Download - Laporan Transkonjugasi
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
1/15
MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON KONJUGASI
PENDAHULUAN
Transfer gen atau rekombinasi genetik adalah proses mencampurkan gen dari satu
organisme ke organisme lain sehingga organisme mengalami perubahan pada materi
genetiknya. Perubahan materi genetik tersebut disebut mutasi, dimana mutasi tersebut dapat
menyebabkan perubahan yang permanen pada suatu organisme (Pommerville 2015.
!erdasarkan prosesnya, transfer gen dapat dibedakan men"adi transfer gen vertikal dan
transfer gen hori#ontal. Transfer gen vertikal adalah proses perpindahan materi genetik secara
aseksual, contohnya adalah melalui pembelahan biner. $ementara itu, transfer gen hori#ontal
melibatkan perpindahan materi genetik dari sel donor menu"u sel resipien secara lateral.%ontoh transfer gen hori#ontal adalah melalui transformasi, transduksi, dan kon"ugasi.
Transformasi adalah pengambilan &' telan"ang dari lingkungan, transduksi merupakan
proses transfer materi genetik dengan perantara virus, sementara kon"ugasi adalah proses
transfer materi genetik yang membutuhkan kontak antar sel (Pommerville 2015.
)on"ugasi merupakan mekanisme transfer materi genetik pada dua sel bakteri dan sel
donor akan memberikan &', biasanya plasmid, kepada sel resipien. $el resipien yang
menerima materi genetik dari sel donor akan memiliki sifat yang sama dari sel donor setelah
proses matingberhasil. Proses ini di"embatani dengan pilus yang dibentuk oleh bakteri untuk
men"adi perantara le*atnya &' plasmid dari sel donor ke sel resipien sehingga "arak kedua
sel men"adi memendek dan sitoplasma kedua sel dapat terhubung(Pommerville 2015.
$elain plasmid, proses kon"ugasi "uga dapat mentransfer materi genetik berupa
transposon. Transposon merupakan sekuens &' yang dapat bereplikasi dan memasukkan
satu buah kopi &' tersebut pada lokasi yang baru pada genom. Transposon ditemukan di
"agung oleh !arbara +c%lintock pada tahun 150 dan di bakteri oleh -oshua ederberg.
Transposon dapat memba*a gen pada genom di satu organisme atau dapat "uga memba*a
gen ke genom organisme lain melalui kon"ugasi. &engan kon"ugasi, transposon dapat
memba*a gen ke genom sehingga sifat fenotipnya "uga berubah ('ill 2005.
Tu"uan praktikum +utagenesis dengan Transposon )on"ugasi adalah memindahkan
plasmid p/TminiTn5 )mr dari Escherichia coli $11 pir ke Rhodobacter sphaeroides
2..1 dan Chromobacterium violaceum, dan mendapatkan transkon"ugan yang resisten
terhadap antibiotik kanamisin dan rifampisin.
gnes
2013040001
)elompok 2
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
2/15
BAHAN DAN METODE
!ahan yang dibutuhkan pada praktikum +utagenesis dengan Transposon )on"ugasi
adalahEscherichia coli $11 pir yang memba*a plasmid p/TminiTn5 )mr,Rhodobacter
sphaeroides 2..1, Chromobacterium violaceum, media !, media , antibiotik rifampisin
dan kanamisin, dan garam fisiologis.
Pada praktikum +utagenesis dengan Transposon )on"ugasi, kultur ditumbuhkan pada
media ! )m maksimal 16 "am. )emudian, kultur Rhodobacter sphaeroides 2..1 dan
Chromobacterium violaceum "uga ditumbuhkan pada media ! 7if selama overnight. alu,
sebanyak 1 m kultur diambil dan dipindahkan ke tabung vial steril dan diberi label. )edua
vial kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 2 menit. $etelah itu, supernatan
hasil sentrifugasi dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 garam fisiologis. !iakan laludisentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 2 menit. Tahap selan"utnya, supernatan
hasil sentrifugasi dibuang dan pelet diresuspensi dengan 100 !. )ultur yang sudah
diresuspensi tersebut lalu dipindahkan ke dengan aturan sebagai berikut8
Tabel 1 Perlakuan
)ultur &onor resipien mating
(9% 7$
mating (9%
%:
E.coli 50 25 25 R.sphaeroides 2..1 50 25 ; 50
C.violaceum 50 25 )emudian, berisi donor diinkubasi pada suhu 3 % selama overnight, dan berisi
resipien dan mating diinkubasi pada suhu 30% selama overnight. $etelah semalaman,
diresuspensi dengan 200 garam fisiologis dan dipindahkan ke tabung vial steril berisi 400
garam fisiologis. alu, sebanyak 100 kultur disebar pada antibiotik dengan
ketentuan sebagai berikut8
Tabel 2 Perlakuan antibiotik
)ontrol ( )ontrol (
&onor )m (10, 104 7if (1007esipien 7if (10 )m (100
Mating )m 7if (100
berisi donor kemudian diinkubasi pada suhu 3% selama 2 hari, dan berisi resipien
dan mating diinkubasi pada suhu 30% selama 2 hari. Terakhir, dilakukan pengamatan dan
perhitungan "umlah bakteri.
