c18カラムのエンドキャッピングは ここまで進化した！耐ㅁ...
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C18カラムのエンドキャッピングはここまで進化した！耐久性を実現する
技術とその性能
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 小島瞬 長江徳和
Email: [email protected]://chromanik.co.jp
エンドキャッピング
塩基性化合物のピーク形状の改善
手法
TMS化、マルチステージタイプ、ポリメリックエンドキャッピング高温気相エンドキャッピングSunniest エンドキャッピングシラノールアクティビティコントロール
ピンポイントなエンドキャッピング
表面を覆うようなエンドキャッピング
シラノールアクティビティコントロール
O
Si
HO
SiO
SiSi
CH3
OH
Si
OH O
Si
HO
SiO
O
SiSi Si
CH3
高吸着性シラノール
シロキサン結合に変換Silanol
Activity Control
Technology
シラノールの活性コントロール
シリカは結晶構造ではなくアモルファス
条件次第では原子を動かすことができる
Sunrise C18-SAC
シラノールによる分離の変化■ピリジンの溶出順とピーク形状の比較
Column size: 4.6 X 150mmMobile phase: CH3OH/H2O = 30:70Sample: 1 = Uracil, ② = Pyridine, 3 = Phenol
■カフェインの保持の比較
Column size: 4.6x150 mmMobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH4.5 = 30:70Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 40 °CSample: 1 = Theobromine, 2 = Theophylline
3 = Caffeine, 4 = Phenol
塩基性化合物の選択性の比較
Column size: 4.6x150 mmMobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH3.0 or pH4.5 = 50:50Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil
2 = Propranolol
3 = Nortriptyline
4 = Amitriptyline
5 = Toluene
NH
NH
O O
O
O H
N H C H 3
C H 3
N HC H 3
NC H 3
C H 3
C H 3
弊社の技術
O
Si
OH
Si
Si O
O
OO
SiOO
Si
OSi
O
Si
SiO O
OO
Si
O
Si
O Si
Si
OO
Si
O
Si
Si
OOO
OSi
OSi
O
OO
O Si
Si
Si
O O
OO
Si
OSi
O Si
SiO
O
OOO
O
SiO
Si Si
O
OO
O
O
O
Si
OSi
O
Si
SiOH
O
O
OSi
O
SiO
SiOO O
O
Si
OH
O
サニエスト結合（エンドキャッピング）技術
Hexamethyloctadecyltetrasilane (C18 reagent A)の合成
シリカ表面に結合
Final TMS
トルエン中で還流
シリカ表面の疎水性
既存のエンドキャッピング
Sunniest エンドキャッピング
疎水性
低
高
End-capping layer
C18 C18 C18 C18 C18
Stationary phase
End-capping layer
C18 C18 C18C18 C18
Stationary phase
Sunniestエンドキャッピングの効果Column size: 4.6 x 150 mmParticle size: 5 µmMobile phase: CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 =60/40Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC or 22 ºC Sample: 1 = Uracil
2 = Propranolol
3 = Nortriptyline
4 = Amitriptyline
O
OH
NH CH3
CH3
NHCH3
N
CH3
CH3
1
1
1
2
2
耐アルカリ性試験
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800
通液時間(h)
ブチルベンゼンの相対理論段数(%)
◆Sunniest C18, pH10 – 50ºC■Sunniest C8, pH9.2 – 40ºC
Column: Sunniest C18, C8, 5 µm 4.6 x 150 mmMobile phase:
C18: CH3OH/20mM Sodium borate/10mM NaOH=30/21/49 (pH10)C8: CH3OH/20mM Sodium borate (pH9.2) =30/70
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: C18 - 50 ºC, C8 - 40 ºC
カラム劣化充填剤の劣化
酸アルカリ
吸着
・酸やアルカリによる加水分解・物質の吸着
衝撃 圧力
・衝撃や圧力による充填ベッドの崩れ
充填状態の変化
段数の低下、ピーク形状の悪化、保持時間の変化
耐アルカリ性を高めるための手段
ハイブリッド基材
CH2
SiO
SiCH2
CH2
SiO
O
OSi
O
O
O
CH2
CH2
SiO
SiCH2
CH2
Si
O
O
OO
CH2
Si
O
コーティング エンドキャッピング
溶け難くする 接触を減らす
エンドキャッピングをさらに高効率に
高い耐アルカリ性カラムの製造可能
劣化の仕方の違い
O
Si
OH
Si
Si O
O
OO
SiOO
Si
OSi
O
Si
SiO O
OO
Si
O
Si
O Si
Si
OO
Si
O
Si
Si
OOO
OSi
OSi
O
OO
O Si
Si
Si
O O
OO
Si
OSi
O Si
SiO
O
OOO
O
SiO
Si Si
O
OO
O
O
O
Si
OSi
O
Si
SiOH
O
O
OSi
O
SiO
SiOO O
O
Si
