2ª pratica-curva padrao

8/19/2019 2ª Pratica-Curva Padrao

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Fundação Centro de Ciências e Educação Superior a Distância do Estado do Rio de Janeiro

Centro de Educação Superior a Distância do Estado do Rio de Janeiro

U NIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO R IO DE JANEIRO

Licenciatura em Química

UFRJ/CEDERJ

Nome: ISABEL DA SILVA REBELLO

Matrícula: 12214070079

E-mail: [email protected]

Telefone: (21) 2717-5081

Polo: SÃO GONÇALO Curso: QUÍMICA

Cidade em que reside: NITERÓI

R ELATÓRIO: PRÁTICA II

DISCIPLINA: QUÍMICA V


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2ª Prática: Cinética Enzimática

INTRODUÇÃO:

A cinética enzimática estuda as reacções químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a

velocidade de reacção. O estudo da cinética de uma enzima permite elucidar os pormenores do

seu mecanismo catalítico, o seu papel no metabolismo, como é controlada a sua atividade na

célula e como pode ser inibida a sua atividade por drogas ou venenos, ou potenciada por outro

tipo de moléculas.

As enzimas são macromoléculas com a capacidade de manipular outras moléculas,

denominadas substratos. Um substrato pode unir-se ao centro catalítico da enzima que o

reconheça e transformar-se num produto ao longo de uma série de passos denominados

mecanismo enzimático. Algumas enzimas podem unir vários substratos diferentes e/ou libertar

diversos produtos, como é o caso das proteases ao romper uma proteína em dois polipéptidos.

Em outros casos, produz-se a união simultânea de dois substratos, como no caso da DNA

polimerase, que é capaz de incorporar um nucleótido (substrato 1) a uma cadeia de ADN

(substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa série de passos,

também podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda areacção. Este passo limitante pode consistir numa reacção química ou numa mudança de forma

da enzima ou do substrato.

O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas é útil na interpretação dos dados

cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto

durante a catálise, que mudanças de forma ocorrem durante a reacção, ou mesmo o papel em

particular de determinados aminoácidos no mecanismo catalítico. Algumas enzimas modificam

a sua forma significativamente durante a reacção, em cujo caso pode ser crucial saber a estruturamolecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se análogos que se unem mas

não permitem levar a cabo a reacção e mantêm a enzima permanentemente na forma de

substrato unido).

Os mecanismos enzimáticos podem ser divididos em mecanismos de substrato único e

mecanismos de múltiplos substratos. Os estudos cinéticos com enzimas que apenas unem um

substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o

substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una

enzima que une vários substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cinética enzimática pode

mostrar também a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos.

https://pt.wikipedia.org/wiki/Reac%C3%A7%C3%A3o_qu%C3%ADmicahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_qu%C3%ADmicahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismohttps://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Inibidor_enzim%C3%A1ticohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Drogahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Venenohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Macromol%C3%A9culahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Substratohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Produtohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Proteasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Polip%C3%A9ptidohttps://pt.wikipedia.org/wiki/ADN_polimerasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/ADN_polimerasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tidohttps://pt.wikipedia.org/wiki/ADNhttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Triose-fosfato_isomerasehttps://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Afinidade&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/wiki/Velocidadehttps://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Di-hidrofolato_redutase&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Di-hidrofolato_redutase&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/wiki/Velocidadehttps://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Afinidade&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/wiki/Triose-fosfato_isomerasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisehttps://pt.wikipedia.org/wiki/ADNhttps://pt.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tidohttps://pt.wikipedia.org/wiki/ADN_polimerasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/ADN_polimerasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Polip%C3%A9ptidohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Proteasehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Produtohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Substratohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Macromol%C3%A9culahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Venenohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Drogahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Inibidor_enzim%C3%A1ticohttps://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_qu%C3%ADmicahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Reac%C3%A7%C3%A3o_qu%C3%ADmica


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Nem todas as catálises biológicas são efectuadas por enzimas proteicas. Existem moléculas

catalíticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing

alternativo e a tradução do ARNm, respectivamente. A principal diferença entre as ribozimas e

os ribossomas radica no limitado número de reacções que as primeiras podem efectuar, embora

os seus mecanismos de reacção e as suas cinéticas possam ser estudados e classificados pelos

mesmos métodos.

