laporan biomol fix

7/21/2019 Laporan Biomol Fix

1/33

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar BelakangGen adalah bagian dari DNA kromosom yang mengkode satu buah molekul RNA

spesifik, yang selanjutnya mengkode untuk polipeptida tertentu. Gen tersusun dari DNA

(Deoxy-ribo Nucleic Acid). DNA bersama-sama dengan protein histon dan non histon

membentuk benang-benang kromatin yang selanjutnya menyusun kromosom. DNA

merupakan dasar secara kimiawi dari hereditas. Percobaan yang membuktikan bahwa DNA

mengandung informasi genetik, dilakukan pertama kali oleh Frederick Griffith dan co-

workers (Priyani, 2004).

Untuk mengidentifikasi keragaman DNA bakteri dapat dilakukan dengan teknik PCR.

PCR-RAPD merupakan salah satu teknik molekuler berupa penggunaan penanda tertentu

untuk mempelajari keanekaragaman genetika. Dasar analisis RAPD adalah menggunakan

mesin PCR yang mampu mengamplifikasi sekuen DNA secara in vitro(Suryanto, 2003).

Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat

keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Teknik ini berkembang setelah orang

menciptakan mesin DNA sequencer. Pada prinsipnya polimorfisme dilihat dari urutan atau

sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme. Untuk melihat

keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-rRNA bagi organisme

prokaryota atau 18S-rRNA bagi organisme eukaryota. Perbandingan sekuen rRNA

merupakan alat yang baik untuk mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi di antara

organisme bacteria, archaebacteria, dan eukaryot (Weisburg et al., 1991).

Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya

diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer

yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak

rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak

rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP

(nukleotida berbasa Adenine), dCTP (nukleotida berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida

berbasa Thymine) (Muladno, 2002).


2/33

2

Produk hasil PCR tersebut kemudian dipisahkan dengan elektroforesis. Selama

elektroforesis, medan listrik diterapkan sehingga DNA bermuatan negatif fragmennya

bergerak menuju elektroda positif. Kecepatan di mana suatu fragmen DNA bergerak melalui

medium berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Proses elektroforesis dapat

memisahkan produk ekstensi dengan ukuran pada satu resolusi. Metode elektroforesis mulai

berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya

penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-

molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Metode elekroforesis

telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi

dan genetika. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak

digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan (O

Vesterberg, 1993).

1.2Rumusan MasalahAdapun rumusan masalah yang kami angkat pada praktikum ini adalah bagaimana

rangkaian proses pengisolasian dan amplifikasi gen 16s rRNA dari DNA bakteri endofit?

1.3TujuanAdapun tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut:

a. Mengetahui cara mengisolasi DNA bakteri endofitb. Mengetahui cara mengamplifikasi DNA bakteri endofit dengan teknik PCRc. Mengetahui cara elektroforesis DNA bakteri dengan penanda 16s rRNA

1.4 Manfaat

Adapun manfaat dari praktikum ini adalah sebagai berikut:

a. Dihasilkan DNA yang dapat dipakai untuk keperluan penelitian lanjutan seperti identifikasibakteri menggunakan molecular.

b. Memberikan informasi ilmiah pada mahasiswa dan masyarakat dalam bidang molekuler,khususnya isolasi DNA


3/33

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1Isolasi DNAAsam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-

unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA).

DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat

memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk

memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan

sintesis molekul RNA. DNA merupakan rantai rantai nukleutida yang secara kimia hampir

tidak saling berbeda, sedangkan sebaliknya protein dari campuran 20 macam amino yang sangat

berlainan, masing masing dengan sifat kimianya yang khas. Keragaman inilah yang

memungkinkan sifat kimia yang serba canggih dimiliki oleh setiap protein, dan ini diduga dapat

menjelaskan mengapa evolusi telah memilih protein daripada molekul RNA sebagai katalisator

yang terbesar reaksinya di dalam sel (Pratiwi, 2001).

DNA dapat dipisahkan menggunakan agarose. Faktor-faktor yang mempengaruhi

pergerakan DNA dalam gel adalah ukuran DNA, konsentrasi agarose, konformasi DNA,

tegangan arus listrik yang digunakan, arah pergerakan medan listrik, susunan basa DNA dan

suhu, adanya pewarnaan pada gel, dan komposisi bufer. Visualisasi (pewarnaan) pada hasil

running elektroforesis dihasilkan dengan menggunakan EtBr (Ethidium Bromide). EtBr

digunakan untuk mengurangi waktu yang diperlukan antara penyelesaian proses running dan

pengamatan hasil. Metode yang paling cocok untuk visualisasi DNA dalam gel agarosa adalah

staining dengan EtBr yang menghasilkan fluoresensi warna. EtBr dapat digunakan untuk

mendeteksi adanya asam nukleat (DNA dan RNA) baik yang single maupun double strand (

Sambrook, et al, 1990).

