan alkohol dan dikeringkan perlahan dengan menggunakan kertas saring. Setelah itu
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
24/33
24
cuvet dimasukkan ke dalam spektrofotometer. Tombol paling kiri ditekan, lalu data akan keluar
dari layar spektrofotometer. Data ukuran absorbansi sampel DNA dicatat. Setelah itu, cuvet
dikeluarkan dan dibersihkan dengan alkohol. Data yang telah didapat kemudian dihitung dengan
rumus absorbansi.
3.3.4. Elektroforesis
Elektroforesis dengan agarose merupakan metode standar untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Adapun prinsip
kerja elektroforesis yaitu dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada
medium berisi tenaga listrik. Molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya.
Langkah pertama elektroforesis yaitu disiapkan tray/cetakan gel elektroforesis untuk
membuat cetakan gel. Kemudian ditutup rapat sisi-sisi yang terbuka dengan menggunakan
selotip. Gel agarose dibuat dengan konsentrasi yang dikehendaki dalam buffer TAE 1x.
Campuran tersebut didihkan hingga campuran terlihat bening atau terpolarisasi. Kemudian
agarose dibiarkan hingga suhunya hangat, lalu ditambahkan EtBr sebanyak 2 l. Setelah itu, gel
agarose dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah disiapkan, sisir dipasang dengan posisi tegak
dan berjarak 0,3 0,5 mm dari dasar. Gel dibiarkan mengeras pada suhu ruangan kemudian
disiapkan sampel DNA yang akan dielektroforesis. Sampel kemudian ditambahkan loading dye
dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye. Sampel tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel. Selanjutnya gel dimasukkan gel
ke dalam buffer dan dipasangkan alat dan disambungkan ke sumber listrik kemudian
dielektroforesis pada daya 100 volt selama 30 menit.
[DNA] = A0260 nm x 50 x Faktor pengenceran
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
25/33
25
[DNA] = A260 nm x 50 x factor
Purity = A 260 nm
A 280 nm
BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA diperoleh dari kultur bakteri dengan cara yaitu menambahkan beberapasenyawa kimia untuk membantu proses isolasi. Pada tahap pertama isolasi DNA, kultur bakteri
didestruksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, hal ini untuk membantu ekstrasi dari
komponen yang dikehendaki. Pada tahap kedua, dilakukan ekstraksi DNA dengan beberapa
senyawa kimia, yaitu CTAB dan SDS yang merupakan detergen yang dapat melisiskan dan
mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat
menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan
dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potasium
asetat-protein-debris sel. Pada tahap ketiga, dilakukan presipitasi yaitu dengan alkohol 100%
(Kusumawaty, tanpa tahun).
Pada isolasi DNA yang telah dilakukan, pada tahap akhir DNA akan menggumpal dalam
alkohol. DNA yang menggumpal tersebut diambil dan ditambahkan pelarut DNA. Hasil DNA
yang telah diperoleh kemudian disimpan pada 500C selama 5 menit agar tercampur. Setelah
diperoleh hasil diukurlah kadar kemurnian (purity) menggunakan spektrofotometer.
Kemurnian (purity) dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Berdasarkan rumus tersebut, dapat diketahui kemurnian DNA isolat B15 dan G11 yang terdapat
dalam tabel 4.1
Tabel 4.1 Hasil Purity DNA
Abs Abs Abs Result
260 nm 280 nm
B15 0,081 0,052 0,004 1,604
G11 0,135 0,098 0,028 1,853
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
26/33
26
Untuk isolat B15
nilai A 260 adalah 0,081 dan nilai A 280 adalah 0,052, dari hasil
tersebut diperoleh nilai purity DNA sebesar 1,6. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan
bahwa hasil dari isolasi DNA B15
kemurniannya kurang (hypocromicity) karena nilainya kurang
dari 1,8, hal tersebut disebabkan ada kontaminan dari protein.