$el ditumbuhkan pada media ! )m selama 16 "am agar plasmid tetap berada
dalam donor karena plasmid hanya muncul apabila keadaan tidak menguntungkan, seperti
adanya antibiotik dan agar sel aktif membelah pada fase log (+assey et al.2011. 7esipien
ditumbuhkan pada media ! 7if agar kontaminan yang tidak resisten antibiotik tersebut
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
3/15
tidak tumbuh (Passarge 200. )ultur diresuspensi dengan garam fisiologi untuk mencuci
kultur dari sisa media (
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
4/15
?ambar 2 )ontrol
positif (kiri dan
negatif (kanan resipien.
?ambar 3 Mating transkon"ugan 1 (kiri dan 2 (kanan.
PEMBAHASAN
!erdasarkan hasil pada praktikum, terdapat kontrol positif yang tidak tumbuh dan
kontrol negatif yang tumbuh pada donor. >asil yang seharusnya ter"adi adalah kontrol positif
yang tumbuh dan kontrol negatif yang tidak tumbuh. +enurut literatur, kontrol positif
seharusnya tumbuh karena pada sel donor, yaituEscherichia coli $11 pir yang memba*a
plasmid p/T miniTn5 )mr karena plasmid yang diba*a resisten terhadap antibiotik
kanamisin. $ementara itu, kontrol negatif seharusnya tidak tumbuh karena bakteri donor serta
plasmid yang diba*a tidak ada gen yang mengatur resistensi terhadap rifampisin (7ice =
!onomo 2005.
Pada kontrol positif resipien, semua bakteri tumbuh dimana hal tersebut sudah sesuai
dengan literatur yang mengatakan bah*a bakteri resipien Chromobacterium violaceum
bersifat resisten terhadap rifampisin (7ashid et al. 2013. !egitu "uga dengan resipien
Rhodobacter sphaeroides 2..1 yang memiliki resistensi terhadap rifampisin sehingga tetap
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
5/15
tumbuh pada kontrol positif yang mengandung rifampisin ()im et al. 2004. )ontrol negatif
resipien pada percobaan mayoritas tidak tumbuh sehingga sesuai dengan literatur yang
mengatakan bah*a C.violaceum danR.sphaeroides 2..1 sensitif terhadap kanamisin karena
merupakan antibiotik aminoglikosida sehingga tidak dapat tumbuh pada kontrol negatif
()umar 2012@ )och et al. 2011. +eski demikian, terdapat "uga kontrol negatif resipien yang
tumbuh sehingga tidak sesuai dengan literatur.
Perbedaan volume "uga mempengaruhi efisiensi kon"ugasi. Pada percobaan, mayoritas
resipien R.sphaeroides 2..1 dengan volume 25 tidak tumbuh, sementara yang 50
tumbuh. >al ini disebabkan pada kon"ugasi, dibutuhkan bakteri dalam konsentrasi yang besar
untuk memastikan kontak antar bakteri ter"adi. $emakin besar konsentrasi, semakin besar pula
kemungkinan ter"adinya kontak bakteri donor dengan resipien sehingga bakteri dengan
konsentrasi lebih besar akan menghasilkan efisiensi kon"ugasi yang lebih besar pula (in etal. 2011.
