isolasi bahan alam laut

7/23/2019 Isolasi Bahan Alam Laut

http://slidepdf.com/reader/full/isolasi-bahan-alam-laut 1/38

ISOLASI BAHAN ALAM LAUT

Organisme laut memberikan sejumlah senyawa kimia beragam yang telah evolusioner

Terpilih untuk memodulasi jalur biokimia. Banyak kelompok-kelompok industri dan akademis

mengakses sumber ini menggunakan platform teknologi canggih. Tujuan dari bab ini adalah

untuk memberikan beberapa petunjuk praktis dalam proses ekstraksi dan isolasi bahan alam

laut. perhatian khusus diberikan kepada prosedur isolasi yang disesuaikan dengan karakteristik

fisik dan kimia dari senyawa-senyawa yang terisolasi. Kemajuan terbaru dalam teknologi

isolasi, termasuk otomatisasi dan integrasi langsung menjelaskan pemikiran yang tinggi tentang

system skrining.

Kata kunci : Produk alami laut; Koleksi inverterata laut; ekstraksi; !raksinasi;

"emurnian; isolasi; Kromato#ra!i; !raksinasi otomatis; HPL$%SP& cou"lin#'

I' Penda(uluan

Organisme laut telah berevolusi mendiami suatu daerah baru berbagai relung

ekologi. ntuk mengatasi berbagai habitat, mereka telah mengembangkan beragam jalur

metabolik sekunder yang menghasilkan sejumlah besar gugus kimia untuk

mengakomodasi gaya hidup mereka. !enyawa ini mencakup berbagai macam kelas

kimia, termasuk terpen, shikimat, polyketida, acetoginins, peptida, alkaloid, dan banyak

struktur tidak teridentifikasi dan tidak terkarakterisasi. "alam sepuluh tahun terakhir

saja, struktur lebih dari #$$$ produk alami laut telah diterbitkan . Banyak dari senyawa

ini telah membuktikan potensi mereka dalam beberapa bidang, terutama sebagai agen

terapeutik yang potensial untuk berbagai penyakit. !epuluh tahun yang lalu, pemurnian

hampir semua produk alami adalah suatu usaha yang sangat besar. !ebagai akibat dari

kemajuan teknologi, proses ini telah hampir menjadi rutin. !elain itu, kecenderungan

pemisahan yang lebih cepat dan otomatis telah menghasilkan minat secara meluas,

terutama dalam bidang industri farmasi.

Beberapa ulasan %&& ' &() telah membahas teknik-teknik yang terlibat dalam

isolasi bahan alam laut. Bab ini disusun untuk menyoroti rintangan ditemui dalam

proses isolasi, dan teknologi yang paling terbaru serta strategi diaplikasikan baik pada

timbangan laboratorium dan industrial. *amun, rincian lebih lanjut tentang dasar



kromatografi teori dan aplikasi yang dapat ditemukan di Bab (-+. Bagian terakhir dalam

bab ini ditujukan untuk diskusi tentang fraksinasi otomatis dan integrasi langsung ke

dalam sistem penyaringan %T!) tinggi-throughput. atatan dengan informasi yang lebih

spesifik pada topik-topik tertentu juga disediakan mana dipandang perlu untuk bantuan

lebih lanjut kepada pembaca tertarik.

.&. /intangan dalam isolasi dari produk alami laut

Beberapa faktor-faktor yang dapat menyulitkan isolasi bahan alam laut telah

didiskusikan secara rinci dalam review di isolasi bahan alam laut oleh 0my 1right

%&(). Kami menekankan kembali beberapa faktor selain orang lain yang mungkin

menambah tantangan tambahan untuk proses pemisahan.

.&.&. Taksonomi ketidakpastian taksonomi informasi dapat memfasilitasi pencarian

2iterature

"ilaporkan dihasilkan oleh spesies di bawah penyelidikan dan tentu saja

metode pemurnian senyawa. ni memiliki beberapa dampak pada pemilihan

skema pemurnian terbaik bagi metabolit baru. identifikasi Taksonomi Kelautan

organisme menantang, dan tugas-tugas taksonomi yang benar atau tidak lengkap

dapat menyebabkan kesulitan jika asumsi yang dibuat hampir kimia yang

mungkin mengandung suatu organisme. 3enggunaan kemotaksonomi untuk

memprediksi jenis senyawa yang organisme mungkin berisi tidak selalu sukses.

.&.4. Kuantitas kecil 5etabolit

Kehadiran metabolit sangat ampuh dalam jumlah jejak dapat mempersulit

proses ekstraksi dan isolasi. !ejumlah besar dari 6#( menurut oussen dan

7aspars, organisme diperlukan untuk isolasi metabolit aktif pada tingkat yang

dapat memudahkan penjelasan struktur berikutnya %lihat Bab. &8).

!alah satu contoh adalah isolasi hanya &$,8 mg yang sangat ampuh

antitumor macrolide spongistatin ( %9br. &) dari sekitar 4,# ton dari 0frika !elatan

spons laut !pirastrella spinispirulifera. ji untuk mengurangi biomassa spons.



3ada satu titik dalam usaha ini, perlu untuk menggunakan kolom chomatography

cair kinerja tinggi %32) yang panjangnya hampir 6 m dan berdiameter &# cm.

ontoh lain adalah isolasi hampir & mg peptida dolastatin &$ sangat penting

sebagai antitumor %:ig. 4). ampir 4 ton kelinci laut Dolabella auricularia

dikumpulkan dari 3ulau 5auritius di !amudra india. 2angkah koleksi yang

diperlukan lebih dari &$ tahun. ara termudah untuk isolasi terlibat sekitar 4$.$$$

pecahan dan 46 beberapa terpisah kromatografi langkah menggunakan berbagai

teknik. !elanjutnya, itu menjadi jelas bahwa peptida dolastatin &$ mungkin

diproduksi oleh cyanobacterium yang tumbuh di Dolabella auricularia.

.&.6. Ketidakstabilan metabolit

;kstrak laut mungkin mengandung senyawa yang sangat labil.

"ekomposisi dari senyawa ini dapat terjadi pada setiap langkah selama proses

pemurnian. 3anas, cahaya, udara, dan p adalah faktor-faktor lain yang dapat

menyebabkan degradasi senyawa. Bahan yang digunakan untuk pemisahan juga

dapat mengaktifkan beberapa reaksi. alumina dapat mengkatalisasi Kondensasi

aldol, penataan ulang, reaksi hidrasi dan dehidrasi, sementara silika dapat

meningkatkan oksidasi, penataan ulang dan * dan O demethylation. Beberapa

lainnya seperti aseton, metanol %5eO), etilena glikol, dan dimethylformamide

%"5:) dapat menimbulkan hasil adisi. !ifat asam beberapa pelarut *5/

%misalnya, "l6) dapat menyebabkan degradasi sangat sensitif terhadap p

senyawa.

.&.(. 3emurnian senyawa yang larut air < pengaruh air tinggi dan garam konten

0da banyak kesulitan yang terkait dengan isolasi dan pemurnian senyawa-

senyawa yang larut dalam air . Karena senyawa target sangat polar, media air atau

pelarut polar sangat seperti 5eO harus digunakan untuk ekstraksi. "alam kasus

larutan, masalah yang pasti terjadi adalah pertumbuhan bakteri dan jamur, yang

sering mendegradasi komponen aktif atau memberikan hasil palsu dalam uji

hayati karena endoto=ins yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Konsentrasi

larutan ekstrak juga menciptakan masalah karena suhu tinggi pada saat



penguapan air. !elain itu, ekstrak cair sering mengandung agen surface-active.

surfaktan ini dapat menyebabkan berbusa dan membentur selama proses

konsentrasi. Kelimpahan garam yang dibawa dari air laut ke ekstrak cair membuat

proses isolasi lebih sulit. "alam kebanyakan kasus, ekstraksi dan fraksinasi

senyawa-senyawa yang larut dalam air memerlukan penggunaan penyangga.

!truktur dolastatin &$. 5enurut oussen dan 7asparssolutions. *amun,

pemisahan penyangga garam dari senyawa bukanlah tugas yang mudah.

.&.#. !enyawa yang kekurangan > Kromofor

ltraviolet %>) deteksi adalah teknik deteksi untuk analisis 32

produk alami karena kemudahan penggunaan dan sensitivitas tinggi. *amun,

satu kekurangan > "etektor adalah ketidakmampuan untuk mendeteksi senyawa

yang kurang > chromophores. !elain itu, beberapa pelarut yang digunakan

dalam kromatografi fase normal itu sendiri kuat dari cahaya >, yang berarti

bahwa pengaturan panjang gelombang detektor tidak mungkin rendah %2ihat tabel

# untuk nilai-nilai cutoff > pelarut yang berbeda).

ndeks bias %/) detektor adalah, sampai baru-baru ini, hanya tersedia

alternatif untuk deteksi >. *amun, / detektor jauh lebih sensitif dan terbatas

elusi isokratik. ;lusi gradient melibatkan pencampuran pelarut / yang berbeda,

sehingga menimbulkan garis besar yang melintas. Kelemahan ini membuat

deteksi sangat sulit pada konsentrasi rendah dari metabolit nonchromophoric.

