laporan transkonjugasi

7/24/2019 Laporan Transkonjugasi

1/15

MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON KONJUGASI

PENDAHULUAN

Transfer gen atau rekombinasi genetik adalah proses mencampurkan gen dari satu

organisme ke organisme lain sehingga organisme mengalami perubahan pada materi

genetiknya. Perubahan materi genetik tersebut disebut mutasi, dimana mutasi tersebut dapat

menyebabkan perubahan yang permanen pada suatu organisme (Pommerville 2015.

!erdasarkan prosesnya, transfer gen dapat dibedakan men"adi transfer gen vertikal dan

transfer gen hori#ontal. Transfer gen vertikal adalah proses perpindahan materi genetik secara

aseksual, contohnya adalah melalui pembelahan biner. $ementara itu, transfer gen hori#ontal

melibatkan perpindahan materi genetik dari sel donor menu"u sel resipien secara lateral.%ontoh transfer gen hori#ontal adalah melalui transformasi, transduksi, dan kon"ugasi.

Transformasi adalah pengambilan &' telan"ang dari lingkungan, transduksi merupakan

proses transfer materi genetik dengan perantara virus, sementara kon"ugasi adalah proses

transfer materi genetik yang membutuhkan kontak antar sel (Pommerville 2015.

)on"ugasi merupakan mekanisme transfer materi genetik pada dua sel bakteri dan sel

donor akan memberikan &', biasanya plasmid, kepada sel resipien. $el resipien yang

menerima materi genetik dari sel donor akan memiliki sifat yang sama dari sel donor setelah

proses matingberhasil. Proses ini di"embatani dengan pilus yang dibentuk oleh bakteri untuk

men"adi perantara le*atnya &' plasmid dari sel donor ke sel resipien sehingga "arak kedua

sel men"adi memendek dan sitoplasma kedua sel dapat terhubung(Pommerville 2015.

$elain plasmid, proses kon"ugasi "uga dapat mentransfer materi genetik berupa

transposon. Transposon merupakan sekuens &' yang dapat bereplikasi dan memasukkan

satu buah kopi &' tersebut pada lokasi yang baru pada genom. Transposon ditemukan di

"agung oleh !arbara +c%lintock pada tahun 150 dan di bakteri oleh -oshua ederberg.

Transposon dapat memba*a gen pada genom di satu organisme atau dapat "uga memba*a

gen ke genom organisme lain melalui kon"ugasi. &engan kon"ugasi, transposon dapat

memba*a gen ke genom sehingga sifat fenotipnya "uga berubah ('ill 2005.

Tu"uan praktikum +utagenesis dengan Transposon )on"ugasi adalah memindahkan

plasmid p/TminiTn5 )mr dari Escherichia coli $11 pir ke Rhodobacter sphaeroides

2..1 dan Chromobacterium violaceum, dan mendapatkan transkon"ugan yang resisten

terhadap antibiotik kanamisin dan rifampisin.

gnes

2013040001

)elompok 2


2/15

BAHAN DAN METODE

!ahan yang dibutuhkan pada praktikum +utagenesis dengan Transposon )on"ugasi

adalahEscherichia coli $11 pir yang memba*a plasmid p/TminiTn5 )mr,Rhodobacter

sphaeroides 2..1, Chromobacterium violaceum, media !, media , antibiotik rifampisin

dan kanamisin, dan garam fisiologis.

Pada praktikum +utagenesis dengan Transposon )on"ugasi, kultur ditumbuhkan pada

media ! )m maksimal 16 "am. )emudian, kultur Rhodobacter sphaeroides 2..1 dan

Chromobacterium violaceum "uga ditumbuhkan pada media ! 7if selama overnight. alu,

sebanyak 1 m kultur diambil dan dipindahkan ke tabung vial steril dan diberi label. )edua

vial kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 2 menit. $etelah itu, supernatan

hasil sentrifugasi dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 garam fisiologis. !iakan laludisentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 2 menit. Tahap selan"utnya, supernatan

hasil sentrifugasi dibuang dan pelet diresuspensi dengan 100 !. )ultur yang sudah

diresuspensi tersebut lalu dipindahkan ke dengan aturan sebagai berikut8

Tabel 1 Perlakuan

)ultur &onor resipien mating

(9% 7$

mating (9%

%:

E.coli 50 25 25 R.sphaeroides 2..1 50 25 ; 50

C.violaceum 50 25 )emudian, berisi donor diinkubasi pada suhu 3 % selama overnight, dan berisi

resipien dan mating diinkubasi pada suhu 30% selama overnight. $etelah semalaman,

diresuspensi dengan 200 garam fisiologis dan dipindahkan ke tabung vial steril berisi 400

garam fisiologis. alu, sebanyak 100 kultur disebar pada antibiotik dengan

ketentuan sebagai berikut8

Tabel 2 Perlakuan antibiotik

)ontrol ( )ontrol (

&onor )m (10, 104 7if (1007esipien 7if (10 )m (100

Mating )m 7if (100

berisi donor kemudian diinkubasi pada suhu 3% selama 2 hari, dan berisi resipien

dan mating diinkubasi pada suhu 30% selama 2 hari. Terakhir, dilakukan pengamatan dan

perhitungan "umlah bakteri.