Isolasi DNA dilakukan berdasarkan metode standar menurut Sambrook & Russell (2001)

dari kultur Escherichia coli. DNA genom yang diperoleh kemudian diperbanyak dengan

menggunakan PCR dan dideteksi dengan elektroforesis. DNA genom kemudian dijadikan

sebagai template PCR untuk memperbanyak gen penyandi yang dituju. Pendeteksian gen

tersebut kemudian dilakukan dengan menggunakan elektroforesis. Adapun urutan teknik isolasi

DNA dapat dilihat pada Gambar 2.1 (Muttaqin, 2011).


4/33

4

Gambar 2.1 Teknik Isolasi DNA

Sumber:http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan

cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,

sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Calista, 2010).

2.2 Isolasi DNA Bakteri

Isolasi DNA kromosom bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenansel,

(2) perusakan dan pembuangan dinding sel, (3) lisis sel, (4) pembuangan remukan sel, serta (5)

pemisahan DNA dari protein dan RNA. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah

diinkubasi sebelumnya. Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian

dielektroforesis,untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Elektroforesis merupakan

teknik biologi sel untuk analisis DNA. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya

melalui medium gel agarosa, suatu bahan semi-padat berupa polisakarida. Elektroforesis

dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan

pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul
http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/http://muslimahsakura90.wordpress.com/2010/02/24/isolasi-dna/


5/33

5

pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk

molekulnya. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat, sedangkan fragmen yang berukuran lebih

besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono, 2008).

2.3Poli ymerase Chain Reaction(PCR)Rantai polimerase reaksi (PCR) adalah teknik ilmiah dalam biologi molekuler untuk

memperkuat tunggal atau beberapa salinan sepotong DNA di beberapa kali lipat, menghasilkan

ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu.

Dikembangkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, PCR sekarang teknik umum dan sering sangat

diperlukan digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai aplikasi.

Reaksi berantai polimerase dapat digunakan untuk memperkuat DNA beruntai ganda dan tunggal

kedua. Untuk melakukan PCR, orang harus tahu setidaknya sebagian dari urutan molekul DNA

target yang harus disalin. Umumnya, PCR menggunakan DNA kecil target 100-1000 pasangan

basa (bp) panjang. Ini secara teknis sulit untuk memperkuat target lebih dari 5000 bp panjang.

Sepasang primer oligonukleotida tunggal terdampar, yang memiliki urutan DNA melengkapi

daerah mengapit dari urutan target, harus disintesis. Primer yang melengkapi kedua ujung urutan

target, tetapi terletak pada untaiyang berlawanan. Primer biasanya 20-30 nukleotida panjang dan

mengikat ke wilayah mengapit komplementer pada ujung 3 ' (Rao, 2006).

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA

secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu (Wolfe, 1993). PCR

menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara

in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer

oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan diamplifikasi (Davis et al,

1994). Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase yang

digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan (Wolfe, 1993).

2.4Komponen PCRPada proses PCR selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA

polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:


6/33

6

1. PrimerPrimer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi

sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan

membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang

panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah

tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000

bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi

dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

2. dNTP (deoxynucleoside tr iphosphate)dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas

4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

3. BufferBuffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar

berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

4. Ion LogamIon logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA

polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam

monovalen, kalsium (K+) (Innis, MA, et al, 1994).

2.5Tahapan ReaksiBerdasarkan Mullis, et al, 1987 setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

1. DenaturasiDenaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 90C-95c selama 30-60 detik. Pada suhu

ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu

denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang

komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi

polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.

2. AnnealingSetelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40C-60C selama 20-40

detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di

tempat yang komplemen dengan sekuen primer. Pada tahap penempelan primer (annealing),


7/33

7

primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada

proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan

komplemen pada template. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan

hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan

reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.

3. Ekstensi/elongasiDilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase,

biasanya 70C-72C. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang

sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP,

begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya).

Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi

bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit

untuk setiap 1000 bp. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada

sisi 3nya. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer

akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda),

sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah

jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA

sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan

menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini

akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA

polimerasepada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A

pada ujung 3 dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat

di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung

5-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

4. Pra-denaturasiDilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan

mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih

dahulu).

5. Final Elongasi


8/33

8

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk

memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.

Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. PCR dilakukan dengan menggunakan

mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat

sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water

bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari

satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Sekarang mesin Thermal Cycler sudah

terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan (Mullis, et al, 1987). Untuk lebih

jelasnya mengenai tahapan PCR beserta siklus termal dan proses ampifikasinya dapat dilihat

pada Gambar 2.2, Gambar 2.3 dan Gambar 2.4.

Gambar 2.2 Tahapan PCR

Sumber:http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html

Gambar 2.3. Siklus termal suhu profil untuk PCR.
http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://3.bp.blogspot.com/_r3N6PvKLvx8/Rp11pRrWuxI/AAAAAAAAAAc/aI4UHkbC6UI/s1600-h/PCR+1.JPGhttp://lh5.ggpht.com/_qqJS-uiVmpI/SgKLr1XXTgI/AAAAAAAABi0/Pt8JWTW3SF0/pcrsteps.jpg?imgmax=640http://3.bp.blogspot.com/_r3N6PvKLvx8/Rp11pRrWuxI/AAAAAAAAAAc/aI4UHkbC6UI/s1600-h/PCR+1.JPGhttp://lh5.ggpht.com/_qqJS-uiVmpI/SgKLr1XXTgI/AAAAAAAABi0/Pt8JWTW3SF0/pcrsteps.jpg?imgmax=640http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html


9/33

9


Siklus termal biasanya melibatkan tiga suhu yang berbeda yang diulang-ulang sebanyak

25-35 kali. Pada 95C, untaian DNA dipisahkan atau denaturasi. Pada 60C, primer mengikat

atau 'annealing' ke template DNA dan wilayah target yang diperkuat. Pada 72C, para polimerase

DNA memperpanjang primer dengan menyalin wilayah target menggunakan blok bangunan

tripospatedeoxynucliotide. Proses PCR dilakukan selama 3 jam dengan siklus masing-masing

mengambil 5 menit pada cyclerstermal konvensional: 1 menit masing-masing pada 94C, 60C

dan 72C dan sekitar 2 menit ramping antara tiga suhu.

Gambar 2.4. Proses amplifikasi DNA dengan reaksi berantai polimerase


Dalam siklus setiap dua untai DNA template pertama-tamadipisahkan(terdenaturasi) oleh

panas. Sampel kemudian didinginkan kesuhu yang sesuai untuk mengikat(anneal) primer

oligonukleotida. Akhirnya suhu sampeldinaikkan ketemperatur optimal untuk polimerase DNA

dan yang meluas primer untuk menghasilkan salinan dari masing-masing untai DNA cetakan.

Untuk setiap siklus, jumlah molekul DNA (dengan urutan antara dua primer PCR) ganda.
http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://4.bp.blogspot.com/_r3N6PvKLvx8/Rp1zlhrWuwI/AAAAAAAAAAU/_-607mwl6XM/s1600-h/PCR+2.JPGhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.htmlhttp://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html


10/33

10

2.5ElektroforesisElektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan

partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis

berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA,

yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif

(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk

mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah

terbentuknya bandyang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-

potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings, 1994).

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan

partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel,

komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin

kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel

mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat

bergerak melalui matriks tersebut (Klug & Cummings, 1994).

Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk

elektroforesis (Comb, Well, platformdan cetakan wadah gel), larutan buffer(bufferionik

danloading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel. Elektroforesis digunakan dengan

tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain

itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi

masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan

mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk

mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug &

Cummings, 1994).

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-

partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif

(anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub

negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil

elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil

amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis


11/33

11

digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA

dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan

untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika,

kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika,

digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA

tertentu (Ward, 1998).

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara

langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel

poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat

divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet

sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga

molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul

bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari

kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii)

prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan

molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat

media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi.

Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis

digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi

berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis

berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis

mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika

diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi

kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA

akan selalu berada di dasar well; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke

dalam well, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga

dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah

bromophenol blue dan xylene cyanol. (Zumft, 1997)


12/33

12

2.6 Elektroforesis Gel AgaroseMetoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan

dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum

digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk

memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara

horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara

vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA

(sekuensing).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat

pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan

larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam

medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh

ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih

cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen

DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium

bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan

kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya

dengan pita DNA standar (Mahmuddin, 2010).

2.7 16s rRNA16s rRNA merupakan salah satu penyusun subunit 30S, yang penting untuk translasi, dan

terdiri dari 1542 pasangan basa.16s rRNA adalah suatu jenis RNA yang dilibatkan dalam

produksi protein. Di antara berbagai teknik yang digunakan, RNA ribosomal paling banyak

digunakan sebagai penanda molekuler. Padaprokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu

5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Molekul

5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika,

sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang

sehingga menyulitkan analisis. Sekuens gen 16S rRNA ini dapat digunakan untuk identifikasi

bakteri yang mengalami penyimpangan strain fenotip. Berikut potongan gen pada Prokariot

beserta nama, ukuran dan lokasi terdapatnya dapat dilihat pada Tabel 1.