Pada percobaan, mayoritas transkon"ugan tidak tumbuh pada media )m 7if,
meskipun terdapat "uga transkon"ugan yang tumbuh pada media tersebut. >al ini kurang
sesuai dengan literatur yang mengatakan bah*a seharusnya ketika kon"ugasi ter"adi, mating
akan menghasilkan sifat yang sesuai dengan donor dan plasmid yang diba*anya karena
ter"adi transfer materi genetik. $eharusnya, karena donor memba*a plasmid dengan
transposon resisten kanamisin, maka resipien yang dihasilkan men"adi resisten kanamisin dan
rifampisin karena sebelumnya resipien sudah memiliki sifat resisten rifampisin lalu ditambah
sifat resisten kanamisin dari donor (Pommerville 2015.
Tidak tumbuhnya bakteri donor pada kontrol positif dapat disebabkan oleh terlalu
tingginya konsentrasi antibiotik pada media sehingga plasmid mengalami kerusakkan dan
instabilitas. Plasmid yang rusak dapat menyebabkan hilangnya terminator pada proses
transkripsi dan plasmid men"adi defektif, sehingga tidak dapat mengekspresikan gen tertentu,
khususnya gen penyandi resistensi antibiotik dan membuat sel men"adi tidak tumbuh pada
kontrol positif (%edric et al. 2005. $ementara itu, tumbuhnya bakteri donor pada kontrol
negatif donor disebabkan oleh kontaminasi bakteri lain yang resisten rifampisin. >al tersebut
menun"ukkan bakteri donor sebenarnya tidak tumbuh pada media kontrol negatif. Tumbuhnya
bakteri pada kontrol negatif "uga dapat ter"adi karena bakteri donor mengalami mutasi titik
pada gen rpoB yang mengkodekan subunit pada &' polimerase sehingga &'
polimerase tidak bisa mengikat rifampisin dan men"adi resisten (7oy 200. $ementara itu,
tumbuhnya bakteri resipien pada kontrol negatif resipien dapat disebabkan oleh tekanan dari
lingkungan luar yang menyebabkan mutasi dan reorganisasi genomik, khususnya pada
ribosom, sehingga ter"adi resistensi terhadap antibiotik tertentu misalnya kanamisin
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
6/15
(+c+ahon et al. 200. ?agalnya proses kon"ugasi pada bakteri dapat disebabkan oleh
mutasi pada gen trapada bakteri donor sehingga tidak dapat melangsungkan kon"ugasi. ?en
traberperan penting dalam kon"ugasi sebagai gen yang mengatur pembentukkan "embatan
pilus. +utasi tersebut kemungkinan ter"adi saat melakukan perema"aan bakteri (+origuchi et
al. 2013. $elain itu, Rhodobacter sphaeroides 2..1 "uga diketahui memiliki sistem 7'i
(7' interference dan memiliki en#im argonaut yang berfungsi untuk melindungi bakteri,
sehingga dapat memotong &' yang dikon"ugasikan karena bakteri menganggapnya sebagai
benda asing (:an der Aost et al. 201. $elain itu, banyaknya plasmid pada R.sphaeroides
2..1 "uga dapat menyebabkan transposon menyisip pada plasmid yang berbeda dan tidak
memiliki regulasi gen sehingga meski kon"ugasi sudah ter"adi, tapi tetap tidak tumbuh pada
media ()ontur et al. 2012. ?agalnya kon"ugasi "uga dapat disebabkan konsentrasi bakteri
yang terlalu rendah akibat pengenceran, dimana seharusnya proses kon"ugasi membutuhkankonsentrasi dalam "umlah yang cukup tinggi agar berhasil (in et al. 2011. )ontaminasi
dapat disebabkan oleh cenda*an yang tumbuh pada media. >al tersebut karena spora
cenda*an dapat beterbangan dan dapat menular secara aerosol. $elain itu, suhu optimum
cenda*an untuk tumbuh adalah 30%, sama seperti suhu untuk inkubasi petri mating ($tarr et
al. 2011. $elain itu, cenda*an "uga dapat tumbuh di ($chuck 201. )ontaminasi "uga
dapat ter"adi karena bakteri lain yang resisten terhadap antibiotik yang diberikan. ntibiotik
hanya beker"a pada spektrum tertentu sehingga tidak semua bakteri dapat dicegah
pertumbuhannya (+addison et al. 2004.
Pada kon"ugasi, bakteri memiliki elemen yang dapat menularkan diri (self-
transmissible element dan elemen yang dapat berpindah sendiri (mobilizable element.