A velocidade de reacção aumenta com a concentração do substrato, eventualmente ficando

a enzima saturada a altas concentrações de substrato.

A reacção catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a

mesma quantidade de produto que uma reação não catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de

catálise, as enzimas não alteram em absoluto o equilíbrio da reacção entre substrato e produto.Ao contrário do que acontece noutras reacções químicas, as enzimas saturam-se. Isto significa

que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalíticos estarão ocupados, o que

incrementará a eficiência da reacção, até ao momento em que todos os sítios possíveis estejam

ocupados. Nesse momento ter-se-á alcançado o ponto de saturação da enzima e, embora se

adicione mais substrato, não aumentará mais a eficiência.

As duas propriedades cinéticas mais importantes de uma enzima são: o tempo que demora

a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto máximo de saturação. Oconhecimento destas propriedades torna possível formular hipóteses sobre o comportamento de

uma enzima no ambiente celular e prever como responderá frente a mudanças nessas condições.

Cinética de Michaelis – Menten

Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato

(abcissas) e a velocidade de reacção (ordenadas).

As reacções catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica

uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reacção é medida

https://pt.wikipedia.org/wiki/ARNhttps://pt.wikipedia.org/wiki/Ribozimahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Ribossomahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Splicing_alternativohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Splicing_alternativohttps://pt.wikipedia.org/wiki/ARNmhttps://pt.wikipedia.org/wiki/Reac%C3%A7%C3%A3ohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Substratohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Equil%C3%ADbrio_qu%C3%ADmicohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Satura%C3%A7%C3%A3ohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Michaelis-Menten_saturation_curve_of_an_enzyme_reaction.svghttps://pt.wikipedia.org/wiki/Satura%C3%A7%C3%A3ohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Equil%C3%ADbrio_qu%C3%ADmicohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisehttps://pt.wikipedia.org/wiki/Substratohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Reac%C3%A7%C3%A3ohttps://pt.wikipedia.org/wiki/ARNmhttps://pt.wikipedia.org/wiki/Splicing_alternativohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Splicing_alternativohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Ribossomahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Ribozimahttps://pt.wikipedia.org/wiki/ARN


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sobre uma escala de concentrações de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reacção

(v) aumenta com o acréscimo de [S]. Todavia, à medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e

a velocidade atinge o valor máximo Vmax.

No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reacção mono-substrato existe uma

reacção bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES.

Embora o mecanismo enzimático para a reacção unimolecular possa ser

bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que

se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k 2.

(Eq. 1).

k 2 também é designado como k cat ou turnover, o valor máximo de reacções enzimáticas

catalisadas por segundo.

Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a

forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E],

mudando o equilíbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reacção depende da

concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S]. Todavia, com altos

valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES.

Nestas condições, a velocidade (v≈k 2[E]tot=Vmax) é insensível a pequenas alterações de [S];

assim, [E]tot é a concentração total enzimática

que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação.

A equação de Michaelis – Menten descreve como a velocidade de reacção v depende da

posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k 2. Michaelis e Menten

mostraram que se k 2 for bem menor que k -1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-

se a seguinte equação:

(Eq. 2)

Esta equação de Michaelis-Menten é a base da maior parte da cinética enzimática mono-

substrato.

A constante de Michaelis K m é definida como a concentração para a qual a velocidade

da reacção enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir K m = [S] na equação

de Michaelis-Menten. Se o passo de determinação da velocidade for lento, quando comparado

com a dissociação do substrato (k 2


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aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja

relativamente rara.