Pada isolat G11
nilai A 260 adalah 0,135 dan nilai A 280 adalah 0,098, dari hasil tersebut
diperoleh nilai purity DNA sebesar 1,8. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan bahwa hasil
dari isolasi DNA B15
murni (pure) karena nilainya tepat 1,8, hal tersebut mengindikasikan tidak
terdapat kontaminan.
Setelah diketahui kemurnian DNA, dilakukan sintesis dan penggandaan DNA secara in
vivo dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Pada proses PCR ini, prinsipnya sama
dengan proses replikasi DNA dalam sel. DNA yang telah diisolasi direaksikan dengan enzim
DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), MgCl2, dan primer (potongan
pendek DNA utas tunggal, yang mengawali sintesis DNA). Setelah larutan mix PCR tersebut
homogen, larutan itu siap direaksikan dalam mesin PCR (Aryani, 2007).
Pada mesin PCR terjadi beberapa tahap yaitu ada pada bagan di bawah :
Predenaturasi Denaturasi Annealing Sintesis Post sintesis
16 s rRNA 950
C, 5 940C, 2 720C, 1 720C, 10
Ketosintase 940C, 5
940C, 2 57
0C, 1 720C, 1 720C, 10
570C, 1 4
0C
Gambar 4.1 Proses dalam mesin PCR
Pada tahap predenaturasi, adalah tahap persiapan sebelum memasuki tahap denaturasi. Pada
tahap denaturasi, DNA utas ganda akan terpisah menjadi DNA utas tunggal. Selanjutnya yaitu
annealing, dimana primer akan menempel terlebih dahulu karena ukurannya yang kecil. Tahap
sintesis DNA dapat berlangsung dengan baik maka dalam reaksi tersebut diperlukan adanya
enzim DNA polymerase, misalnya Taq (Thermus aquaticus) polymerase dan MgCl2, sementara
kebutuhan energi dan nukleotida terpenuhi dari dNTPs (terdiri dari : dTTP, dGTP, dATP dan
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
27/33
27
dCTP) (Aryani, 2007). Tahap denaturasi, annealing dan sintesis dikatakan satu siklus, siklus
untuk 16 s rRNA adalah 30 siklus dan untuk ketosintase adalah 35 siklus.
Setelah dilakukan proses PCR, untuk melihat hasil amplifikasi DNA tersebut, maka
produk PCR yang diperoleh dimigrasikan pada gel agarose (elektroforesis). Hasil elektroforesis
dapat dilihat dalam gambar di bawah ini:
Gambar 4.2. Hasil elektroforesis 16s rRNA
yang berhasil
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)
Gambar 4.3. Hasil elektroforesis Ketosintase
yang berhasil
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
28/33
28
Gambar 4.4. Hasil elektroforesis 16s rRNA
yang tidak berhasil
Gambar 4.5. Hasil elektroforesis Ketosintase
yang tidak berhasil
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)
Pada hasil elektroforesis yang berhasil, diperoleh pita-pita yang menunjukkan ukuran
fragmen DNA. Pada hasil elektroforesis ketosintase diperoleh markernya 100 bp, paling bawah
ukuranya 100 bp, yang paling atas 1000 bp dan yang satu pita ukurannya 700 bp.
Hasil elektroforesis yang telah dilakukan, tidak terdapat pita-pita tersebut yang berarti
hasil amplifikasi DNA tidak terbaca. Keberhasilan amplifikasi DNA oleh PCR dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu kualitas dan kuantitas DNA, temperatur annealing primer, kualitas dan
konsentrasi primer, konsentrasi MgCl2, dNTP, enzim DNA polymerase, dan jumlah siklus PCR
yang digunakan (Aryani, 2007).
Pada praktikum kali ini, kemungkinan kegagalannya karena kualitas dan kuantitas DNA,
dimana berdasarkan nilai purity DNA kebanyakan kurang dari 1,8, hal ini menunjukkan kualitas
DNA-nya pun tidak bagus karena terdapat kontaminan protein yang terdapat dalam DNA itu.