9lemen yang dapat menularkan diri akan mengkodekan seluruh fungsi kon"ugasi yang
dibutuhkan untuk memediasi transfer dari donor menu"u resipien. 9lemen tersebut adalah
oriT, &tr, dan +pf. 9lemen yang dapat berpindahpindah dapat ditransfer secara kon"ugasi,
namun tidak mengkodekan seluruh fungsi yang dibutuhkan untuk transmisi. !iasanya, elemen
yang dapat berpindahpindah tersebut mengandung oriT dan &tr, namun tidak ada sistem +pf
disana. 9lemen yang dapat berpindah tersebut bergantung pada fungsi +pf dari elemen yang
dapat menularkan diri lain untuk transfer dari donor ke resipien. )on"ugasi memiliki tiga
komponen utama, yaitu situs &' yang berperan secara cisyang dinamakan a*al transfer
atau oriT@ protein &' transfer dan replikasi (&tr yang mengenal oriT dan membuat
potongan utas tunggal pada situs tersebut. Protein yang mengikat pada oriT dan menciptakan
potongan kecil dinamakan protein relaksase. )emudian, pada &tr terdapat "uga protein yang
menggabungkan kompleks oriT yang terpotong dan relaksase ke sistem pembentukkan
pasangan mating(+pf yang dinamakan coupling protein.Bungsi &tr disebut "uga gen mob@
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
7/15
lalu ada protein +pf yang membentuk struktur pili atau fimbria yang berasosiasi dengan
kon"ugasi, "uga membentuk poripori kon"ugasi yang berperan sebagai kanal pada transfer
&'. )omponen +pf pada hampir seluruh sistem kon"ugasi terdapat pada keluarga sekresi
tipe C: pada mekanisme sekresi protein di bakteri. $istem sekresi ini telah berkembang untuk
transpor &' dan substrat protein dan telah tersebar luas di antara spesies bakteri, termasuk
patogen. Bungsi +pf disebut "uga gen tra. +ekanisme rolling-circle replication pada
kon"ugasi adalah sebagai berikut. Protein relaksase mengikat oriT pada substrat &' dan
memotong salah satu utas &' untuk menghasilkan potongan utas tunggal. 7eaksi
pemotongan menghasilkan relaksase yang terikat secara kovalen pada u"ung 5D pada &'
yang dipotong pada residu tirosin yang ter"aga pada daerah u"ungpada protein. )emudian,
protein coupling, yang membentuk homoheksamer dan berasosiasi dengan bagian +pf pada
membran sitoplasma akan memfasilitasi interaksi antara oriT!relaksase dengan pori kon"ugasi.Protein coupling dapat melaksanakan transfer kompleks oriT!relaksase melalui poripori +pf
dan ke dalam sel resipien. $etelah transfer a*al dari kompleks ori;relaksase, &' utas
tunggal yang tersisa akan dipompa menu"u poripori +pf menu"u resipien. $etelah transfer
selesai, u"ung dari molekul utas tunggal akan digabungkan kembali oleh aktivitas ligase dari
protein relaksase, yang dihasilkan dari reaksi ini (Eilson 2006.
&onor yang digunakan adalah Escherichia coli $11 pir. !akteri ini merupakan
bakteri donor ?ram negatif dan bersifat anaerob fakultatif. !akteri ini dapat memobilisasi
plasmid yang mengandung oriT menu"u galur resipien dalam "angkauan luas melalui transfer
kon"ugasi yang bergantung pada 7P. )emudian, profage pir diintroduksi pada bakteri ini
untuk mengaktifkan replikasi vektor bunuh diri yang bergantung pada protein . !akteri ini
memba*a turunan 7P, 7P2Tc88+u pada lokasi kromosom yang berbeda, dimana gen
resisten tetrasiklin diganggu oleh profage temperate +u yang berfungsi secara penuh
sehingga dapat mengalami perkembangan men"adi partikel fage yang litik dan bebas.E.coli
$11 pir bersifat sensitif kanamisin dan resisten streptomisin;trimethoprim. Protein pir
yang mengkodekan terdapat pada transbakteri ini. Tanpa adanya protein pada resipien,
plasmid tidak dapat bereplikasi (Berrieres et al. 2010. $elain itu, bakteri ini tidak hanya
memobilisasi plasmid yang memba*a oriT, tapi "uga &' kromosomnya sendiri ke galur
resipien pada frekuensi 10per sel donor ($trand et al. 201.