OH
O
O
Si
OH
Si
Si O
O
OO
SiOO
Si
OSi
O
Si
SiO O
OO
Si
O
Si
O Si
Si
OO
Si
O
Si
Si
OOO
OSi
OSi
O
OO
O Si
Si
Si
O O
OO
Si
OSi
O Si
SiO
O
OOO
O
SiO
Si Si
O
OO
O
O
O
Si
OSi
O
Si
SiOH
O
O
OSi
O
SiO
SiOO O
O
Si
OH
O
酸での劣化 アルカリでの劣化
アルカリ性下における劣化はシリカに対する加水分解
酸性下における劣化はC18の結合部に対する加水分解
C18基やエンドキャプの脱離 シリカの溶解
アルカリ性移動相による劣化
O
Si
OH
Si
Si O
O
OO
SiOO
Si
OSi
O
Si
SiO O
OO
Si
O
Si
O Si
Si
OO
Si
O
Si
Si
OOO
OSi
OSi
O
OO
O Si
Si
Si
O O
OO
Si
OSi
O Si
SiO
O
OOO
O
SiO
Si Si
O
OO
O
O
O
Si
OSi
O
Si
SiOH
O
O
OSi
O
SiO
SiOO O
O
Si
O H
O
アルカリ性下における劣化はシリカに対する加水分解
結果としてシリカが溶け出す。
理論段数の低下、ピークの広がり
シリカへの結合
Mixture of reagent A and C
Si
OMe
OMeO
Si
OSi
OSi
Cl
MeMeMeMe
Me
Me
Si
OMe
OO
Si
OSi
OSi
Cl
MeMeMeMe
Me
Me
Si
O
Si
O
Si
Cl
MeMe Me Me
Me Me
Mixture of reagent A and B
Si
OMe
OMeO
Si
OSi
OSi
Cl
MeMeMeMe
Me
Me
Si
OMe
OO
Si
OSi
OSi
Cl
MeMeMeMe
Me
Me
Si SiMe
Me
OMe OMeOMe
AとBの混合比率（2:1）（1:1）（1:2）
AとCの混合比率（2:1）（1:1）（1:2）
シリカゲル5 μm, 340 m2/g
シリカゲル5 μm, 340 m2/g
Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2010-52986
トルエン中で還流
トルエン中で還流
Finally end-capping TMS
Finally end-capping TMS
耐アルカリ性評価試薬比率 炭素含有量 通液時間 カラムの凹み量 段数(相対値)
従来 C18 A 15.6% 14 時間 1.3 mm 90%
Prototype 501 A:B=2:1 15.8% 34 時間 2.7 mm 83%
Prototype 502 A:B=1:1 16.1% 34 時間 2.2 mm 90%
Prototype 504 A:B=1:2 14.7% 34 時間 4.3 mm 62%
Prototype 505 A:C=2:1 15.7% 34 時間 3.0 mm 85%
Prototype 507 A:C=1:1 16.3% 34 時間 2.0 mm 91%
Prototype 508 A:C=1:2 14.9% 20 時間 3.3 mm 82%
Prototype 513 A:D=1:1 16.3% 50 時間 1.0 mm 92%
Column dimension: 150 x 4.6 mm Mobile phase:
CH3OH/50mM Sodium phosphate buffer 10 / 90 (pH11.5)Flow rate: 1 mL/min，Temperature: 40 ºC
Mobile phase: CH3CN/H2O=70/30Flow rate: 1 mL/minTemperature: 40 ºC Sample: 1 = Butylbenzene
アルカリ性移動相の通液 カラム性能の確認（凹み量）
試薬B,Cを使用した方法では
限界がある
新たな方法を使用した結果
耐久性が向上した
pH10.5，60℃での安定性評価
Durable test conditionColumn dimension: 50 x 2.1 mmMobile phase:
CH3OH/10mM Ammonium bicarbonate (pH 10.5)=30/70Flow rate: 0.8 mL/minTemperature: 60 ºC
Measurement conditionColumn dimension: 50 x 2.1 mmMobile phase: CH3CN/H2O=60/40Flow rate: 0.2 mL/minTemperature: 40 ºC Sample: 1 = Butylbenzene
0
20
40
60
80
100
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Rel
ativ
e p
late
of b
utyl
benz
ene
/%
Elution volume /mL
Prototype 513
Kinetex EVO C18
PoroShell C18 HPH
他社ハイブリッドタイプのカラムと比較してもそれ以上の耐久性を示した
◆Prototype 513
■Company P C18 Hybrid type
▲Company A C18 Hybrid type
ギ酸ピークの比較
0 1 2 3 4 5 6
Retention time/min
1
1
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
Company S C18 (2.7 µm)
SunShell C18 (2.6 µm)
Company T C18 (2.7 µm)
Company A C18 Hybrid type (2.7 µm)
TF=1.45
TF=1.86
Not detect
TF=3.21
TF=1.46
Company P C18 Hybrid type (5 µm)
Mobile phase:
CH3CN/0.1% H3PO4=2/98
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210nm
Sample:
1 = Formic acid,
2 = Acetic acid,
3 = Propionic Acid
TF=1.79 Company W C18 (2.7 µm)
1 2
3
SunArmor C18 (5 µm)2 3
Not detect