.&.?. Biaya dan waktu efektivitas

!ampai saat ini, pemurnian produk alami laut adalah memakan waktu, dan

mahal. 3erkembangan terakhir di T! telah menciptakan hambatan baru untuk

penemuan obat dari alam. !ebuah supply dengan sejumlah besar strukturalmenarik sampel konsentrasi cukup adalah suatu keharusan untuk mengoperasikan

sistem T! secara optimal. ntegrasi 3erpustakaan produk alami laut ke sistem

T! adalah, tidak begitu lama dan sama sekali tidak layak.

II' Kromato#ra!i



Bagian ini memberikan gambaran singkat tentang teknik kromatografi berbeda

yang umumnya diterapkan dalam isolasi bahan alam laut. gambaran singkat tentang

sifat-sifat yang paling umum digunakan pelarut dan fase stationer juga disertakan.

3emisahan tergantung pada afinitas komponen terhadap fase diam dan fase gerak.

5enurut sifat fase gerak, kromatografi dapat diklasifikasikan menjadi

kromatografi gas %9), kromatografi cair %2) dan superkritis cairan kromatografi

%!:). 9 dan !: adalah teknik analisis yang digunakan secara luas tetapi tidak dapat

digunakan untuk persediaan isolasi bahan alam, dan tidak dibahas dalam bab ini. 2,

namun, secara luas digunakan dan datang dalam berbagai bentuk.

a. Klasifikasi 2

2 dapat diklasifikasikan dalam beberapa cara %4&)<

&. Klasifikasi menurut modus operasi.

Kromatografi dapat dilakukan dalam empat bentuk utama< countercurrent

kromatografi %), kromatografi lapis tipis %T2), ekstraksi solid-fase %!3;)

dan Kromatografi kolom %2ihat 4.6 subpos., untuk rincian).

4. Berdasarkan metode pemisahan %:ig. 6) ada lima mekanisme dengan pemisahan

yang dapat terjadi dan lebih dari satu mungkin bertanggung jawab selama

pemisahan tertentu. 5ode ini pemisahan yang dibahas di sini.

.&.&. 0dsorpsi

Kromatografi adsorpsi berdasarkan kemampuan molekul @at terlarut

secara fisik berinteraksi dengan fase diam %lihat juga Bab. #) .suatu sifat interaksi

dapatdilihat dari ikatan hidrogen, van der 1aals, atau dipol-dipol. !emakin kuat

interaksi, semakin lama @at terlarut akan dipertahankan pada fase diam.



3ilihan yang tidak tepat fase diam dapat menyebabkan adsorpsi ireversibel

@at terlarut ke kemasan material, atau setidaknya pemulihan yang sangat buruk.

!elain itu, molekul fase gerak bersaing dengan molekul @at terlarut untuk situs

adsorpsi. semakin sangat fase gerak berinteraksi dengan adsorben, semakin cepat

@at terlarut akan dielusi. Karena @at terlarut harus berinteraksi dengan stasioner

fase yang akan terserap, semakin besar luas permukaan yang ditawarkan oleh

stasioner fase, semakin besar jumlah kemungkinan interaksi. "engan demikian,

adsorben yang menawarkan rasio tinggi luas permukaan untuk kemasan >olume

menimbulkan pemisahan yang lebih baik. 2uas permukaan adalah fungsi dari

ukuran partikel, pori ukuran, dan tingkat porositas. !emakin kecil ukuran partikel

adsorben, semakin tinggi luas permukaan yang akan tersedia. 3artikel yang sangat

kecil ukuran umumnya hanya disediakan untuk 32, karena mereka

menimbulkan substansial tekanan balik ketika dilewatkan melalui fase gerak.



3orositas partikel mencerminkan rasio volume pori-pori permukaan untuk

total volume partikel. !enyawa lebih besar dari ukuran pori tidak akan mengikat

efisien karena mereka tidak akan dapat menembus pori-pori. ntungnya, ukuran

pori dapat sangat bervariasi dari kira-kira #$nm untuk makroskopis kuran.

Tabel & berisi informasi terperinci mengenai yang paling umum digunakan

adsorben.

.&.4. 3artisi

Kromatografi partisi didasarkan pada kemampuan @at terlarut untuk

mendistribusikan antara dua fase cair. 3aling umum, fase diam cair secara kimia

terikat pada pendukung inert, misalnya, berpori gel silika untuk memberikan AA

fase berikat. AA ni melibatkan pembentukan hydrolytically stabil obligasi, antara

kelompok silanol permukaan dukungan silika dan chlorosilane a. !ilan biasanya

membawa sebuah gugus fungsional organik dan ini berada di 0kibatnya, fase

diam cair %4&).

Besar ligan organo-silan tidak bisa bereaksi dengan semua kelompok

silanol tersedia karena halangan sterik. Kelompok silanol yang tidak bereaksi

dapat mengganggu proses pemisahan dan menghasilkan efek yang tidak

diinginkan seperti reaksi, adsorpsi, tailing, dan sebagainya. ntuk meminimalkan

interaksi sekunder, fase terikat biasanya mengalami reaksi AA endcapping AA di mana

silanols sisa yang termetilasi, biasanya dengan trimetilsilil %T5!) kelompok.

Oleh karena itu, ukuran pori dari gel silika dan jumlah fasa cair atau fungsional

kelompok terikat pada silika dan tingkat endcapping antara faktor yang harus

dipertimbangkan dalam pemilihan tahap berikat yang tepat. Beberapa dari sifat-

sifat umum digunakan fase terikat dirangkum dalam



Tabel &

:ase stasioner mumnya "igunakan di 0dsorpsi Kromatografi

0dsorban atatan

!ilica :ase normal %fase diam lebih polar daripada

fase gerak).

!enyawa polar dipertahankan sementara yang

nonpolar

tidak.

3elarut polar memiliki kekuatan elusi yang

lebih baik.

Tidak bisa digunakan dengan pelarut air

dengan air

menonaktifkan permukaan.

2arut pada nilai p lebih tinggi dari 8,$.

/eaktif-beberapa produk alami yang tidak

stabil di atasnya.

0lumina :ase normal.Bentuk asam, basa, dan netral yang tersedia

menjadi

digunakan dalam pemisahan asam, basa, dan

senyawa yang relatif nonpolar, masing-masing.

ukup reaktif.

!tyrene'divinyl ben@ene polymer

:ase terbalik %fase diam kurang polar

dibandingkan

fase gerak).

!tabil pada p rendah dan tinggi.

Kurang reaktif %masalah karena terkena silanol

kelompok dihindari).

5emiliki kapasitas yang lebih tinggi untuk



senyawa polar daripada &

karena persentase karbon yang lebih tinggi.

5emberikan resolusi lebih rendah dari &

karena yang

ukuran manik yang lebih besar.

dealnya digunakan untuk desalting dan

adsorpsi-elusi

produk alami dari ekstrak air.

2ebih ekonomis daripada &.

Brominasi membuat polimer lebih kuat.

:ase stasioner mumnya "igunakan di

0dsorpsi Kromatografi

:ase Berikat mum "igunakan di 5arine

solasi Bahan 0lam

:ase terbalik %pelarut umum adalah air, 5eO,

asetonitril, dan T:).Cang paling kuat untuk nonpolar %hidrofobik)

senyawa.

!enyawa yang dielusi dalam rangka

peningkatan

hidrofobik %air adalah eluen terlemah).

Beberapa produsen menawarkan O"! yang

dapat mentolerir up

untuk p &$.$

*amun, cairan juga dapat bertindak sebagai fase diam bahkan ketika itu tidak

terikat dukungan, seperti dalam kasus %lihat Bab. 8).



.&.4.&. /;09;*T! O*-30/*9 "0* ;:;K 3

!enyawa ion yang sangat mudah larut dalam air juga dapat dipisahkan

dengan menggunakan fasa diam nonpolar, misalnya, oktadesil silika. al ini

dapat dicapai dengan mengubah p fase gerak untuk menekan ionisasi senyawa

sehingga mereka dapat dipertahankan sebagai spesies netral pada permukaan

hidrofobik dari fase diam. ara alternatif adalah dengan menambahkan reagen

pasangan-ion sesuai dengan fase gerak. /eagen pasangan-ion adalah senyawa

biasanya ionik yang mengandung menanamkan rantai hidrokarbon hidrofobik.

5ereka dapat bertindak baik dengan berinteraksi dengan sampel, membentuk

sepasang ion netral reversibel yang dapat dipertahankan pada stasioner fase, atau

dengan berinteraksi dengan fase diam melalui bagian hidrofobik, membentuk fase

diam dengan kelompok-kelompok yang dibebankan pada yang senyawa ion dapat

mengikat secara reversibel %4&). 0sam trifluoroasetat %T:0), pentafluoropropionic

0sam %3:30), dan asam eptafluorobutyric %B0) adalah contoh dari anion

reagen pasangan-ion sementara trietilamina %T;0) adalah contoh dari kationik

sebuah satu. Keuntungan tambahan dari T:0 dan T;0 termasuk volatilitas tinggi

%memungkinkan untuk penghapusan cepat) dan kompatibilitas dengan

spektrometri massa analisis %44) %lihat atatan 4).