13/33

13

Tabel 1. s RNA Ribosom Pada Prokaryotik

Nama Ukuran Lokasi

5S 120

16S 1500

23S 2900

Besar

Kecil

Besar

Subunit Ribosom

Subunit Ribosom

Subunit Ribosom

Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon

filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi

evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak

keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Jika urutan basa 16S rRNA

menunjukkan derajat kesamaan yang rendah antara dua taksa, deskripsi suatu takson baru dapat

dilakukan tanpa hibridisasi DNA-DNA. Biasanya jika derajat kesamaan urutan basa gen

penyandi 16S rRNA kurang dari 97% dapat dianggap sebagai spesies baru. Analisis gen

penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena molekul ini bersifat ubikuitus,sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh kelompok. Penentuan

spesies baru pun dapat dilakukan tanpa mengisolasi mikroorganisme yang bersangkutan.

(Stackebrandt dan Goebel, 1995)Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA memungkinkan digunakan untuk

mengkonstruksi pohon filogenetik yang dapat menunjukkan nenek moyang dan hubungan

kekerabatan organisme, tetapi organisme yang sekerabat atau identik berdasarkan parameter ini

belum tentu memiliki kesamaan secara fisiologi. Hal ini disebabkan gen penyandi 16S rRNA

bukan merupakan suatu gen yang fungsional untuk kelangsungan hidup dan adaptasi prokaryota

pada lingkungan tertentu. ESC menggabungkan informasi peranan mikroorganisme dalam

lingkungannya dengan informasi genetik, berdasarkan pemikiran bahwa fenotipe merupakan

kombinasi dari ekspresi genetik dan pengaruh lingkungan. (Boddinghaus et al., 1990)


14/33

14

BAB III

METODE KERJA

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian

Hari, tanggal : Kamis, 5,12 dan 19 September 2013

Waktu : 09.30 s/d selesai

Tempat : Laboratorium Mikrobiologi FPMIPA UPI

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Isolasi DNA Bakteri

Tabel 1. Daftar Nama Alat yang Digunakan

No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah

1 Tabung ependorf Ukuran 1,5 ml 4

2 Centrifuge Hettigen Zentrifuge 1

3 Mikro pipet berbagai ukuran Gilson, Nesco 3

4 Lemari es - 1

5 Tips mikropipet berbagai

ukuran

- 5

6 Beaker glass - 1

7 Sendok - 1

8 Water bath EYELA NTS-1300 1

9 Vortex SIBATA TTM-1 2

10 Spidol marker Snowmann 1


15/33


16/33

16

3.2.2. Tahap PCR



1 PCR - 1

3 Mikro pipet Gilson, Nesco 1

4 Tips mikropipet - 3

Gambar. Alat PCR

(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)

Tabel 4. Daftar Bahan yang Digunakan

No. Nama Bahan Jumlah

1 Dream taq buffer 10x 25 l

2 dNTPs 2 mM 25 l

3 Primer forward 10 Mm 12,5 l

4 Primer reverse 10 Mm 12,5 l

5 DNA template 2,5 l

6 Dream taq polymerase 1,25 N 1,6 l

7 ddH2O 160,9 l


17/33

17

3.2.3. Tahap Spektrofotometer



1 Spektrofotometer 1

2 Cuvet - 1

3 Mikro pipet digital Gilson, Nesco 1

4 Tips mikropipet - 3

Gambar. Spektrofotometer




1 Sampel DNA 2,5 l

2 ddH2O Secukupnya

3 Alkohol Secukupnya

4 Kertas saring Secukupnya


18/33

18

3.2.4. Elektroforesis



1 Elektroforesis unit Meliputi comb dan tray 1

2 Power supply - 1

3 Mikro pipet digital Gilson, Nesco 2

4 Transilluminator UV - 1

Gambar. Elektroforesis




1 Sampel DNA 5 l

2 Buffer TE 10x (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8) 10x

3 Etidium Bromida 2 l

4 Loading dye 1 l


19/33

19

5 DNA Marker 2 l

6 Agarose 3 gr

7 ddH2O 3 l

3.3. Langkah Kerja

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu tahap isolasi DNA bakteri, tahap PCR,

tahap spektrofotometer serta tahap elektroforesis.