Mobile phase: Acetonitrile/10mM ammonium acetate pH6.8=(40:60)Column dimension: 150 x 4.6 mm, Flow rate: 1.0 mL/min, Temp.: 40oC
塩基性化合物アミトリプチリンの比較
Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol, 3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Retention time/min
TF=1.20
TF=1.89
TF=3.59
TF=2.73
TF=3.24
Company P C18 Hybrid type (5 µm)
Company S C18 (2.7 µm)
SunShell C18 (2.6 µm)
Company A C18 Hybrid type (2.7 µm)
Company T C18 (2.7 µm)
TF=3.12 Company W C18 (2.7 µm)
2 3 4
N
CH3
CH3
Amitriptyline
SunArmorC18 (5 μm)TF=1.18
SunArmor RPAQUAの耐久性
0
20
40
60
80
100
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Rel
ativ
e p
late
of b
utyl
benz
ene
/%
Elution volume /mL
SunArmor RPAQUA
有機溶媒を用いないpH10の移動相でも高い耐アルカリ性
Durable test conditionColumn dimension: 50 x 2.1 mmMobile phase: 10mM Ammonium bicarbonate(pH 10)Flow rate: 0.2 mL/minTemperature: 40 ºC
Measurement conditionColumn dimension: 50 x 2.1 mmMobile phase: CH3CN/H2O=70/30Flow rate: 0.2 mL/minTemperature: 40 ºC Sample: acenaphthene
NH2カラムの耐久性比較
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400 500 600
保持時間/%
通液時間/hour
SunArmor NH2
Company A NH2
Company B NH2
Durable test conditionColumn size: 250 x 4.6 mmMobile phase: CH3CN/water, =75/25Flow rate: 1 mL/minTemperature: 40 ºC Detection: RI, Sample: Sucrose
一般的なアミノプロピルカラムの二倍の耐久性を実現
SunArmorNH2の耐久性
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500 600
Rel
ativ
e re
tent
ion
time
/%
Time / h
0.75
0.5
75/25
50/50
Durable test conditionColumn size: 250 x 4.6 mmMobile phase: CH3CN/water, =75/25 or 50/50 Flow rate: 1 mL/minTemperature: 40 ºC Detection: RI, Sample: Sucrose
移動相中の水の割合が増えても耐久性を維持
Column: SunArmor NH2, 5 µm 250 x 4.6 mmMobile phase: Acetonitrile:10mM ammonium acetate=70:30Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 oCDetection: RI
アプリケーション
0 5 10 15 20
糖の分離に！
スクロースとパラチノースの分離
1. Sucrose
2. Palatinose
Column: SunArmor NH2, 5 µm 250 x 4.6 mmMobile phase: Acetonitrile/50 mM ammonium acetate=75/25Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 oCDetection: RI
1
2
Retention time/min
0 5 10
2
1
3
Retention time/min
1. L-Leucine
2. L-Isoleucine
3. L-Valine
アミノ酸の分離に！
分岐鎖アミノ酸の分離
0 5 10 15 20
1
3
2
4 5
アプリケーション2
1. Grycerine
Retention time/min
2. Erythritol 3. Xylitol
4. Sorbitol 5. Mannitol
Column: SunArmor NH2, 5 µm 250 x 4.6 mm
Mobile phase: Acetonitrile:Water = 80:20
Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 oCDetection: RI
糖アルコールの分離に！
0 2 4 6 8 10 12 14
Retention time/min
Column: SunArmor NH2, 5 µm 250 x 4.6 mmMobile phase: Acetonitrile/Water = 60/40Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 25 oCDetection: RI, Sample: 1= α-Cyclodextrin, 2= β-Cyclodextrin,
3=γ-Cyclodextrin
1
2
3
デキストリンの分離に！
まとめ
• 他社ハイブリッドタイプとの比較から、エンドキャッピングのみでも十分な耐久性を示した
• 作成したカラムでは酸性、塩基性物質共に良好なピーク形状が得られた。
• エンドキャッピング技術を応用することでアルカリ性条件下での耐久性を向上させることが可能であった。
• 順相カラムに耐アルカリ性エンドキャッピング技術を応用することで、耐久性を改善することが可能であった。