Tabel 4

:ase Berikat mum "igunakan di 5arine solasi Bahan 0lam

:ase stasioner atatan

& %Octadecyl)a :ase terbalik %pelarut umum adalah air,

5eO,

asetonitril, dan T:).

Cang paling kuat untuk nonpolar

%hidrofobik)

senyawa.

!enyawa yang dielusi dalam rangka



peningkatan

hidrofobik %air adalah eluen terlemah).

Beberapa produsen menawarkan O"! yang

dapat mentolerir up

untuk p &$.$

%Octyl)a :ase terbalik.

!elektivitas 5irip dengan & tapi kurang

kuat.

3h %3henyl-he=yl) :ase terbalik.

!enyawa aromatik dipertahankan lagi.

* yanopropyl Bisa digunakan dalam mode normal dan

fase terbalik.

!edikit polar. !elektivitas yang unik untuk

polar

senyawa.

.&.6. 3ertukaran ion

Kromatografi penukar ion %;) berlaku untuk pemisahan spesies atau

komponen yang terionisasi pada p tertentu ion %lihat Bab. ?). al ini umumnya

digunakan dalam pemurnian peptida karena hampir semua ini makromolekul

membawa muatan permukaan memungkinkan untuk adsorpsi mereka ke

dukungan yang solid. Keuntungan dari teknik ini adalah kenyataan bahwa biologi

Kegiatan hampir selalu dipertahankan karena komposisi ponsel-fase biasanya

berair %44). "i sisi lain, penggunaan teknik ini sering memperkenalkan sejumlah

besar garam penyangga anorganik dan dengan demikian memerlukan langkah

desalting berikutnya. :ase diam terdiri dari partikel tidak larut dalam air bantalan

kovalen terikat muatan positif atau negatif kelompok fungsional. ion lawan gratis

dari muatan yang berlawanan terkait dengan kelompok-kelompok fungsional ini.

!pesies ion dalam sampel dapat bertukar dengan ion lawan ini dan mengikat ke



fase stasioner. 3emisahan dicapai karena perbedaan dalam afinitas komponen

ionik terhadap fase diam. untuk lebih rincian tentang mekanisme proses

pertukaran ion, pembaca harus berkonsultasi dengan ulasan yang sangat otoritatif

yang ditulis oleh laude "ufresne.

.&.6.&. "ukungan matriks

"ukungan matriks yang membentuk partikel stasioner fase dapat resin

polystyrene, polimer karbohidrat, atau gel silika. !ifat dukungan matriks memiliki

dampak pada karakteristik aliran kolom ini, porositas dari stasioner fase partikel,

dan ketahanan terhadap mekanik tekanan. *amun, batas pengecualian %ukuran

pori) yang diberikan oleh produsen 3erlu dicatat, karena molekul lebih besar dari

batas-batas ini akan tidak mengikat efisien untuk fase diam karena pori mereka

yang terbatas aksesibilitas. Tabel 6 meringkas sifat fisikokimia dari yang paling

umum matriks dukungan ;.

.&.6.4. Kelompok fungsional

Kelompok fungsional yang melekat pada dukungan matriks bisa positif

atau bermuatan negatif untuk memberikan anion- atau kation-tukar kromatografi,

masing-masing. 7umlah kelompok fungsional ini per satuan volume dari matriks

menentukan kapasitas kolom. 3Ka nilai fungsional kelompok menentukan

kekuatan e=changer. "alam kromatografi pertukaran anion, ionisasi penuh terjadi

pada nilai p 4,$ unit di bawah pKa sementara netralisasi penuh terjadi pada nilai

p 4,$ unit di atas pKa.

Tabel 6

5atriks dukungan di ;

5atriks atatan

!tyrene-divinil ben@ena polimer 3ermukaan hidrofobik.

Kaku, menawarkan kekuatan mekanik yang



sangat baik.

"apat mentolerir kisaran p &,$-&(,$.

"apat berinteraksi dengan %teradsorpsi) @at

terlarut yang mengarah ke

pemulihan yang buruk. ni disebut

AA nteraksi backbone AA.

polimer karbohidrat ontohnya adalah silang dekstran dan

agarosa silang.

5embengkak mudah dalam air

menghasilkan gel yang

memiliki sifat aliran yang sangat baik.

Tidak menunjukkan interaksi backbone.

idrofilik, tidak menyebabkan denaturasi

protein.

silika gel Tidak membengkak dalam air.

5enawarkan ukuran-cocok partikel yang

sangat kecil untuk 32.

Tidak stabil pada p di atas 8,#.

!ebaliknya adalah benar untuk kromatografi kation-tukar. *ilai pKa untuk

berbagai kelompok fungsional digunakan dalam ; ditunjukkan pada Tabel (.

al ini dapat terlihat bahwa penukar kuat dibebankan selama rentang p penuh,

sementara penukar yang lemah hanya dikenakan biaya pada rentang p yang

terbatas. 3Ka *ilai analit harus dipertimbangkan juga. 0sam organik yang negatif

dibebankan pada saat p larutan berada di atas asam ini pKa, dan amina

bermuatan positif pada p di bawah nilai dasar ini pKa. *amun, p fase gerak

harus memfasilitasi ionisasi kedua sorben kelompok fungsional dan analit. 3erlu

dicatat bahwa penukar ion hanya lemah harus digunakan untuk menangkap

spesies yang kuat ion %misalnya, asam sulfonat dan amina kuaterner).

Tabel (



Kelompok :ungsional dalam ;

Kelompok fungsi atatan

0sam sulfonat %-!O6)

0sam karboksilat %-O4)

0mina Kuarter %-*/6D)

0mina tersier %-*/4)

Kuat kationik-pKa E&

2emah kationik-pKa :: (-#

Kuat anionik-pKaF &6

2emah anionik-pKa ::

al ini karena pemulihan analit tersebut sering rendah pada ion kuat

e=changer karena ketidakmampuan untuk menetralkan amina kuaterner atau

gugus asam sulfonat baik pada sorben atau analit. "i sisi lain tangan, analit yang

mengandung amina lemah atau gugus asam karboksilat dapat diekstraksi dengan

baik penukar ion lemah atau kuat, seperti pengaturan p dapat digunakan untuk

menetralkan muatan pada analit untuk membawa elusi %4(). *amun, penukar ion

lemah umumnya lebih disukai di alam kerja produk, elusi dapat dicapai melalui

ringan, tak rusak kondisi.

.&.6.6.on lawan dan kekuatan ion

on lawan dalam matriks dan fase gerak menyaingi sampel ion untuk situs

mengikat dikenakan di permukaan sorben. Oleh karena itu, kehadiran ion lawan

yang memiliki afinitas yang lebih besar untuk sorben dari analit atau adanya

konsentrasi tinggi %kekuatan ionik) dari hampir ion lawan pun bisa menghalangi

pengikatan analit ke fase stasioner %4(). 0nion dapat peringkat menurut afinitas

mereka untuk pertukaran anion matriks sebagai berikut <

hidroksida Efluoride Easetat EbikarbonatG format Eklorida E:osfatG garam sitrat



"engan cara yang sama, kation dapat peringkat dalam hal afinitas mereka

untuk penukar kation sebagai berikut <

lithium Ehidrogen Enatrium Eamonium Ekalium Emagnesium Ekalsium

!ebagai aturan umum, retensi analit difasilitasi oleh memuat sampel dalam

buffer kekuatan ion rendah yang terdiri dari afinitas rendah atau ion lawan

displacer lemah pada p yang tepat. ;lusi dipromosikan oleh garam kekuatan ion

tinggi dan buffer yang mengandung ion lawan displacer kuat dan H atau dengan

mengubah p untuk sepenuhnya menetralisir kelompok dibebankan di kedua

sorben atau analit.

.&.6.(. 3ertukaran ion

"alam kebanyakan penukar ion, kelompok fungsional tetap langsung pada

permukaan matriks. anya sejumlah kelompok ionik dapat melekat karena

permukaan bagian terbatas dari matriks. dengan tentakel 6?( oussen dan 7aspars

ion e=changer, namun, kelompok penukar kovalen berlabuh ke matriks melalui

rantai polimer linier. Oleh karena itu, kapasitas tukar dapat meningkat secara

signifikan. Keuntungan lain adalah bahwa penukar ion tentakel tidak

menunjukkan interaksi backbone sebagai matriks stasioner Tahap tersembunyi.

Oleh karena itu, penukar ion tentakel jauh lebih cocok untuk pemisahan molekul

protein besar di mana risiko denaturasi dan hilangnya aktivitas biologis yang

signifikan.