3.3.1. Isolasi DNA Bakteri

Pada praktikum isolasi DNA bakteri ini, kelompok kami menggunakan kultur bakteri

G11 dan B15. Langkah kerja yang dilakukan pertama yaitu kultur bakteri dimasukkan ke dalam

tabung eppendorf sebanyak 3 ml, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 2

menit. Supernatan yang terpisah dibuang lalu resuspensi pelet dengan 500 l TE pH 8,0 atau

NaCl 0,85%. Setelah itu ditambahkan 100 l SDS 10% kemudian dihomogenkan dengan cara

dibolak-balik secara perlahan, setelah homogen ditambahkan 10 l proteinase-K. Kemudian

diinkubasi pada waterbath dengan suhu 370C selama 1 jam, selama proses inkubasi tabung

dibolak-balik selama 15 menit sekali.

Ditambahkan NaCl 5 M sebanyak 100 l, kemudian 100 l CTAB yang telah dipanaskan

sebelumnya pada suhu 650C selama 5 menit untuk menghancurkan makromolekul sel. Kemudian

isolat DNA diinkubasi pada suhu 650C selama 20 menit. Ditambahkan 500 l Chloroform :

Isoamil alkohol untuk membantu proses denaturasi protein. Selain itu Cl berfungsi sebagai anti

buih ketika dikocok. Isolat kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.

Supernatan kemudian diambil dan ditambahkan 500 l Chloroform : Isoamil alkohol, dilanjutkan

dengan sentrifugasi kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.

Dipindahkan fasa cair dengan ujung tips yang steril ke tabung ependorf yang baru dan

ditambahkan ethanol absolut dingin sebanyak 2x volume fasa cair. Tabung ependorf digoyang

pelan lalu disimpan dalam suhu -200C selama 20 menit untuk melepas molekul air. Setelah

proses pendinginan kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan

dibuang sehingga yang tersisa hanya pelet DNA. Pelet ini kemudian ditambahkan 1 ml Ethanol


20/33

20

70% dingin. Setelah itu, disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit kemudian setelah

disentrifugasi supernatan dibuang dan dikeringkan selama 30 menit sampai 1 jam untuk

menguapkan sisa-sisa ethanol. Setelah itu, ditambahkan ddH2O steril untuk melarutkan DNA,

kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit. Kemudian DNA genom bakteri tersebut

disimpan pada suhu -200C.


21/33

21

Kultur bakteri sebanyak 3 ml dimasukkan ke tabung ependorf.

Kultur bakteri tsb. disentrifugasi kecepatan 5000 rpm, 2 menit.

Resuspensi pelet dengan 500 l TE pH 8, ditambahkan 100 l SDS10%.

Dihomogenkan, lalu ditambahkan 10 l proteinase-K

Diinkubasi 370C, 1 jam, setiap 15 menit sekali tabung dibolak-balik.

Dimasukkan 100 l NaCl 5M kemudian setelah dipanaskanditambahkan 100 l CTAB

Diinkubasi 370C, 1 jam, setiap 15 menit sekali tabung dibolak-balik.

Ditambahkan 500 l Chloroform isoamil alkohol


22/33

22

Gambar. Diagram Alir Isolasi DNA Bakteri

Disentrifugasi kecepatan 13000 rpm, 20 menit

Ditambahkan 500 l Chloroform isoamil alkohol, supernatandibuang.


Lapisan atas dipindahkan ke tabung baru, ditambah etanolabsolut,dihomogenkan. Kemudian disimpan pada suhu -20 0C,20 menit

Ditambahkan 1 ml ethanol 70% dingin. Supernatan dibuang.


Supernatan dibuang hingga tersisa pelet DNA di tabung,ditambahkan 20 l ddH2O.

Diinkubasi 37 0C, 30 menit. Kemudian disimpan pada suhu -20

0C


23/33

23

3.3.2. Tahap PCR

Dalam proses PCR, materi pokok berupa DNA utas ganda hasil isolasi bakteri

direaksikan dengan enzim DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), MgCl2,

dan primer (potongan pendek DNA utas tunggal, yang mengawali sintesis DNA). Setelah larutan

mix PCR tersebut homogen, larutan itu siap dimasukkan ke dalam mesin PCR. PCR yang

digunakan pada praktikum kali ini ada 2 yaitu, PCR 16 s rRNA dan PCRKetosynthase.

Dalam mesin PCR terjadi proses sintesis dan penggandaan DNA yang terdiri dari 3

tahap : Denaturation, Annealing, dan Extension. Sintesis DNA tersebut akan terus berlanjut

melalui ketiga tahapan tersebut secara berulang. Pada akhirnya akan diperoleh produk PCR

berupa sekuen DNA yang diinginkan dalam jumlah yang berlipat ganda, yakni sebanyak 2n

(n=banyaknya siklus PCR yang digunakan). Selanjutnya produk PCR yang diperoleh dapat

disimpan pada suhu 40C, sampai saatnya tiba untuk dianalisis lebih lanjut.