Untuk temperatur annealing primer, kualitas dan konsentrasi primer, konsentrasi MgCl2, dNTP,
enzim DNA polymerase, dan jumlah siklus PCR yang digunakan, para praktikan mengikuti
sesuai dengan prosedur yang telah ditentukan.
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
29/33
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
30/33
30
DAFTAR PUSTAKA
Aryani, A. (2012). Pedoman Praktikum Genetika (Isolasi DNA Skala Kecil).Bandung: Biologi
FPMIPA UPI.Boddinghaus, I., Rogall, T., Flohr, T., Blocker, H., Bottger, E.C. (1990). Detection and
identification of Mycobactera by amplification of rRNA.J. Clin. Microbiol,28: 1751-1759.
Calista, Carla Dora. (2010). DNA [online]. Tersedia: http://carladc.student.umm.ac.id. [24
Oktober 2011]
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. (1994). Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton
& Lange, Norwola: xii + 777 hlm.
Innis, MA, Gelfand, DH. (1990). Optimization of PCRs. PCR Protocols: A guide to Methodsand Applications. Academic Press Inc., New York,p 3-12
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood
cliffs: xvi + 779 hlm.
Kusumawaty, D. (2012). Pedoman Praktikum Genetika (Isolasi DNA Skala Kecil). Bandung:
Biologi FPMIPA UPI.
Mahmuddin. (2010). Elektroforesis Gel Agarosa [online]. Tersedia: http://mahmuddin. wordp
ress.com/elektroforesis-gel-agarosa/. [24 Oktober 2011]
Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE
Foundation. Bogor.
Mullis KB, Faloona FA. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed
chain reaction.Methods Enzymol,155: 335350
Muttaqin, Makhrikhul. (2011).Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen
Pyandi 16s rRNA [online]. Tersedia: http://biofin.wordpress.com/2011 /03/17/isolasi-dna-
genom-2/.[24 Oktober 2011]
O, Vesterberg. (1993). A short history of electrophoretic methods. US National Library of
Medicine National Institutes of Health, 12: 1243-9.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. http://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/
searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdf diakses tanggal 6 Oktober 2012
http://carladc.student.umm.ac.id/http://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://carladc.student.umm.ac.id/ -
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
31/33
31
Priyani, Nunuk. (2004). Sifat Fisik dan Kimia DNA [online]. Tersedia:
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf. [24 Oktober
2011]
Rao, Sridhar. (2006). Polymerase Chain Reaction [online]. Tersedia: http://www.microrao.
com/micronotes/pcr.pdf . [24 Oktober 2011]
Sambrook, L., Fritsch, and Maniatis. 1990.Molecular Cloning. CSH. USA.
Stackebrandt, E. and B.M.Goebel. (1995). A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA
sequence analysis in the present species definition in bacteriology. International Jurnal of
Systematic Bacteriology, 44: 846-849.
Ward, D.M. (1998). A natural species concepts for procaryotes. Current Opinion in
Microbiology,p 1: 271-277.
Wolfe, S.L. (1993). Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing Company,
Belmont:xviii + 1145 hlm.
Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga
Zumft, W.G. (1997). Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology and
Molecular Biology Review 61: 533-616.
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf.%20%5b24http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf.%20%5b24 -
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
32/33
32
IDENTIFIKASI GEN 16s rRNA DAN KETOSYNTHASE PADA BAKTERI
ENDOFIT
Laporan Praktikum
disusun untuk memenuhi salah satu tugas Mata Kuliah Biologi Molekuler
oleh:
Kelompok 5
Biologi C 2010
Ervi Afifah 1006470
Hanna Sari 1005275
Reisya Hudya 1002527
Trisnawati Ajeng K 1000037
PROGRAM STUDI BIOLOGI
JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2013
-
7/21/2019 Laporan Biomol Fix
33/33