.&.(. kuran 3engecualian

Kromatografi ukuran eksklusi %!;), juga dikenal sebagai filtrasi gel atau

gel permeasi kromatografi, memisahkan molekul-molekul berdasarkan mereka

ukuran molekul %lihat Bab. #). :ase diam terdiri partikel berpori dimana ukuran

pori secara ketat dikontrol. !ebagai fase gerak mengalir di atas dan melalui

partikel-partikel ini, ia membawa bersama dengan itu @at terlarut itu, tergantung

pada ukuran dan bentuk mereka, dapat mengalir ke dalam dan keluar dari pori-

pori. 5olekul lebih besar dari ukuran pori tidak bisa masuk ke pori-pori dan elusi



bersama-sama sebagai puncak pertama dalam kromatogram, fenomena yang

disebut AA 3engecualian total. 5olekul yang lebih kecil yang bisa masuk ke pori-

pori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel yang tergantung pada

molekul Aukuran dan bentuk. 5olekul yang berbeda, karena itu, memiliki jumlah

angkutan yang berbeda kali melalui kolom. Bagian dari kromatogram disebut

selektif wilayah permeasi. 5olekul-molekul terkecil dapat menembus pori-pori

terkecil sehingga memiliki waktu tinggal terpanjang pada kolom dan mengelusi

bersama sebagai puncak terakhir dalam kromatogram. 3uncak terakhir ini

menentukan batas permeasi keseluruhan. !; adalah teknik banyak digunakan

untuk pemisahan peptida dan protein karena kondisi elusi keras tidak diperlukan.

!elain itu dapat digunakan dengan sukses untuk desalting. ICang paling umum

digunakan sorbents ukuran-pengecualian adalah gel polyde=tran, mis, !ephade=J

diproduksi oleh 3harmacia. 9el ini tersedia secara komersial dalam bentuk

manik-manik, yang harus tenggelam dalam fase gerak untuk beberapa jam

sebelum digunakan untuk memungkinkan pembengkakan berlangsung. !ephade=

diproduksi oleh ikatan silang dari dekstran dengan epiklorohidrin dan tersedia

dalam berbagai kelas dengan ukuran pori yang berbeda %lihat Bab. #). !ephade= 9

gel hidrofilik dan penggunaannya terbatas pada berair solusi. "engan demikian,

mereka ideal untuk fraksionasi campuran yang larut dalam air. 5eskipun modus

utama mereka pemisahan adalah filtrasi gel, adsorpsi tambahan mekanisme

mungkin ada, sehingga menimbulkan resolusi yang baik. !ephade= 2-4$ adalah

hydro=ypropylated 9-4#. 3engenalan kelompok hidroksipropil tidak mengubah

jumlah gugus hidroksil tapi meningkatkan rasio karbon untuk hidroksil. /esultan

gel memiliki, oleh karena itu, baik hidrofilik dan lipofilik properti.

2ipofilisitasnya tambahan memungkinkan gel ini untuk digunakan dengan pelarut

berair. !ephade= 2-4$ umumnya digunakan untuk fraksinasi produk alami

organik larut. ketika pelarut tunggal digunakan, pemisahan terutama terjadi

dengan filtrasi gel modus. Ketika campuran pelarut yang digunakan, gel akan

mengambil sebagian besar komponen polar dari campuran pelarut. al ini

menghasilkan dua fase sistem dengan fasa diam dan mobile komposisi yang

berbeda. 3emisahan kemudian terjadi berdasarkan partisi dan ukuran eksklusi.



terbaik fraksinasi biasanya diperoleh ketika campuran polar dan nonpolar pelarut

yang digunakan. !elain itu, harus dipertimbangkan bahwa fenolik, heteroatomic,

dan siklik !enyawa istimewa tertahan gel !ephade= terutama ketika alkohol

rendah digunakan sebagai pelarut eluting. !enyawa ini biasanya tinggal lagi pada

gel dari yang diharapkan berdasarkan ukuran mereka. !ephade= gel cukup inert,

sehingga pemulihan sampel biasanya sangat baik. 5ereka stabil di semua pelarut,

yang tidak asam kuat %misalnya, di bawah p 4.$), dan tidak mengandung @at

pengoksidasi kuat. "i sisi lain, gel ini rentan terhadap serangan jamur dan bakteri.

kelemahan lainnya termasuk waktu elusi yang lama dan resolusi relatif rendah. itu

diperpanjang kali operasional terutama karena kebutuhan untuk panjang kolom

sempit dan laju aliran lambat untuk efek resolusi yang memadai. !orbents lain

untuk eksklusi ukuran telah dikembangkan menggunakan berbeda jenis matriks,

misalnya, stirena-divinil ben@ena polimer dan gel silika. Kedua matriks

menawarkan kekuatan mekanik yang baik dan dapat digunakan dalam 32

modus. !ilica gel yang digunakan di !; benar-benar endcapped untuk

meminimalkan spesifik interaksi. al ini stabil di kisaran p 4,$-8,#. !tyrene-

divinil ben@ena polimer, bagaimanapun, menawarkan lebih luas p rentang

stabilitas tetapi menunjukkan efisiensi yang lebih rendah daripada silika. !;

memiliki kapasitas muat yang rendah dalam hal massa sampel dan volume

sampel. !ampel harus terkonsentrasi ke tetapi tidak melampaui titik curah hujan

untuk kinerja optimal.

.&.#. 0finitas biologi

Kromatografi afinitas jauh lebih spesifik daripada pemurnian lainnya

teknik. al ini bergantung pada persiapan matriks yang kompleks bunga, dan

sebaiknya hanya senyawa ini, akan mengikat secara reversibel. itu matriks

biasanya manik-manik agarosa %!epharose atau Bio9el 0), poliakrilamida

%misalnya, Bio9el 3), dekstran silang %misalnya, !ephacryl), atau silica gel yang

ligan biospecific %antibodi, en@im, atau protein reseptor) telah kovalen. 2igan

amobil berinteraksi hanya dengan molekul yang selektif dapat mengikat untuk itu.

!enyawa lain dalam sampel, tidak mampu dari biospecific mengikat, yang hanyut.



!enyawa ditahan bisa pulih dengan mengubah p dan H atau komposisi

penyangga untuk mengganggu interaksi solut-ligan. !ebuah teknik elusi alternatif

melibatkan penambahan agen kompetitif yang dapat bersaing dengan @at terlarut

yang menarik untuk situs pengikatan spesifik pada kolom. beberapa ligan

mungkin memiliki afinitas kepada sekelompok @at terkait daripada tunggal satu

dan dapat digunakan untuk memurnikan beberapa @at.Terlepas dari selektivitas

yang tinggi, kromatografi afinitas tidak sering diterapkan pada isolasi hasil alam

laut. al ini terutama karena Teknik ini sangat mahal. Banyak kesulitan yang

dihadapi dalam pemilihan ligan yang sesuai dan persiapan fase diam. 2igan harus

menunjukkan afinitas pengikatan spesifik dan reversibel untuk substansi yang

akan dimurnikan. al ini juga harus memiliki kelompok kimia dimodifikasi yang

memungkinkan untuk melekat pada matriks tanpa merusak mengikat aktivitas.

!elain itu, hubungan kovalen digunakan untuk melumpuhkan ligan harus stabil di

segala kondisi yang digunakan selama kromatografi.

.4.:asa gerak di 2

"alam adsorpsi dan kromatografi partisi sistem, aturan lama AA seperti

memiliki afinitas untuk seperti AA memegang makna khusus dalam hal yang !istem

pelarut dapat berhasil digunakan untuk sampel elusi. !ebuah pelarut polar

dibutuhkan untuk mengelusi analit polar dari kolom normal fase polar, sedangkan

pelarut organik hidrofobik diperlukan untuk elusi hidrofobik analit dari kolom

fase terbalik hidrofobik. !ifat-sifat pelarut lainnya seperti volatilitas, viskositas,

mudah terbakar, toksisitas, reaktivitas, kompatibilitas dengan metode deteksi, dan

biaya harus dipertimbangkan. Tabel # berisi informasi rinci tentang sifat-sifat

yang paling umum organik pelarut. 3enambahan berbagai pengubah ponsel-fase

seperti asam %atau kurang umumnya, basa), reagen pasangan-ion, atau garam

penyangga anorganik bisa berharga dan menimbulkan resolusi yang lebih baik.

9aram Buffer biasanya ditambahkan ke fase mobile kromatografi cair kinerja

tinggi fase terbalik %/3-32). 3ilihan garam penyangga, bagaimanapun,

dikendalikan oleh banyak faktor. ni harus transparan pada panjang gelombang



deteksi dan gratis dari kontaminan organik. !elain itu, harus menunjukkan

kelarutan lengkap ketika komponen organik dan berair fase gerak dicampur.

Tabel #

Sifat umum Pelarut Digunakan Pemurnian Natural ProductsÃ

mumnya, garam penyangga digunakan pada konsentrasi &$-&$$m5

%4$). *amun, penggunaan garam-garam ini memerlukan langkah desalting

berikutnya. "i ;, fase gerak terutama larutan buffer. :aktor-faktor kritis adalah

p dan kekuatan ion dari fase gerak. Tradisional buffer anorganik seperti fosfat,



asetat, dan format biasanya digunakan dalam pemisahan pertukaran ion. Beberapa

penulis lebih suka menggunakan buffer volatile menghilangkan langkah desalting

berikutnya. ontoh buffer volatile amonium bikarbonat dan amonium asetat.