Pada praktikum ini digunakan dua jenis PCR yang berbeda, yaitu PCR 16 s rRNA dan

PCR Ketosynthase. Perbedaan dua jenis PCR ini pada suhu yang digunakan dalam proses mesin

PCR. Adapun urutan proses yang terjadi dalam PCR 16 s rRNA yaitu pre denaturasi pada suhu

950C selama 5 menit, lalu denaturasi pada suhu 94

0C selama 2 menit, dimana ikatan hidrogen

pada DNA lepas ketika proses ini. Setelah itu Annealing/renaturasi pada suhu 570C, 1 menit,

pada tahap annealing ini primer yang berukuran kecil mulai menempel, lalu proses sintesis DNA

pada suhu 720C selama 1 menit kemudian post PCR pada suhu 720C selama 10 menit.

Sedangkan proses PCR pada PCR ketosynthase yaitu pertama pre-denaturasi pada suhu 940C, 5

menit, lalu tahap denaturasi pada suhu 940C selama 2 menit, Annealing 51

0C selama 1 menit,

kemudian sintesis DNA 720C, 1 menit, dan terakhir tahap post PCR pada suhu 72

0C selama 7

menit.

3.3.3. Spektrofotometer

Sebelumnya mesin spektrofotometer dikalibarsi dahulu, dengan cara tabung cuvet diisi

dengan ddH2O dan dimasukkan ke dalam mesin tersebut, lalu DNA sampel uji dimasukkan ke

dalam tabung ependorf sebanyak 5l diencerkan ke dalam 500 l ddH2O. Masing-masing isolat

DNA bakteri G11 dan B15 yang telah divortex diambil sebanyak 2,5 l kemudian dimasukkan

ke dalam cuvet dan ditambahkan ddH2O, lalu bagian luar cuvet dibersihkan dengan

menggunakan alkohol dan dikeringkan perlahan dengan menggunakan kertas saring. Setelah itu


24/33

24

cuvet dimasukkan ke dalam spektrofotometer. Tombol paling kiri ditekan, lalu data akan keluar

dari layar spektrofotometer. Data ukuran absorbansi sampel DNA dicatat. Setelah itu, cuvet

dikeluarkan dan dibersihkan dengan alkohol. Data yang telah didapat kemudian dihitung dengan

rumus absorbansi.

3.3.4. Elektroforesis

Elektroforesis dengan agarose merupakan metode standar untuk memisahkan,

mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Adapun prinsip

kerja elektroforesis yaitu dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada

medium berisi tenaga listrik. Molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau negatif

berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya.

Langkah pertama elektroforesis yaitu disiapkan tray/cetakan gel elektroforesis untuk

membuat cetakan gel. Kemudian ditutup rapat sisi-sisi yang terbuka dengan menggunakan

selotip. Gel agarose dibuat dengan konsentrasi yang dikehendaki dalam buffer TAE 1x.

Campuran tersebut didihkan hingga campuran terlihat bening atau terpolarisasi. Kemudian

agarose dibiarkan hingga suhunya hangat, lalu ditambahkan EtBr sebanyak 2 l. Setelah itu, gel

agarose dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah disiapkan, sisir dipasang dengan posisi tegak

dan berjarak 0,3 0,5 mm dari dasar. Gel dibiarkan mengeras pada suhu ruangan kemudian

disiapkan sampel DNA yang akan dielektroforesis. Sampel kemudian ditambahkan loading dye

dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye. Sampel tersebut

kemudian dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel. Selanjutnya gel dimasukkan gel

ke dalam buffer dan dipasangkan alat dan disambungkan ke sumber listrik kemudian

dielektroforesis pada daya 100 volt selama 30 menit.

[DNA] = A0260 nm x 50 x Faktor pengenceran


25/33

25

[DNA] = A260 nm x 50 x factor

Purity = A 260 nm

A 280 nm

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA diperoleh dari kultur bakteri dengan cara yaitu menambahkan beberapasenyawa kimia untuk membantu proses isolasi. Pada tahap pertama isolasi DNA, kultur bakteri

didestruksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, hal ini untuk membantu ekstrasi dari

komponen yang dikehendaki. Pada tahap kedua, dilakukan ekstraksi DNA dengan beberapa

senyawa kimia, yaitu CTAB dan SDS yang merupakan detergen yang dapat melisiskan dan

mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat

menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan

dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potasium

asetat-protein-debris sel. Pada tahap ketiga, dilakukan presipitasi yaitu dengan alkohol 100%

(Kusumawaty, tanpa tahun).