7esipien yang digunakan adalah Chromobacterium violaceum dan Rhodobacter
sphaeroides 2..1. C.violaceum merupakan bakteri ?ram negatif berbentuk batang, besar,
motil, memiliki satu flagela polar dan satu atau dua flagela lateral, dan bersifat anaerob
fakultatif. !akteri ini dapat hidup pada media dengan nutrisi sederhana, seperti agar
+ac%onkey pada suhu 353%. !akteri ini positif pada reaksi katalase dan oksidase, dan
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
8/15
biasanya hidup di tanah dan air daerah tropis dan subtropis. C.violaceum dapat berperan
sebagai patogen oportunis pada he*an dan manusia. Arganisme ini menghasilkan pigmen
tidak larut air ber*arna ungu yang bernama violacein, dan merupakan antibiotik alami.
C.violaceum bersifat sensitif terhadap aminoglikosida, kloramfenikol, dan tetrasiklin tetapi
resisten terhadap amfisilin, penisilin, dan sefalosporin ()umar 2012. $elain itu, C.violaceum
"uga resisten terhadap rifampisin (7ashid et al. 2013.R.sphaeroides 2..1 merupakan bakteri
?ram negatif,purple nonsulfur photos"nthetic, dan terdapat dalam kelas lphaproteobacteria.
!akteri ini dapat tumbuh secara kemoheterotrof maupun autotrof, dan dapat mengikat
dinitrogen. R.sphaeroides 2..1 memiliki dua buah kromosom (C dan CC dan lima buah
plasmid (, !, %, &, dan 9 ()ontur et al. 2012. !akteri ini memproduksi sebuah >, ,4
cis--(tetradecenoyl homoserin lakton, dan memiliki gen cerR (homoloh lu#R dan cer$
(homolog lu#$%. +utasi pada cer$menyebabkan agregasi sel karena produksi yang berlebihandari polisakarida ekstraseluler.R.sphaeroides 2..1 memiliki sistem &uorum sensing(Eon et
al. 2004. !akteri ini tidak dapat melakukan denitrifikasi karena tidak memiliki en#im nitrit
reduktase yang menghasilkan 'A dari nitrit. kan tetapi, bakteri ini memiliki gen norCB
yang mengkodekan sitrokrom tipe bc 'A reduktase yang terikat pada membran, yang
mereduksi 'A men"adi '2A. Pertumbuhan bakteri ini dihambat oleh keberadaan 'A yang
dihasilkan oleh bakteri denitrifikasi lain. !akteri ini "uga memiliki regulator oksigen (Bnr,
regulator 'A ('nr7, dan regulator besi (rai et al. 2013. $elain itu, R.sphaeroides 2..1
"uga memiliki resistensi terhadap rifampisin ()im et al. 2004.
p/T adalah vektor bunuh diri yang bersifat kon"ugatif dan hanya dapat dipertahankan
pada galurE.coli yang mengekspresikan protein sepertiE.coli $11 pir. Plasmid ini biasa
disisipkan miniTn5 yang ditransposisikan ke dalam kromosom bakteri resipien. p/T "uga
dapat memba*a penanda antibiotik, seperti kanamisin sehingga turunannya yang resisten
kanamisin dinamakan p/T miniTn5 )mr ()adurugamu*a = Brancis 2004. p/T biasanya
didapat dari bakteri Bur'holderia mallei (Eaag = &e$ha#er 2005. Transposon pemba*a
miniTn5 adalah transposon komposit yang resisten terhadap kanamisin, bleomisin, dan
streptomisin, dan diapit oleh kopi dari C$(). 9lemen miniTn5 mengandung hanya sekuens
terminal dari elemen sisipan dan mengapit satu atau lebih determinan resisten. +iniTn5 "uga
mengandung situs restriksi internal otC untuk kloning gen yang diinginkan. +iniTn5
terintegrasi pada vektor bunuh diri, p/T. $aat disisipkan ke dalam kromosom, miniTn5 akan
tetap berada pada posisinya sebab transposase yang berperan dalam pergerakkannya berada di
belakang bersama plasmid (7ice = !onomo 2005.