Buffer volatile terutama mengandung piridin, yang sangat beracun. *amun,

penguapan buffer ini bukanlah tugas yang mudah, dan selama proses penguapan

penyangga solusi, perubahan drastis dalam p dapat terjadi yang dapat

mempengaruhi diinginkan komponen %&+).

.6.Bentuk 2

.6.&. Berlawanan hromatography %)

Kedua fase stasioner dan mobile cair. 3emisahan @at terlarut adalah

dicapai dengan partisi. "ua bentuk tersedia %lihat Bab. 8). Bentuk

lama adalah tetesan berlawanan dan didasarkan pada berlalunya tetesan

dari fase mobile melalui fase diam lebih lama jarak. :ase diam yang

terkandung dalam 4$$ atau lebih tabung kaca dihubungkan secara seri

dengan lembam Teflon tabung. :ase gerak dipompa melalui sebagai

serangkaian terus menerus tetesan yang cukup kecil untuk naik %atau

jatuh) melalui fase diam tanpa menyentuh sisi tabung. sentrifugal ini

merupakan lanjutan mengenai hal ini dan memberi jauh lebih cepat hasil.

:ase diam diadakan di tabung sebagai lapisan tipis dengan sentrifugal

kekuatan. 5eskipun menawarkan pemulihan sampel sangat baik,

terbatas berbagai campuran pelarut yang dapat digunakan dan tingginya

biaya yang terlibat membatasi penerapannya %4#).

.6.4. Tipis-2ayer hromatography

:ase diam padat dan tersebar di lembaran datar. kedua adsorpsi dan partisi stasioner fase yang tersedia. Cang paling umum digunakan fasa

diam adalah silika gel dan oktadesil silika. Teknik ini berguna dalam

fraksinasi, tidak hanya sebagai proses akhir untuk pemurnian relatif

sejumlah kecil senyawa yang hampir murni, tetapi juga sebagai metode

untuk merancang beberapa jenis pemisahan kolom dan juga untuk



organisme dan tempat pengumpulan harus hati-hati dicatat untuk memfasilitasi re-

pengumpulan dan identifikasi taksonomi berikutnya.

9ambar ( menyajikan contoh lembar catatan koleksi yang harus selesai

untuk setiap sampel yang dikumpulkan.

"i tempat pertama, masing-masing sampel harus memiliki sejumlah

koleksi khusus. 7umlah ini dapat dipilih untuk menunjukkan koleksi tahun,

ekspedisi nomor, dan spesimen nomor, misalnya, koleksi nomor +84&4 berarti

tahun &++8, ekspedisi nomor 4, dan spesimen nomor &4. 2okasi harus direkam

pada peta atau grafik daerah dengan skala yang sesuai untuk mengaktifkan re-

koleksi. 7ika memungkinkan, aparat posisi global %93!) harus digunakan wuntuk

mendapatkan koordinat yang akurat untuk &$ m. nformasi tentang habitat

%misalnya, sampel tumbuh di atas batu atau pada permukaan organisme lain)

sebagai juga setiap pengamatan ekologi %misalnya, mampu mencegah

pertumbuhan organisme tetangga) harus dicatat. !ebuah penjelasan rinci tentang

ciri-ciri morfologi organisme, termasuk warna, bentuk, tekstur, harus ditulis. :oto

closeup organisme, diambil di bawah dan di atas air, adalah sangat penting untuk

nanti identifikasi taksonomi dan harus melekat pada lembar pengumpulan %lihat

atatan 6). !pesimen voucher untuk tujuan taksonomi harus disiapkan dengan

mengambil kecil %misalnya, 4-# cm) bagian dari jaringan dan melestarikan dalam

larutan formalin &$L dalam air laut. !pesimen ganggang biasanya diawetkan

dalam larutan formalin #L dalam air laut. !pesimen harus mewakili dari seluruh

organisme dan mencakup banyak jaringan yang relevan dengan taksonomi

mungkin, misalnya, untuk spons, baik e=o- dan endosome sangat penting untuk

identifikasi akurat. ntuk tunicates dan karang lunak, sering menjadi bagian dari

organisme atau seluruh organisme %jika tidak terlalu besar) harus dikumpulkan,

termasuk AA root. AA !etelah spesimen mencapai laboratorium, larutan formalin

harus dituangkan dan diganti dengan etanol 8$L untuk penyimpanan jangka

panjang.

7umlah organisme yang akan dikumpulkan biasanya ditentukan mengingat

kelimpahan. kuran sampel yang ideal adalah &-4 kg berat basah %&$$-4$$ g



berat kering). 3emanenan lengkap organisme harus dihindari. 7ika hanya

organisme tunggal yang besar tersedia, bagian dari itu mungkin dikumpulkan.

dealnya, sampel harus liofilisasi segera setelah pengumpulan untuk mencegah

degradasi kimia. 7ika hal ini tidak mungkin, sampel harus

disimpan pada -4$J sampai $J sampai pengeringan beku. !ebuah pendekatan

alternatif adalah untuk memperbaiki sampel dengan merendamnya dalam

campuran etanol-air %#$<#$ vHv) untuk kira-kira 4( jam setelah cairan tersebut

akan dibuang. basah organisme tersebut kemudian ditempatkan dalam high-

density polyethylene botol %*algene 4 2 wadah lebar mulut adalah yang terbaik)

dan dikirim kembali ke laboratorium rumah di suhu lingkungan %48) %lihat

atatan (). !ampel diawetkan dengan cara ini biasanya tetap dalam kondisi baik

hingga 4 minggu dalam kondisi tropis dengan tidak ada kerugian yang signifikan

dari konten metabolik sekunder. 3enambahan 5eO harus terjadi segera setelah

sampel mencapai laboratorium.

&KST)AKSI

!trategi ekstraksi tiga yang banyak digunakan di bidang alam laut produk.

3ilihan metode tergantung pada tujuan proses isolasi, fasilitas yang tersedia, serta

keuntungan intrinsik dan kerugian prosedur %lihat atatan #). 5etode pertama

melibatkan maserasi sampel dengan pelarut, diikuti dengan penyaringan atau sentrifugasi.

/esidu jaringan dikembalikan ke wadah ekstraksi dan diekstraksi lagi. 3roses berlanjut

sampai tidak ada hasil ekstraktif diperoleh %lihat atatan ?). !ampel biasanya dipotong

menjadi potongan-potongan kecil atau ditumbuk menjadi partikel halus untuk

memfasilitasi penetrasi pelarut.

3engadukan atau sonication dapat diterapkan untuk meningkatkan tingkat difusi.

"alam kebanyakan kasus, 5eO atau ;tO adalah pelarut pilihan. *amun, penggunaanserangkaian pelarut meningkatkan polaritas juga umum untuk mencapai tingkat tertentu

fraksinasi. :ilter bantu dan vakum biasanya digunakan untuk mempercepat proses filtrasi.

!etelah ekstraksi, pelarut dihilangkan dengan penguapan rotary tidak lebih dari 6#J

untuk menghindari degradasi senyawa %lihat atatan 8). 5etode ini sederhana dan tidak

memerlukan peralatan yang canggih. "i sisi lain, sejumlah besar pelarut yang terlibat dan



energi yang dibutuhkan untuk penguapan mereka, serta prosedur yang panjang dapat

membatasi aplikasi industrinya. !kema ekstraksi kedua dikembangkan oleh para ilmuwan

di ! *ational ancer nstitute %*) sebagai bagian dari program skrining yang luas

dari produk alami untuk mendeteksi senyawa dengan aktivitas antitumor atau anti->.

!ampel beku yang digiling dengan es kering %O4) dan diekstraksi dengan air pada ( M .

;kstrak air dihilangkan dengan sentrifugasi dan liofilisasi. The marc kering kemudian

berturut-turut diekstraksi dengan 5eO-4l4 %&< & v H v), diikuti oleh 5eO %&$$L).

;kstrak organik digabungkan dan dipekatkan pada vakum %4,4+). 5etode ini sangat

efisien. !elain itu, liofilisasi dalam ekstrak air menghilangkan risiko menabrak dan

degradasi panas. 3rotokol ekstraksi ketiga melibatkan penggunaan !:s %lihat Bab. 6).

Titik kritis didefinisikan sebagai suhu tertinggi dan tekanan di atas yang tidak ada

perbedaan dalam kepadatan antara bentuk cair dan gas dari substansi. 3ada suhu dan

tekanan di atas titik kritis, cairan homogen tunggal terbentuk dan dikatakan superkritis.

!uhu dan tekanan kritis berbeda dengan substansi dan dengan kemurniannya. ntuk air,

nilai-nilai 68(J dan 44$ atm, masing-masing, sedangkan untuk karbon dioksida nilai-

nilai yang sesuai adalah 6&J dan 8( atm, masing-masing.