Pada isolasi DNA yang telah dilakukan, pada tahap akhir DNA akan menggumpal dalam

alkohol. DNA yang menggumpal tersebut diambil dan ditambahkan pelarut DNA. Hasil DNA

yang telah diperoleh kemudian disimpan pada 500C selama 5 menit agar tercampur. Setelah

diperoleh hasil diukurlah kadar kemurnian (purity) menggunakan spektrofotometer.

Kemurnian (purity) dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:

Berdasarkan rumus tersebut, dapat diketahui kemurnian DNA isolat B15 dan G11 yang terdapat

dalam tabel 4.1

Tabel 4.1 Hasil Purity DNA

Abs Abs Abs Result

260 nm 280 nm

B15 0,081 0,052 0,004 1,604

G11 0,135 0,098 0,028 1,853


26/33

26

Untuk isolat B15

nilai A 260 adalah 0,081 dan nilai A 280 adalah 0,052, dari hasil

tersebut diperoleh nilai purity DNA sebesar 1,6. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan

bahwa hasil dari isolasi DNA B15

kemurniannya kurang (hypocromicity) karena nilainya kurang

dari 1,8, hal tersebut disebabkan ada kontaminan dari protein.

Pada isolat G11

nilai A 260 adalah 0,135 dan nilai A 280 adalah 0,098, dari hasil tersebut

diperoleh nilai purity DNA sebesar 1,8. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan bahwa hasil

dari isolasi DNA B15

murni (pure) karena nilainya tepat 1,8, hal tersebut mengindikasikan tidak

terdapat kontaminan.

Setelah diketahui kemurnian DNA, dilakukan sintesis dan penggandaan DNA secara in

vivo dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Pada proses PCR ini, prinsipnya sama

dengan proses replikasi DNA dalam sel. DNA yang telah diisolasi direaksikan dengan enzim

DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), MgCl2, dan primer (potongan

pendek DNA utas tunggal, yang mengawali sintesis DNA). Setelah larutan mix PCR tersebut

homogen, larutan itu siap direaksikan dalam mesin PCR (Aryani, 2007).

Pada mesin PCR terjadi beberapa tahap yaitu ada pada bagan di bawah :

Predenaturasi Denaturasi Annealing Sintesis Post sintesis

16 s rRNA 950

C, 5 940C, 2 720C, 1 720C, 10

Ketosintase 940C, 5

940C, 2 57

0C, 1 720C, 1 720C, 10

570C, 1 4

0C

Gambar 4.1 Proses dalam mesin PCR

Pada tahap predenaturasi, adalah tahap persiapan sebelum memasuki tahap denaturasi. Pada

tahap denaturasi, DNA utas ganda akan terpisah menjadi DNA utas tunggal. Selanjutnya yaitu

annealing, dimana primer akan menempel terlebih dahulu karena ukurannya yang kecil. Tahap

sintesis DNA dapat berlangsung dengan baik maka dalam reaksi tersebut diperlukan adanya

enzim DNA polymerase, misalnya Taq (Thermus aquaticus) polymerase dan MgCl2, sementara

kebutuhan energi dan nukleotida terpenuhi dari dNTPs (terdiri dari : dTTP, dGTP, dATP dan


27/33

27

dCTP) (Aryani, 2007). Tahap denaturasi, annealing dan sintesis dikatakan satu siklus, siklus

untuk 16 s rRNA adalah 30 siklus dan untuk ketosintase adalah 35 siklus.

Setelah dilakukan proses PCR, untuk melihat hasil amplifikasi DNA tersebut, maka

produk PCR yang diperoleh dimigrasikan pada gel agarose (elektroforesis). Hasil elektroforesis

dapat dilihat dalam gambar di bawah ini:

Gambar 4.2. Hasil elektroforesis 16s rRNA

yang berhasil


Gambar 4.3. Hasil elektroforesis Ketosintase

yang berhasil



28/33

28

Gambar 4.4. Hasil elektroforesis 16s rRNA

yang tidak berhasil

Gambar 4.5. Hasil elektroforesis Ketosintase

yang tidak berhasil

(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2013)

Pada hasil elektroforesis yang berhasil, diperoleh pita-pita yang menunjukkan ukuran

fragmen DNA. Pada hasil elektroforesis ketosintase diperoleh markernya 100 bp, paling bawah

ukuranya 100 bp, yang paling atas 1000 bp dan yang satu pita ukurannya 700 bp.