*uicide plasmid adalah vektor yang memiliki "angkauan inang yang sempit dan tidak
dapat bereplikasi pada bakteri dengan "angkauan luas karena tidak adanya faktor atau protein
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
9/15
spesifik pada inang. %ontoh suicide plasmid adalah p$/P202, p?$:3, dan p/T (Eaag =
&e$ha#er 2005. Plasmid seperti ini biasanya memba*a transposon ke dalam sel tapi tidak
dapat bereplikasi dalam sel yang tidak memiliki protein tertentu sehingga tidak ada gen dari
plasmid tersebut yang terekspresi pada inang, hanya gen dari transposon. %ontoh transposon
yang biasa disisipkan padasuicide plasmid adalah Tn5 (odge et al. 200.
+erodiploid adalah peristi*a dimana suatu bakteri memba*a dua kopi dari suatu
segmen kromosom tertentu dan dikenal sebagai diploid sebagian. !iasanya, satu kopi berada
pada kromosom dan kopi kedua pada elemen genetik yang lain seperti plasmid atau
bakteriofage (+adigan et al. 2012. $el mendapatkan kopi kedua setelah ter"adinya kon"ugasi
dengan bakteri lain yang memiliki sel tersebut serta sedikit gen dari inang (%haudhuri 201.
%ontoh merodiploid adalah pada peristi*a high fre&uenc" recombination (>fr pada plasmid
B diE.coli. Plasmid B mengalami kon"ugasi secara >fr kepada sel E.coli B
sehingga plasmidB akan masuk ke dalam sel E.coli B dengan memba*a sedikit kromosom sel E.coli B
sehingga pada sel resipienE.coliBterdapat sebagian kromosomE.coli donor dan plasmid B.
$el yang menerima sebagian plasmid B tersebut tidak men"adi Bkarena hanya sebagian
plasmid dan sebagian kromosom yang ditransfer, sehingga sel yang seperti itu dinamakan sel
BD (Bprime (?ubbins et al. 2005.
Perbedaan biparental mating dengan triparental mating adalah biparental mating
hanya melibatkan satu bakteri donor dan satu bakteri resipien dalam proses kon"ugasinya,
sementara triparental mating membutuhkan satu bakteri donor, satu bakteri resipien, dan satu
plasmid pembantu dalam proses kon"ugasinya. Pada biparental mating, galur khusus pada
bakteri donor yang memiliki kopi &' tertentu pada kromosomnya diperlukan untuk
melakukan fungsi transfer in trans. $ementara itu, pada triparental mating, fungsi transfer
dilakukan oleh plasmid pembantu yang memiliki gen tra yang digunakan untuk transfer
plasmid tu"uan dari bakteri donor yang terpisah menu"u bakteri resipien (%hoi et al. 2004.
%ontoh dari biparental mating adalah ketika bakteri dari lingkungan dicampurkan oleh sel
resipien langsung untuk melakukan mating lalu langsung disebar padaplate. $ementara itu,
pada triparental mating, donor kedua yang memba*a plasmid CncF yang dapat berpindah
pindah dan memediasi ter"adinya transfer materi genetik ($malla et al. 2015.
ntibiotik yang digunakan pada praktikum adalah rifampisin dan kanamisin.
7ifampisin atau rifampin adalah antibiotik yang diisolasi secara sintetis dari bakteri
*treptom"ces mediterranei dan biasanya digunakan untuk pengobatan penyakit T!% pada
manusia. 7ifampin berperan dengan menghambat en#im 7' polimerase yang mengkatalisis
transkripsi &' men"adi 7'. 7ifampisin biasanya tidak mempan terhadap bakteri ?ram
negatif. !eberapa bakteri mengalami mutasi pada kromosomnya sehingga men"adi resisten
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
10/15
rifampisin. +utasi tersebut antara lain menyebabkan perubahan stabil pada 7' polimerase
yang mencegah ter"adinya pengikatan dengan rifampisin. 7ifampisin bersifat bakterisidal dan
memiliki aktivitas dengan "angkauan luas, seperti membunuh bakteri ?ram positif aerob
seperti *taph"lococcus dan Rhodococcus, membunuh Brucella, menghambat bakteri ?ram
positif dan ?ram negatif pada konsentrasi rendah, membunuh M"cobacterium tuberculosis,
beberapa "enis proto#oa, beberapa "enis cenda*an dan po#virus. 7ifampisin efektif pada
bakteri intraseluler dan dapat melakukan diasetilasi di hati men"adi metabolit aktif (+addison
et al. 2004. $ementara itu, kanamisin adalah antibiotik aminoglikosida yang diproduksi
secara alami pada fermentasi bakteri *treptom"ces 'anam"ceticus. !iasanya, kanamisin
digunakan untuk penyakit yang disebabkan oleh bakteri ?ram negatif dan bakteri ?ram
positif. $elain itu, kanamisin "uga dapat digunakan untuk pengobatan T!% karena
aktivitasnya terhadap M"cobacterium tuberculosis. )anamisin beker"a dengan menghambatsintesis protein pada sel bakteri. )anamisin akan mengikat secara irreversiblepada subunit
ribosom 30$ dan 50$, sehingga sintesis protein terganggu. )anamisin mengandung kanamisin
sebagai komponen aktif utamanya dan se"umlah kecil komponen yang mirip strukturnya,
seperti kanamisin ! dan %. )anamisin memiliki empat gugus amino primer dan tu"uh gugus
A> sekunder ()och et al. 2011.