!:s memiliki keuntungan dari viskositas rendah, sifat perpindahan massa

unggul, dan daya solvasi baik. 5ereka juga memiliki kemampuan untuk menembus

bahan mikro. "engan demikian, penggunaannya dalam ekstraksi produk alami secara

luas dihargai. Karbon dioksida superkritis adalah pelarut suhu rendah paling disukai

dapat digunakan. ni memiliki keuntungan lain, seperti sebagai tidak beracun,

nonflammability, noncorrosiveness, inertness kimia, dan efektivitas biaya. !elain itu,

akan mudah menguap ke atmosfer setelah ekstraksi %6$). O4 superkritis menyerupai

pelarut nonpolar heksana dan ben@ene dalam kekuasaan pelarut mereka. 0finitas untuk

senyawa polaritas yang lebih tinggi dapat ditingkatkan dengan meningkatkan densitas

%oleh kecil perubahan suhu dan tekanan) atau menambahkan pelarut organik %misalnya,5eO, ;tO, atau "5). *amun, penambahan tersebut pengubah organik akan

mengubah suhu dan tekanan kritis dan akan memerlukan modifikasi prosedur untuk

menghapus cairan ekstraksi pada akhir proses %4#). /eferensi %6&,64) termasuk contoh

untuk aplikasi teknik ini dalam ekstraksi rumput laut. meskipun ini 5etode menawarkan



cara yang cepat dan efektif untuk ekstraksi dan penghapusan pelarut selanjutnya, perlu

peralatan canggih dan beberapa eksperimen untuk memilih pengubah organik terbaik.

*ractionation o! Marine &+tracts

;kstrak laut sangat kompleks, dan terdiri campuran senyawa netral, asam, basa,

lipofilik, dan amphiphilic. !ifat senyawa %s) dari bunga mungkin berbeda sesuai dengan

tujuan proyek, dan sebagai akibatnya tidak ada prosedur fraksinasi umum atau resep yang

dapat melayani untuk segala kemungkinan. 3erlu dicatat bahwa meskipun kemajuan

terbaru dalam teknologi pemisahan, pengalaman masih memainkan peran yang sangat

diperlukan dalam isolasi hasil alam laut.

mumnya, prosedur fraksinasi melewati empat tahap %9ambar. #). Tahap pertama

meliputi pengumpulan informasi tentang profil kimia konten dan aktivitas biologis

ekstrak, sifat senyawa yang menarik, serta jenis kotoran. nformasi ini sangat berharga

untuk perencanaan strategi isolasi. 3ada tahap kedua, dereplication %lihat Bab. &4)

biasanya terjadi. Tujuannya adalah untuk mengidentifikasi ekstrak yang mengandung

senyawa hanya dikenal sedini mungkin sebelum langkah fraksinasi rumit yang dilakukan,

dan untuk memprioritaskan ekstrak dalam hal konten mereka senyawa baru dan H atau

aktif menarik. ni mungkin berguna untuk menunjukkan bahwa semua prosedur yang

terlibat dalam tahap & dan 4 harus dilakukan untuk semua fraksi yang diperoleh setelah

setiap langkah pemisahan. "engan cara ini, komponen yang menarik dapat dilacak

sampai pemurnian akhir. Tujuan dari tahap ketiga sering untuk menghilangkan sebagian

besar yang tidak diinginkan bahan, misalnya, lemak dan garam menggunakan cukup

resolusi rendah langkah pemisahan, misalnya, partisi cair-cair, !3;, dan !;. Tahap

keempat biasanya melibatkan langkah-resolusi tinggi pemisahan, misalnya, 32

dengan Tujuan pemurnian senyawa yang menarik untuk sebuah gelar yang

memungkinkan penjelasan struktur berikutnya. 3rosedur yang terlibat dalam empat tahap

yang disebutkan dibahas di bawah ini dengan beberapa rincian.



9ambar. #. 3endekatan umum untuk fraksinasi ekstrak laut.

Ta(a" ,: Investi#asi Si!at &+tract Kom"onen

ni mungkin adalah tahap yang paling penting dalam proses isolasi. 3erencanaan

bijaksana skema fraksionasi terutama tergantung pada informasi yang tersedia pada sifat

@at hadir dalam ekstrak. !elain itu, pengetahuan tentang sifat kimia dan H atau aktivitas

biologis senyawa target yang efisien dapat memandu proses pemisahan. 0kibatnya,

beberapa informasi dapat diungkapkan oleh taksonomi yang tepat identifikasi organisme

diselidiki. 3encarian literatur dapat memberikan informasi tentang senyawa yang

sebelumnya terisolasi dari spesies. 7ika kimia spesies belum diteliti, informasi yang

berguna dapat diperoleh dengan mencari spesies yang terkait erat dalam genus. *amun,

perlu diingat bahwa kandungan kimia dari organisme laut dapat benar-benar berbeda jika

dikumpulkan dari sebuah wilayah yang berbeda dan H atau di musim lain. 7enis pelarut

yang digunakan dalam ekstraksi juga dapat memberikan beberapa informasi yang

berguna. ;kstrak air biasanya mengandung senyawa yang sangat polar dan sejumlah



besar garam anorganik. "i sisi lain, ekstrak organik sering mengandung senyawa yang

kurang polar dan banyak lemak. nformasi lebih lanjut dapat diperoleh dengan melakukan

biologis pengujian, analisis T2, spektrometri massa %5!), dan *5/ percobaan.

P&N-A)IN.AN BIOLO.I

Bioassay-dipandu fraksinasi sangat menarik untuk penelitian tentang penemuan

obat dari sumber alami. al ini penting untuk menjaga sampel referensi dari fraksi yang

diperoleh setelah setiap langkah pemisahan sehingga dapat diuji secara biologis dan

berfungsi sebagai catatan bahan pulih pada setiap tahap proses %4&). *amun, salah satu

masalah yang paling sulit dalam bioassay-diarahkan fraksinasi adalah kemungkinan

mendapatkan positif palsu dan negatif palsu. !alah positif biasanya terjadi jika salah satu

komponen tidak aktif dalam ekstrak memiliki kemampuan untuk berinteraksi nonspesifik

dengan target molekul assay %misalnya, mampu mengendapkan protein dan karenanya

menunjukkan aktivitas penghambatan dalam banyak tes berbasis en@im). "emikian pula,

beberapa komponen tidak aktif dapat menimbulkan hit positif dengan berinteraksi dengan

beberapa komponen dari sistem uji selain target. Orang lain mungkin mengganggu

metode uji deteksi, misalnya, Nuenchers > %&). "i sisi lain, negatif palsu biasanya

terjadi jika senyawa aktif bekerja pada target molekul lain daripada pengujian tersebut.

al ini juga harus dicatat bahwa banyak entitas kimia menarik mungkin diaktifkan secara

in vivo oleh en@im metabolik, faktor yang tidak dipertimbangkan dalam banyak sistem

penyaringan in vitro. "engan demikian, kita dapat menyimpulkan bahwa proses

fraksinasi tidak boleh hanya mengandalkan skrining biologis.

ANALISIS TL$

0nalitis pelat T2 dapat digunakan untuk mendapatkan ide tentang tingkat

polaritas danHatau hidrofilisitas komponen ekstrak yang berbeda. 5ereka juga banyak

diterapkan dalam mendeteksi senyawa melalui beberapa langkah pemisahan. !elain itu,

mereka dapat digunakan untuk memprediksi pola pemisahan pada kromatografi kolom,



dan dengan demikian membantu dalam memilih sistem kolom kromatografi terbaik.

5ereka mungkin membantu juga dalam menilai tingkat kemurnian senyawa hasil isolasi.

"alam semua aplikasi di atas, lebih dari satu sistem pelarut harus diadili sebagai senyawa

yang berbeda mungkin memiliki nilai /f yang sama dalam satu sistem dan dengan

demikian muncul sebagai satu tempat. 3elat T2 dapat disemprot dengan reagen yang

bereaksi khusus dengan kelas-kelas tertentu senyawa. 3enggunaan reagen penyemprotan

yang berbeda dapat memberikan banyak informasi tentang kelas kimia hadir dalam

ekstrak. 0da banyak reagen penyemprotan tercantum dalam beberapa teks standar pada

subjek %66,6() dan juga dalam Bab (. Tabel ? daftar penyemprotan reagen yang paling

banyak digunakan untuk produk alami laut.

!elain itu, kombinasi langsung T2 dengan bioassay %bioautografi) dapat

memberikan informasi lebih lanjut tentang komponen aktif dalam ekstrak campuran. al

ini dicontohkan dalam penemuan agen antimikroba.

tabel ?