A situação mais normal dá-se quando k 2 > k -1 na por vezes chamada cinética de Briggs-

Haldane. A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação

ao estado estacionário. Durante o período inicial, a velocidade de reacção v é relativamente

constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante (cf. equação 1):

Assim, a concentração [ES] é dada pela fórmula

em que a constante de Michaelis K m é definida por

([E] é a concentração de enzima livre). Em conjunto, a fórmula geral para a velocidade de

reacção v vem pela equação de Michaelis-Menten:

A constante de especificidade é uma medida da eficiência de conversão pela

enzima do substrato em produto. Usando a definição da constante de Michaelis , a equação

escreve-se na forma

sendo [E] a concentração de enzima livre. Assim, a constante de especificidade é um modo

eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres na reacção comsubstrato livre para formação de produto. A constante de especificidade é limitada pela

frequência com que o substrato e a enzima se encontram na solução, podendo atingir 1010 M−1

s−1. Esta taxa máxima é amplamente não dependente da dimensão do substrato ou da enzima.

A razão entre constantes de especificidade para dois substratos é uma comparação quantitativa

da eficiência da enzima na conversão dos substratos. O declive do gráfico de Michaelis-Menten

com baixa concentração de substrato [S] (i.e. [S]


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O gráfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recíproco mostra o significado dos pontos

de intercepção entre a recta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade.O gráfico de velocidade face a [S] mostrado anteriormente não é linear. Embora a baixas

concentrações de substrato se mantenha linear, vai curvando à medida que aumenta a

concentração de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar

regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difícil estimar os valores

de K m e Vmax nos gráficos não lineares. Isto deu lugar a que vários investigadores concentrassem

os seus esforços em desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis-Menten,

dando como resultado o gráfico de Lineweaver-Burke, o diagrama de Eadie-Hofstee e o gráficode Hanes-Woolf. Com o seguinte tutorial da cinética de Michaelis-Menten realizado na

Universidade de Virgínia, pode-se simular o comportamento de uma enzima variando as

constantes cinéticas.

O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a forma mais

comum, e simples,de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser a mais fiável. Para tal,

tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten. Como se

pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representação é uma linha recta cujaequação é e = mx + c, sendo o ponto de intercepção entre a recta e o eixo das ordenadas

equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepção entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -

1/K m.

Evidentemente não se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mínimo valor

possível é 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de substrato, e daí 1/v =

1/Vmax. O valor do ponto de intercepção entre a recta e o eixo x é uma extrapolação de dados

experimentais obtidos em laboratório. Geralmente, os gráficos de Lineweaver-Burke distorcem

https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Diagrama_de_Lineweaver-Burke&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/wiki/Regress%C3%A3o_n%C3%A3o_linearhttps://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Diagrama_de_Lineweaver-Burke&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Diagrama_de_Eadie-Hofstee&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/wiki/Inverso_multiplicativohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Extrapola%C3%A7%C3%A3ohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Lineweaver-Burke_plot.PNGhttps://pt.wikipedia.org/wiki/Extrapola%C3%A7%C3%A3ohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Inverso_multiplicativohttps://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Diagrama_de_Eadie-Hofstee&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Diagrama_de_Lineweaver-Burke&action=edit&redlink=1https://pt.wikipedia.org/wiki/Regress%C3%A3o_n%C3%A3o_linearhttps://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Diagrama_de_Lineweaver-Burke&action=edit&redlink=1


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as medidas realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a estimativas

não muito exactas de Vmax e de K m. Um modelo linear muito mais exato é o diagrama de Eadie-

Hofstee, mas nas investigações científicas actuais, todo este tipo de linearizações tornou-se

obsoleto e foi substituído por métodos mais fiáveis baseados na análise de regressão não linear.

Para analisar os dados é conveniente a normalização dos mesmos, já que isto pode ajudar à

diminuição da quantidade de trabalho experimental a realizar e incremento da fiabilidade da

análise.