!akteri donor tidak dapat melakukan kon"ugasi dengan sesama bakteri donor karena
terdapat eksklusi permukaan sehingga transfer antara keduanya tidak dapat dilakukan. Proses
kon"ugasi keduanya dapat menyebabkan hilangnya salah satu donor sel dan peristi*a #igosis
yang mematikan. Mating antara kedua bakteri donor dapat menyebabkan kematian karena
rusaknya membran dan peptidoglikan, serta induksi respon $A$ yang menyebabkan besarnya
arus &' utas tunggal. +ekanisme ekslusi permukaan melibatkan lipoprotein TraT dan Tra$
yang membentuk struktur pentamerik dan menghalangi poripori sehingga kon"ugasi tidak
dapat ter"adi atau bisa ter"adi namun dengan efisiensi yang sangat kecil (Brost 200.
$alah satu aplikasi kon"ugasi adalah transfer molekul &' eksogen ke dalam
mitokondria mamalia. +etode ini dilakukan dengan menyisipkan sekuens oriT ke konstruksi
&', memasukkan konstruksi &' ke dalam E.coli, dan mengintroduksi &' yang dapat
berpindahpindah melalui kon"ugasi. +etode ini dapat dilakukan untuk mengkonstruksi &'
secara in vitro dan untuk mempela"ari ekspresi dari &' mitokondria pada mamalia. Transfer
&' utas tunggal secara kon"ugasi merupakan substrat yang baik untuk rekombinasi ke
dalam genom mitokondria endogen, untuk mengkarakterisasi sistem rekombinasi mitokondria
dan kemungkinan "uga dapat memodifikasi genom tersebut sehingga merupakan aplikasi yang
baik untuk penelitian dasar maupun aplikatif (
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
11/15
regularl" interspaced short palindromic repeats yang ditransfer melalui kon"ugasi. $el akan
direkayasa berbeda dari sel target untuk melakukan 'noc'do+n gen, sehingga manipulasi
target populasi sel dapat dilakukan tanpa kontak langsung. Pada percobaan ini, sistem
%7C$P7 ditransfer melalui kon"ugasi pada sel target E.coli untuk menekan ekspresi gen
m7BP. 7egulasi gen oleh %7C$P7, represi atau aktivasi, diharapkan dapat membunuh sel
dengan cara pemotongan &' dengan situs %as yang aktif, bahkan transmisi sirkuit
%7C$P7 yang membuat respon seluler. Transfer sistem %7C$P7 melalui kon"ugasi ini
memiliki peran besar dalam mengatur populasi bakteri di berbagai tempat (-i et al. 201.
SIMPULAN
)ontrol positif pada donor tumbuh karena E.coli $11 pir memba*a transposon
miniTn5 )mryang resisten kanamisin sehingga dapat tumbuh di media. )ontrol negatif tidak
tumbuh karena donor tidak ada resisten terhadap rifampin. $ebaliknya, kontrol positif resipien
dapat tumbuh karena C.violaceum dan R.sphaeroides 2..1 memiliki resistensi terhadap
rifampin, namun tidak ada resistensi terhadap kanamisin. Tumbuhnya transkon"ugan pada
media yang berisi kedua antibiotik menun"ukkan kon"ugasi berhasil.
Plasmid p/TminiTn5 )mr dariEscherichia coli $11 pirberhasil dipindahkan ke
Rhodobacter sphaeroides 2..1 dan Chromobacterium violaceum. &engan demikian,
transkon"ugan yang resisten kanamisin dan rifampisin "uga berhasil didapat, khususnya pada
transkon"ugan C.violaceum. $ifat resisten kanamisin pada transkon"ugan didapat dari plasmid
yang memba*a transposon, transposon tersebut mengkodekan gen yang resisten kanamisin.