T2 3enyemprotan /eagen mum "igunakan di 5ost Kelautan 0lam 3roduk 2abs

/eagen /esep 3erawatan atatan

>anillin H

asam sulfat

2arutkan vanillin %(

g) di terkonsentrasi

4!O( %&$$ m2)

3anas pada &$$M

sampai warna

muncul

niversal penyemprotan

reagen

0nisaldehida

H asam sulfat

Tambahkan $.#ml

anisaldehida ke &$

m2 asam asetat

glasial

dan kemudian

menambahkan ke

campuran #m2

3anas pada &$$M

sampai warna

muncul

5endeteksi banyak

senyawa, terutama

terpen, gula, fenol, dan

steroid



5eO dan # m2

terkonsentrasi

4!O(, dalam

urutan ini

/eagen

"ragendorff

Tambahkan &$ m2

larutan ($L dari K

ke &$ m2 larutan

$,# g subnitrate

bismut dasar dalam

asam asetat %&$ ml)

dan air suling %($

ml). ;ncerkan larutan

yang dihasilkan

dengan asetat asam

dan air dalam rasio<

&< 4< &$

Tidak ada panas yang

diperlukan

5endeteksi alkaloid dan

senyawa heterosiklik

nitrogen

*inhydrin

reagen

2arutkan ninhidrin

%6$ mg) di &$ m2 n-

butanol. Tambahkan

asam asetat $.6m2

untuk solusi

3anas pada &$$M

sampai warna

muncul

"eteksi asam amino,

amina, dan peptida

"ari ekstrak laut. !etelah pengembangan, pelat K2T dari ekstrak kering

dan kemudian dilapis dengan lapisan tipis agar yang mengandung organisme uji

terhadap yang ekstrak aktif. !etelah masa inkubasi yang tepat, @ona inhibisi

pertumbuhan agar dapat dilihat pada daerah-daerah pelat yang mengandung

senyawa aktif %6#). 5etode yang sama juga dapat diterapkan untuk mendeteksi

senyawa dengan aktivitas antitumor %6?).

.6.&.6. 0*02!! *5/



0nalisis spektroskopi *5/ memiliki peran yang sangat diperlukan dalam

menjelaskan struktur senyawa murni. al ini juga dapat memberikan banyak informasi

tentang sifat kimia senyawa dalam campuran. 5aka dari itu, disarankan untuk

memperoleh &- dan &6- spektrum *5/ untuk ekstrak laut. Tujuannya adalah untuk

mendeteksi ada atau tidaknya artefak umum, misalnya, plastici@er %lihat atatan ) dan

untuk menetapkan komponen dalam campuran kelas kimia tertentu %lihat atatan +).

Kombinasi dari fraksi setelah pemisahan dapat ditetapkan atas dasar spektrum *5/

yang serupa.

.6.&.(. 0*02!! 5!

5! adalah teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari

senyawa yang tidak diketahui oleh pengionnya dan mendeteksi rasio massa terhadap

muatan %m H @) dari ion molekul yang dihasilkan. 5olekul yang tidak terionisasi tidak

akan terdeteksi. !alah satu keuntungan dari teknik ini memiliki sensitivitas tinggi. a

bahkan bisa mendeteksi jumlah mikrogram senyawa. 5asalah dalam generalisasi 5!

untuk proses identifikasi komponen ekstrak adalah kurangnya mode ionisasi yang

universal dimana setiap senyawa yang tidak diketahui dapat terionisasi. ntungnya,

banyak teknik ionisasi 5! telah diperkenalkan dimana sebagian besar produk alami

laut dapat terionisasi. mumnya, electrospray %;!) adalah teknik ionisasi yang

direkomendasikan untuk ekstrak polar, sedangkan ionisasi kimia tekanan atmosfer

%03) lebih disukai untuk yang agak polar %68). 0nalisis 5! sulit untuk diterapkan

pada ekstrak laut mentah, tapi bisa digunakan untuk mengidentifikasi senyawa dari

campuran semi murni.

.6.4. Tahap 4< "ereplikasi

solasi senyawa murni dari ekstrak laut adalah proses yang membosankan dan

mahal. 2angkah-langkah harus diambil untuk menghindari isolasi senyawa yang dikenal.

"ereplikasi dapat didefinisikan sebagai upaya untuk menghapus duplikat lead atau

senyawa %lihat Bab. &4) %6). 3roses ini tergantung pada ketersediaan database yang

komprehensif untuk senyawa yang dikenal. 0da 68 database oussen dan 7aspars

tersedia saat ini, termasuk yang mengandung informasi mengenai sumber organisme,



identifikasi taksonomi, dan metode ekstraksi, serta karakteristik kromatografi dan

spektroskopi yang berbeda dari senyawa hasil isolasi. !ebagian besar database ini dapat

diakses melalui internet. Tersedia juga pada ". Tabel 8 berisi beberapa dari database

yang berguna serta /2-nya, terutama dalam kaitannya dengan produk alami laut.

.6.6. Tahap 6< rude :raksinasi

Tujuan dari tahap ini adalah untuk menyederhanakan komposisi ekstrak dengan

membaginya kedalam berbagai kelompok senyawa berbagi karakteristik fisikokimia

yang sama dan atau menghapus sebagian besar bahan yang tidak diinginkan dan dengan

demikian memperbanyak ekstrak sehubungan dengan senyawa sasaran. prosedur umum

melibatkan partisi pelarut, defatting, dan desalting.

.6.6.&. 3artisi pelarut

3rosedur yang dijelaskan pada 9ambar. ? merupakan modifikasi dari

metode yang dikembangkan oleh Kupchan %6+). al ini dapat digunakan

untuk defatting dan desalting juga.

Tabel 8

Beberapa "atabase yang Berguna ntuk "ereplikasi Bahan 0lami 2aut

"atabase /2

5arin2it http<HHwww.chem.canterbury.ac.n@HmarinlitHmarinlit

.shtml

"ictionary of *atural

3roducts and others

http<HHwww.chemnetbase.comH

hemical 0bstracts %0!) http<HHinfo.cas.orgH

*03/02;/T %*atural http<HHwww.cas.orgHO*2*;H"B!!Hnapralertss.htm



3roduct 0lert) database l

Beilstein ross:ire http<HHwww.mimas.ac.ukHcrossfireH

!ilverplatter http<HHweb#.silverplatter.comHwebspirsHstart.ws

* data search http<HHdtp.nci.nih.govHdocsHdtpsearch.html

nited !tates 3atents http<HHwww.uspto.govHpatftH

hemical "atabase

!ervices

http<HHcds.dl.ac.ukHcdsH

*ational nstitute of

!tandards

http<HHwebbook.nist.govHchemistryH

ambridge !tructural

"atabase

http<HHwww.ccdc.cam.ac.ukHproductsHcsdH

5arine Biological

2aboratory, 1oods ole,

50, !0

http<HHwww.mbl.eduH

hromatography

application database

http<HHwww.chromatography.co.ukHappsHhplcHdbases

Hform.htm

http://www.chromatography.co.uk/apps/hplc/dbases/form.htm






9ambar. ?. 5odifikasi skema partisi Kupchan

!ebagian besar lemak akan hilang dengan fraksi n-heksana, sedangkan

garam anorganik akan hilang dengan sesuatu yang berair. Keuntungan dari

metode ini adalah perolehan kembali senyawa sasaran. Kelemahannya adalah

masalah pembentukan emulsi, ketidakefektifan waktu, dan banyaknya

penggunaan volume pelarut.

.6.6.4. "efatting

!ejumlah prosedur telah dijelaskan untuk defatting ekstrak laut.

3enggunaan !ephade= 2-4$ dan 5eO< 4l4 %&< & v H v) sebagai eluen

adalah salah satu prosedur yang umum digunakan. 2emak dan senyawa

organik non polar biasanya dielusi pertama. 3rosedur umum lainnya

melibatkan penggunaan cartridge !3; yang mengandung silika & dan

5eO atau 4O sebagai cairan pencuci. Karena sifat hidrofobik yang kuat,

lemak dan lipid dipertahankan pada fase diam, sementara lainnya komponen

ekstrak hidrofilik berlebih dielusi. 3rosedur terakhir tidak cocok apabila

senyawa sasaran menunjukkan perolehan kembali dari silika & yang buruk.

.6.6.6.3enghilangan garam

5etode yang paling efisien untuk desalting ekstrak laut telah dijelaskan

oleh 1est dan *orthcote %($) dan 1est. %(&). "alam prosedurnya, ekstrak

metanol dilewatkan melalui kolom "iaion 34$P resin %styrene-divinil

ben@ena polimer) sebelumnya dikalibrasi dengan 5eO. ;luen terkonsentrasi

dan melewati lagi kolom yang sama. ;luen yang dihasilkan diencerkan

dengan air dan melewati kolom. 2angkah terakhir diulang untuk memastikan

bahwa semua senyawa yang mengandung domain hidrofobik teradsorpsi pada

resin. "esalting dapat dengan mudah dicapai dengan mencuci resin dengan air

yang banyak. 3roporsi yang berbeda dari 5eO atau aseton dalam air dapat



digunakan untuk mengelusi senyawa teradsorbsi dan untuk mencapai tingkat

fraksinasi tertentu. asil yang lebih baik dapat diperoleh dengan

menggunakan manik-manik dengan ukuran partikel yang lebih kecil

%misalnya, "iaion 34$ss)G namun, dalam hal ini, aplikasi tekanan yang

dibutuhkan untuk mencapai sifat alir yang baik.