Importância prática das constantes cinéticas

O estudo da cinética enzimática é importante por duas razões principais. Em primeiro

lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o

comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinéticas acima definidas, K m e Vmax, são críticas na compreensão do modo de funcionamento conjunto das enzimas para

controlar o metabolismo.

O objetivo desta prática e ilustrar os conceitos básicos da cinética enzimática , o estudo dos

fatores que determinam as velocidades de uma reação catalisada por uma enzima.

PROCEDIMENTOS:

1° Experimento: Efeito da Concentração de enzima na velocidade inicial da reação:

Protocolo de Dosagem de Áçucar Redutores.

Numerar 5 tubos e proceder de acordo com a tabela:

tubo tampão Enzima Sacarose AbsmL mL mL

I-1 0,6 0 0,4 0,065

I-2 0,5 0,1 0,4 0,209

I-3 0,4 0,2 0,4 0,297

I-4 0,3 0,3 0,4 0,377

I-5 0,2 0,4 0,4 0,406

https://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismo


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2° Experimento: Determinação das velocidades da reação em função da concentração de

substrato:


tubo tampão Enzima Sacarose Abs

mL mL mL média

II-1 0,8 0,2 0 0,035

II-2 0,7 0,2 0,1 0,279

II-3 0,6 0,2 0,2 0,461

II-4 0,5 0,2 0,3 0,543

II-5 0,4 0,2 0,4 0,74

II-6 0,3 0,2 0,5 0,807

3° Experimento: Determinação da curva padrão:


tubo tampão Enzima Sacarose Abs

mL mL mL média

II-1 1 0 0 0

III-2 0,9 0,1 0,5 0,107

III-3 0,8 0,2 1 0,219

III-4 0,7 0,3 1,5 0,283

III-5 0,6 0,4 2 0,372

III-6 0,5 0,5 2,5 0,561

III-7 0,4 0,6 3 0,683

III-8 0,3 0,7 3,5 0,76

III-9 0,2 0,8 4 0,859

III-10 0,1 0,9 4,5 1,045


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RESULTADOS E DISCUSSÕES:

1º Construção da Curva Padrão :

tubo Sacarose Abs

mL média

II-1 0 0

III-2 0,5 0,107

III-3 1 0,219

III-4 1,5 0,283

III-5 2 0,372

III-6 2,5 0,561

III-7 3 0,683

III-8 3,5 0,76

III-9 4 0,859

III-10 4,5 1,045

y = 0,2274x - 0,0228

R² = 0,9911

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1 2 3 4 5

A B S

[ ] de sacarose hidrolisada (mmols/mL)

Curva Padrão


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2º Gráfico da velocidade inicial da reação em função do volume de enzima:

I-1 f(x)= 0,227x-0,023

0,065 = 0,227x – 0,023

0,088= 0,227x

X= 0,387

I-2 f(x)= 0,227x-0,023

0,209 = 0,227x – 0,023

0,232= 0,227x

X= 1,022

I-3 f(x)= 0,227x-0,023

0,297= 0,227x – 0,023

0,320= 0,227x

X= 1,410

I-4 f(x)= 0,227x-0,0230,377 = 0,227x – 0,023

0,400= 0,227x

X= 1,762

I-5 f(x)= 0,227x-0,023

0,406 = 0,227x – 0,023

0,429 = 0,227xX= 1,890

tubo Enzima Abs Sacarose

mL mol/mL

I-1 0 0,065 0,387x10-3

I-2 0,1 0,209 1,022x 10-3

I-3 0,2 0,297 1,410x10-3

I-4 0,3 0,377 1,762x10

-3

I-5 0,4 0,406 1,890x10-3


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tubo Enzima Velocidade

mL 10-³mol/mL

I-1 0 0,0387

I-2 0,1 0,1022

I-3 0,2 0,141

I-4 0,3 0,1762

I-5 0,4 0,189

tubo 1/V Conc

I-1 0 0

I-2 10 9,78

I-3 5 7,09

I-4 3,3 5,68

I-5 2,5 5,29

Cálculos:

I-2 1/V= 1/0.1=10

I-3 1/0,2= 5

I-4 1/0,3=3,3

I-5 1/0,4=2,5

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 V e l o c i d a d e ( 1 0 - 3 m o l s / m L / m i n )

Volume da Enzima (mL)

Velocidade da reação em função da

quantidade de enzima


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3º Gráfico da velocidade inicial da reação em função do volume de substrato:

tubo Sacarose Abs

mL médiaII-1 0 0,035

II-2 0,1 0,279

II-3 0,2 0,461

II-4 0,3 0,543

II-5 0,4 0,74

II-6 0,5 0,807

tubo mM Sutrato

mL

II-1 0 0

II-2 20 0,1

II-3 40 0,2

II-4 60 0,3

II-5 80 0,4II-6 100 0,5

y = 3,342ln(x) + 1,9284

R² = 0,9824

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12

1 / V ( 1 0 - 3 m o l s / m l / m i n

volume da enzima (ml)

Velocidade da reação em função da quantidade

de enzima


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tubo mM Velocidade

II-1 0 0

II-2 20 0,133

II-3 40 0,213

II-4 60 0,249

II-5 80 0,335

II-6 100 0,365

tubo 1/V 1/Conc

II-1 0 0

II-2 0,05 7,52

II-3 0,025 4,69

II-4 0,017 4,02

II-5 0,0125 2,99

II-6 0,01 2,74

y = 0,1443ln(x) - 0,3114

R² = 0,958

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 20 40 60 80 100 120

V e l o c i d a d e ( 1 0 - 3 m o l s / m

L / m i n

Conc.(mM) sacarose

velocidade de reação x quantidade de substrato


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Cálculos

M1V1 = Mf Vf

0,2 . 0,1 = Mf .1

Mf = 0,02 mol/L = 20mM

M1V1 = Mf Vf

0,2 . 0,2 = Mf .1

Mf = 0,04 mol/L = 40 mM

M1V1 = Mf Vf

0,2 . 0,3 = Mf .1

Mf = 0,06 mol/L = 60mM

M1V1 = Mf Vf

0,2 . 0,4 = Mf .1

Mf = 0,08 mol/L = 80mM

M1V1 = Mf Vf

0,2 . 0,5 = Mf .1

Mf = 0,10 mol/L = 100mM

y = 2,9792ln(x) + 16,158

R² = 0,9718

0

2

4

6

8

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

1 / V

1/Conc mM

velocidade de reação x quantidade de

substrato


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Y= ax-b

0,279 = 0,2274x – 0,0228

0,3018 = 0,2274

X =0,3018

0,2274

X= 1,33 mol/L

V=1,33

10 = 0,133 mol/L/min

0,461= 0,2274x – 0,0228

0,4838 = 0,2274

X =0,4838

0,2274

X= 2,13 mol/L

V=2,13

10 = 0,213 mol/L/min

0,543 = 0,2274x – 0,0228

0,5658 = 0,2274

X =0,5658

0,2274

X= 2,49 mol/L

V=2,49

10 = 0,249 mol/L/min

0,740= 0,2274x – 0,0228

0,7628 = 0,2274

X =0,7628

0,2274

X= 3,35 mol/L

V=3,35

10 = 0,335 mol/L/min

0,807 = 0,2274x – 0,0228

0,8298 = 0,2274

X =8298

0,2274

X= 3,65 mol/LV=

3,65

10 = 0,365 mol/L/min


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Observa-se então que um aumento na concentração de enzimas leva a um aumento na

velocidade da reação. Contudo, o aumento nessa velocidade é gradualmente menor em

concentrações cada vez maiores de substrato (ROSKOSKI, 1997, p. 54). Desta forma, essa

afirmação explica os resultados obtidos já que se observa uma relação entre a concentração de

substrato e a velocidade da reação enzimática. Esse tipo de relação pode ser expressa

quantitativamente através da equação de Michaelis e Menten que relaciona a velocidade da

reação enzimática com duas constantes cinéticas:

1. Velocidade máxima (Vmax) – que indica que a velocidade se aproxima como um valor limite de

acordo com o aumento da concentração;

2.