$ifat resisten rifampisin berasal dari sel resipien sendiri yang memiliki sifat tersebut.
Transkon"ugan R.sphaeroides 2..1 cenderung sulit dikon"ugasi karena memiliki
sistem 7'i dan lima buah plasmid. )on"ugasi cenderung berlangsung secara acak sehingga
terdapat plasmid pada R.sphaeroides 2..1 ada yang tidak mengekspresikan sifat donor.
Plasmid bunuh diri p/T dapat tinggal pada donor karena keberadaan protein yang
dikodekan oleh genpirpada bakteri donor yang merupakan syarat bagi plasmid untuk dapat
bereplikasi.
$emakin banyak "umlah sel yang melakukan kon"ugasi, semakin besar kemungkinan
kon"ugasi dapat ter"adi karena semakin banyak sel yang melakukan kontak, terlihat dari hasil
pengamatan dimana resipien dengan volume 50 lebih berhasil melakukan kon"ugasi
dibandingkan dengan resipien yang volumenya 25 .
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
12/15
DAFTAR PUSTAKA
%edric lm 22226.
)im 9-, )im -$, ee C>, 7hee >-, ee -). 2004. $uperoGide generation by chlorophyllide a
reductase ofRhodobacter sphaeroides.4 Biol Chem 2438314330.
)limke E et al. 2005. The mating pair stabili#ation protein, Tra', of the B plasmid is an
outermembrane protein *ith t*o regions that are important for its function in
con"ugation.Microbiolog" 151(118352350.
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
13/15
)och , !asar $, 7ichter 7. 2011. >P% of carbohydrates. &i dalam8 Eaksmund#ka>a"nos
+, $herma -, editor. igh Performance 7i&uid Chromatograph" in Ph"tochemical
6nal"sis. !oca 7aton8 %7%. >lm 32.
)ontur E$ et al. 2012. 7evised seHuence and annotation of the Rhodobacter sphaeroides
2..1 genome.4 Bacteriol 1(2801601.
)umar +7. 2012. Chromobacterium violaceum8 rare bacterium isolated from a *ound over
the scalp.$nt 4 6ppl Basic Med Res 2(1802.
in et al. 2011. Cnhibition of bacterial con"ugation by phage +13 and its protein g3p8
Huantitative analysis and model.P7o* 8E 6(58111.
odge -, und P, +inchin $. 200. ene Cloning Principles and 6pplications. 'e* lm 1504.
7oy P>. 200. ?enetic mechanisms of transfer of drug resistance. &i dalam8 +ayers &,
editor.6ntimicrobial 5rug Resistance Mechanisms of 5rug Resistance. :olume ke1.
'e* umana. >lm 523.
$chuck $, Eeinhold , uu :T, !ald*in CT. 201. Csolating fungal pathogens from a
dynamic disease outbreak in a native plant population to establish plantpathogenbioassays for the ecological model planticotiana attenuata.P7o* 8E (811.
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
14/15
$malla ), -echalke $, Top 9+. 2015. Plasmid detection, characteri#ation, and ecology.
Microbiol *pec 3(3811.
$tarr %, 9vers %, $tarr . 2011.Biolog" Concepts and 6pplications +ithout Ph"siolog". 9d
ke4. !elmont8 !rooks;%ole.
$trand T, ale 7, &egnes )B, ando +, :alla $. 201. ne* and improved hostindependent plasmid system for 7)2based con"ugal transfer.P7o* 8E (3816.
:an der Aost -, $*ast &%, -ore ++. 201. Prokaryotic argonautesvariation on the 7'
interference theme.Microb Cell 1(5815415.
Eaag &+, &e$ha#er &. 2005. ?landers8 ne* insights into an old disease. &i dalam8
indler 9, ebeda B-, )orch ?E, editor. Biological 9eapons 5efense $nfectious
5isease and Counterbioterrorism. Toto*a8 >umana. >lm 20234.
Eilson -E. 2006. ?enetic eGchange in bacteria and the modular structure of mobile &'
elements. &i dalam8 'ickerson %, $churr +-, editor. Molecular Paradigms of$nfectious 5isease 6 Bacterial Perspective. 'e* lm 35.
-
7/24/2019 Laporan Transkonjugasi
15/15
LAMPIRAN
(