.6.(. Tahap (< 3emurnian 0khir

32 preparatif, sejauh ini, merupakan alat yang paling berguna untuk

memisahkan campuran kompleks. Ketika dihubungkan dengan diode array detector

%"0"), 32 memungkinkan seorang analis untuk mengidentifikasi senyawa yang

dikenal dengan perbandingan waktu retensi dan spektrum >. 3engenalan evaporative

light scattering detector %;2!") memungkinkan untuk mendeteksi senyawa yang tidak

memiliki gugus kromofor >. "alam beberapa tahun terakhir, tandem atau ditulis dgn

tanda penghubung teknik analisis seperti 2-5!, 2-5!-5!, 2-*5/, dan 2-

*5/-5! juga telah dikembangkan %lihat Bab. +). Teknik ini menyediakan alat yang

ampuh untuk identifikasi secara cepat senyawa yang dikenal dan penentuan kelas

struktur yang baru.

.6.(.&.> "O"0 0//0C ";T;TO/ %"0")

"etektor > :otodioda array memungkinkan pengumpulan data absorbansi >

di banyak panjang gelombang secara bersamaan dan dengan demikian memungkinkan

penilaian kemurnian puncak. Kotoran dasar dapat dengan mudah dideteksi dengan

membandingkan spektra > pada titik waktu yang berbeda di puncak. "0" paling

modern didukung dengan pustaka yang mengandung spektrum > senyawa yang

dilaporkan sebelumnya. Operasi perangkat lunak ini memiliki detektor dengan

kemampuan untuk turunan pustaka spektral dan mencari dan dengan demikian

memungkinkan identifikasi cepat senyawa yang dikenal %4$).

.6.(.4.;>03O/0T>; 29T-!0TT;/*9 ";T;TO/ %;2!")

;2!" telah dikembangkan untuk melengkapi deteksi > senyawa dengan daya

absorbansi yang lemah. "i ;2!", efluen 32 nebuli@ed dan kemudian menguap



dalam tabung melayang yang dipanaskan, yang menghasilkan embun partikel analit

yang melewati seberkas cahaya. 3artikel analit menghamburkan cahaya dan

menghasilkan sinyal %(4). Berbeda dengan detektor >, koefisien kehilangan analit

tidak berpengaruh pada respon ;2!". "engan demikian, ;2!" sekarang merupakan

metode deteksi konsentrasi pilihan untuk 2. Ketika ;2!" terhubung ke 32

preparatif, efluen dari kolom dibagi dan hanya sebagian kecil diarahkan ke detektor.

.6.(.6.2-5! "0* 2-5!-5!

2-5! adalah alat yang paling banyak diterapkan untuk dereplikasi bahan alami

%lihat bab. + dan &4) %(6,((). al ini terutama karena berat molekul nominal dapat

digunakan sebagai permintaan pencarian di hampir semua database. 5enggunakan 2-

5!-5!, ion molekul tertentu dipisahkan dan mengalami putaran kedua pada

fragmentasi. 3ola fragmentasi yang dihasilkan dapat memberikan banyak informasi

tentang struktur induk. Teknik ini cocok untuk identifikasi fragmen dari molekul yang

terbentuk dari beberapa unit individu seperti peptida, depsipeptida, oligosakarida, dan

saponin %&6).

.6.(.(.2-*5/

Kemajuan terbaru dalam spektroskopi *5/ telah memungkinkan rangkaian

langsung dengan sistem 32 %lihat Bab. +). 3enggunaan medan magnet yang tinggi

%#$$ 5@ atau lebih besar), !el aliran volume kapiler mikroliter, dan sistem pemrosesan

sinyal digital telah secara dramatis meningkatkan sensitivitas untuk melacak jumlah

analit. !elain itu, desain pemeriksaan baru telah memfasilitasi efisiensi dan spesifikasi

penekanan sinyal *5/ pelarut 32. Bagaimanapun, teknik ini masih lambat dan

sangat mahal. 2-*5/ sangat berguna dalam kasus dimana data dari 2-5! tidak

memungkinkan identifikasi senyawa pasti %misalnya, isomer yang memiliki berat

molekul yang sama). Teknik ini telah berhasil diterapkan pada identifikasi alkaloid

aaptamine dalam ekstrak spons laut Aaptos spesies %(#). 3enggunaan 32-*5/-5!,

diomana sistem pemisahan digabungkan dengan kedua *5/ dan 5!, juga telah

dilaporkan %(?).

I/' >istas baru 3ada Teknologi 3emisahan



1alaupun perbedaan tinggi, produk alami telah hadir dari program penelitian dari

berbagai perusahaan farmasi. al ini terutama karena dari penggunaan waktu tradisional

dan intensif biaya isolasi dan prosedur identifikasi, dan kurangnya ketersediaan produk

alami dalam format yang sesuai untuk teknologi T! modern. 0kibatnya, integrasi

ekstrak mentah produk alami dalam sistem T! menjadi sulit. al ini terutama karena

ada kemungkinan positif palsu yang tinggi dan senyawa bioaktif berulang diketahui dan

pekerjaan membosankan yang diperlukan untuk identifikasi hit. Baru-baru ini, metode

telah dijelaskan untuk persiapan produk alami yang besar dan beragam dioptimalkan

untuk T! %(8). !alah satu metode bergantung pada menghasilkan sebuah pustaka besar

dari fraksi yang dimurnikan setengah. Keuntungan dari metode ini antara lain yaitu

peningkatan keandalan hasil pengujian biologis dan penurunan yang tajam dalam beban

kerja berikutnya untuk identifikasi hit dan dereplication. !trategi lain tergantung pada

persiapan pustaka senyawa alami murni. 5eskipun jenis pustaka ini menawarkan

kehandalan yang paling tinggi dalam pengujian biologis, jumlah besar pekerjaan yang

dibutuhkan untuk persiapan sampel masih sangat kekurangan. Kedua pustaka

bergantung pada ketersediaan teknik fraksinasi yang cepat dan otomatis. Baru-baru ini,

!epiatec 9mb %Berlin, 7erman) bekerjasama dengan 0ventis 3harma "eutschland

9mb %:rankfurt, 7erman) telah merancang sistem untuk meningkatkan produktivitas

persiapan sampel untuk T!. !ebuah deskripsi singkat dari dua contoh representatif

sistem ini diberikan di sini.

>.&. Q 32 3aralel

!istem ini %9br. 8), yang dapat berjalan tanpa pengawasan untuk 4( jam dalam

sehari, mampu secara bersamaan menggunakan delapan fraksinasi campuran ekstrak

kompleks dengan sistem pompa gradien tunggal bertekanan tinggi, multi-channel %>,

"0", atau ;2!") detektor, dan perangkat lunak ahli. !ampel dipisahkan oleh sebuah

array dari kolom 32, menyediakan satu buah kolom untuk setiap sampel. 3erludicatat bahwa suntikan cairan dari sampel dengan berbagai polaritas yang luas adalah

pekerjaan yang menantang. "imethyl sulfo=ide %"5!O) benar-benar melarutkan

sebagian sampel untuk injeksi, tetapi juga dapat mengganggu pemisahan kromatografi

berikutnya. 5odul injeksi !3; on-line %4?) memecahkan kesulitan ini. "engan

menggunakan autosampler, sampel dilarutkan dalam "5!O yang disuntikkan kedalam



modul, dan air atau buffer secara bersamaan dipompa sebelum inlet ke kolom !3; %().

Karena peningkatan cepat ini dalam polaritas gradien, komponen ekstrak tetap

teradsorbsi ke kolom !3; dan "5!O H air dibuang. !elanjutnya, pelarut organik yang

sesuai menyuntikkan ekstrak ke kolom pemisahan.

9ambar. 8. garis !kema pipa dari Q perangkat 32 3aralel. 9ambar

direproduksi dengan i@in dari 3erusahaan Brosur !epiatec.

;lusi fraksi menjadi on-line dan pemeriksaan otomatis sebelum pengumpulan.

5ereka terabsorbsi lagi ke kolom !3; menggunakan prinsip yang sama seperti modul

injeksi sampel yang telah dijelaskan sebelumnya. !3; teradsorpsi fraksi yang memerah

dengan air dan kemudian dielusi dengan pelarut organik murni ke dalam +?-piring baik.

!istem ini mampu memisahkan lebih dari &$$ ekstrak produk alami perhari menjadi

beberapa ribu air dan fraksi penyangga bebas. Kualitas dan kemurnian fraksi yang

diperoleh sesuai dengan tuntutan T!.

>.4. !epbo=P< 3engaturan 32-!3;-32-!3;

!istem ini %9br. ) didasarkan pada kombinasi 32 dan !3;. "alam pengaturan

32-!3;-32-!3; ini, polaritas eluen meningkat dengan penambahan air yang

sedemikian rupa sehingga fraksi dielusi dari kolom pemisahan yang teradsorpsi ke

kolom perangkap . /ute fraksi terperangkap kemudian melewati pemisahan kolom

dimana pemisahan akhir selesai. !etiap komponen yang dielusi teradsorpsi ke kolom



perangkap , terpisah dari buffer, dan memerah pada pengumpul fraksi. !istem ini jauh

lebih cocok untuk menghasilkan sebuah pustaka senyawa yang hampir murni.

9ambar. . garis !kema pipa dari sepbo=P. 9ambar direproduksi dengan

i@in dari 3erusahaan Brosur !epiatec.

isolasi bahan alam laut

Documents