Hasil elektroforesis yang telah dilakukan, tidak terdapat pita-pita tersebut yang berarti

hasil amplifikasi DNA tidak terbaca. Keberhasilan amplifikasi DNA oleh PCR dipengaruhi oleh

beberapa faktor yaitu kualitas dan kuantitas DNA, temperatur annealing primer, kualitas dan

konsentrasi primer, konsentrasi MgCl2, dNTP, enzim DNA polymerase, dan jumlah siklus PCR

yang digunakan (Aryani, 2007).

Pada praktikum kali ini, kemungkinan kegagalannya karena kualitas dan kuantitas DNA,

dimana berdasarkan nilai purity DNA kebanyakan kurang dari 1,8, hal ini menunjukkan kualitas

DNA-nya pun tidak bagus karena terdapat kontaminan protein yang terdapat dalam DNA itu.

Untuk temperatur annealing primer, kualitas dan konsentrasi primer, konsentrasi MgCl2, dNTP,

enzim DNA polymerase, dan jumlah siklus PCR yang digunakan, para praktikan mengikuti

sesuai dengan prosedur yang telah ditentukan.


29/33


30/33

30

DAFTAR PUSTAKA

Aryani, A. (2012). Pedoman Praktikum Genetika (Isolasi DNA Skala Kecil).Bandung: Biologi

FPMIPA UPI.Boddinghaus, I., Rogall, T., Flohr, T., Blocker, H., Bottger, E.C. (1990). Detection and

identification of Mycobactera by amplification of rRNA.J. Clin. Microbiol,28: 1751-1759.

Calista, Carla Dora. (2010). DNA [online]. Tersedia: http://carladc.student.umm.ac.id. [24

Oktober 2011]

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. (1994). Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton

& Lange, Norwola: xii + 777 hlm.

Innis, MA, Gelfand, DH. (1990). Optimization of PCRs. PCR Protocols: A guide to Methodsand Applications. Academic Press Inc., New York,p 3-12

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood

cliffs: xvi + 779 hlm.

Kusumawaty, D. (2012). Pedoman Praktikum Genetika (Isolasi DNA Skala Kecil). Bandung:

Biologi FPMIPA UPI.

Mahmuddin. (2010). Elektroforesis Gel Agarosa [online]. Tersedia: http://mahmuddin. wordp

ress.com/elektroforesis-gel-agarosa/. [24 Oktober 2011]

Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE

Foundation. Bogor.

Mullis KB, Faloona FA. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed

chain reaction.Methods Enzymol,155: 335350

Muttaqin, Makhrikhul. (2011).Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen

Pyandi 16s rRNA [online]. Tersedia: http://biofin.wordpress.com/2011 /03/17/isolasi-dna-

genom-2/.[24 Oktober 2011]

O, Vesterberg. (1993). A short history of electrophoretic methods. US National Library of

Medicine National Institutes of Health, 12: 1243-9.

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. http://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/

searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdf diakses tanggal 6 Oktober 2012
http://carladc.student.umm.ac.id/http://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://katalog.pdii.lipi.go.id/index.php/%20searchkatalog/download/Databyld/1933/1934.pdfhttp://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://biofin.wordpress.com/2011%20/03/17/isolasi-dna-genom-2/http://carladc.student.umm.ac.id/


31/33

31

Priyani, Nunuk. (2004). Sifat Fisik dan Kimia DNA [online]. Tersedia:

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf. [24 Oktober

2011]

Rao, Sridhar. (2006). Polymerase Chain Reaction [online]. Tersedia: http://www.microrao.

com/micronotes/pcr.pdf . [24 Oktober 2011]

Sambrook, L., Fritsch, and Maniatis. 1990.Molecular Cloning. CSH. USA.

Stackebrandt, E. and B.M.Goebel. (1995). A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA

sequence analysis in the present species definition in bacteriology. International Jurnal of

Systematic Bacteriology, 44: 846-849.

Ward, D.M. (1998). A natural species concepts for procaryotes. Current Opinion in

Microbiology,p 1: 271-277.

Wolfe, S.L. (1993). Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing Company,

Belmont:xviii + 1145 hlm.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga

Zumft, W.G. (1997). Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology and

Molecular Biology Review 61: 533-616.
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf.%20%5b24http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf.%20%5b24


32/33

32

IDENTIFIKASI GEN 16s rRNA DAN KETOSYNTHASE PADA BAKTERI

ENDOFIT

Laporan Praktikum

disusun untuk memenuhi salah satu tugas Mata Kuliah Biologi Molekuler

oleh:

Kelompok 5

Biologi C 2010

Ervi Afifah 1006470

Hanna Sari 1005275

Reisya Hudya 1002527

Trisnawati Ajeng K 1000037

PROGRAM STUDI BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

BANDUNG

2013


33/33

laporan biomol fix

Documents