Constante de Michaelis-Menten (Km) – que é a concentração de substrato para a metade davelocidade máxima.

Assim, a equação de Michaelis-Mentem é expressa da seguinte forma:

V = _Vmax [S]_

Km + [S]

Essa equação é muito importante, uma vez que constitui um instrumento para que se possa

compreender as reações enzimáticas.

Vmáx e Km só podem ser calculados quando V0 é medida em função de váriasconcentrações de substrato. E para tal determinação é necessário que com estes valores proceda-

se com uma transformação matemática denominada Lineweaver-Bürk ou Duplo-recíproco, que

consiste em inverter os dois lados da equação de Michaelis-Menten, dando origem a um gráfico

de 1/V versus 1/[S], que é uma função do primeiro grau. A vantagem deste método é a

determinação acurada de Vmáx e Km. Outra característica do duplo recíproco é que quando a

reta intercepta o eixo y tem-se o valor de 1/Vmáx e quando a reta intercepta o eixo x tem-se o

valor de -1/Km.Como já comentado, os valores de 1/Vmáx e -1/Km são definidos nos pontos de

interseção da reta com os eixos y e x, respectivamente. Ou seja, quando x tiver valor igual a

zero, a reta estará interceptando o eixo y e vice-versa. A partir deste princípio, é possível

determinar 1/Vmáx e -1/Km pela equação da reta do gráfico acima. E, conseqüentemente, os

valores de Vmáx e Km.

O gráfico dos duplos recíprocos permite a determinação precisa de Km e Vmáx já que

na extrapolação dos dados experimentais, chega-se a uma situação em que 1/V0=1/Vmáx

quando 1/[S] = 0. Ou seja, quando a concentração de substrato for muito alta.


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Km é uma medida da afinidade da enzima pelo substrato. Estabelecendo-se os seguintes

parâmetros: Km ALTO = BAIXA afinidade e Km BAIXO = ALTA afinidade. A determinação

da influencia de substrato pode ser realizada apenas se as condições de temperatura ótima, pH

ótimo e concentração de enzima forem mantidas. É importante ressaltar que a formação de

produto é diretamente proporcional a concentração de substrato, e que a velocidade de catálise

só será independente da mesma , se esta estiver em excesso. Pois em baixas concentrações de

substrato a velocidade de reação é de primeira ordem, em outras palavras, proporcional a

concentração de substrato. Já quando esta está em excesso a velocidade de reação é de ordem

zero, mantêm-se constante e passa a independer da concentração de substrato.

CONCLUSÃO

Nota-se uma eficiência catalítica admirável das enzimas devido ao seu alto grau de

especificidade por seus substratos, acelerando reações químicas específicas. Observa-se que

tais reações ocorrem em condições necessárias para que ocorra uma boa atividade da enzima, já que elas funcionam em condições suaves de temperatura e pH. Pôde-se verificar também que

a velocidade da reação enzimática está relacionada com a concentração do substrato e que

através da equação de Michaelis-Menten é possível descrever o comportamento cinético de

grande maioria das enzimas.

REFERÊNCIAS

CAMPBELL, Mary K. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2000.

HOLME, David J; PECK, Hazel. Bioquímica Analítica. Zaragoza, Espanha: Editorial

Acribia, 1987.

LEHNINGHER, Arthur. et al. Princípios de Bioquímica. 2 ed. São Paulo: Sarvier

Editora, 1995.

ROSCOSKI, Robert. Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1997.

2ª pratica-curva padrao

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