$el ditumbuhkan pada media ! )m selama 16 "am agar plasmid tetap berada

dalam donor karena plasmid hanya muncul apabila keadaan tidak menguntungkan, seperti

adanya antibiotik dan agar sel aktif membelah pada fase log (+assey et al.2011. 7esipien

ditumbuhkan pada media ! 7if agar kontaminan yang tidak resisten antibiotik tersebut


3/15

tidak tumbuh (Passarge 200. )ultur diresuspensi dengan garam fisiologi untuk mencuci

kultur dari sisa media (


4/15

?ambar 2 )ontrol

positif (kiri dan

negatif (kanan resipien.

?ambar 3 Mating transkon"ugan 1 (kiri dan 2 (kanan.

PEMBAHASAN

!erdasarkan hasil pada praktikum, terdapat kontrol positif yang tidak tumbuh dan

kontrol negatif yang tumbuh pada donor. >asil yang seharusnya ter"adi adalah kontrol positif

yang tumbuh dan kontrol negatif yang tidak tumbuh. +enurut literatur, kontrol positif

seharusnya tumbuh karena pada sel donor, yaituEscherichia coli $11 pir yang memba*a

plasmid p/T miniTn5 )mr karena plasmid yang diba*a resisten terhadap antibiotik

kanamisin. $ementara itu, kontrol negatif seharusnya tidak tumbuh karena bakteri donor serta

plasmid yang diba*a tidak ada gen yang mengatur resistensi terhadap rifampisin (7ice =

!onomo 2005.

Pada kontrol positif resipien, semua bakteri tumbuh dimana hal tersebut sudah sesuai

dengan literatur yang mengatakan bah*a bakteri resipien Chromobacterium violaceum

bersifat resisten terhadap rifampisin (7ashid et al. 2013. !egitu "uga dengan resipien

Rhodobacter sphaeroides 2..1 yang memiliki resistensi terhadap rifampisin sehingga tetap


5/15

tumbuh pada kontrol positif yang mengandung rifampisin ()im et al. 2004. )ontrol negatif

resipien pada percobaan mayoritas tidak tumbuh sehingga sesuai dengan literatur yang

mengatakan bah*a C.violaceum danR.sphaeroides 2..1 sensitif terhadap kanamisin karena

merupakan antibiotik aminoglikosida sehingga tidak dapat tumbuh pada kontrol negatif

()umar 2012@ )och et al. 2011. +eski demikian, terdapat "uga kontrol negatif resipien yang

tumbuh sehingga tidak sesuai dengan literatur.

Perbedaan volume "uga mempengaruhi efisiensi kon"ugasi. Pada percobaan, mayoritas

resipien R.sphaeroides 2..1 dengan volume 25 tidak tumbuh, sementara yang 50

tumbuh. >al ini disebabkan pada kon"ugasi, dibutuhkan bakteri dalam konsentrasi yang besar

untuk memastikan kontak antar bakteri ter"adi. $emakin besar konsentrasi, semakin besar pula

kemungkinan ter"adinya kontak bakteri donor dengan resipien sehingga bakteri dengan

konsentrasi lebih besar akan menghasilkan efisiensi kon"ugasi yang lebih besar pula (in etal. 2011.

Pada percobaan, mayoritas transkon"ugan tidak tumbuh pada media )m 7if,

meskipun terdapat "uga transkon"ugan yang tumbuh pada media tersebut. >al ini kurang

sesuai dengan literatur yang mengatakan bah*a seharusnya ketika kon"ugasi ter"adi, mating

akan menghasilkan sifat yang sesuai dengan donor dan plasmid yang diba*anya karena

ter"adi transfer materi genetik. $eharusnya, karena donor memba*a plasmid dengan

transposon resisten kanamisin, maka resipien yang dihasilkan men"adi resisten kanamisin dan

rifampisin karena sebelumnya resipien sudah memiliki sifat resisten rifampisin lalu ditambah

sifat resisten kanamisin dari donor (Pommerville 2015.

Tidak tumbuhnya bakteri donor pada kontrol positif dapat disebabkan oleh terlalu

tingginya konsentrasi antibiotik pada media sehingga plasmid mengalami kerusakkan dan

instabilitas. Plasmid yang rusak dapat menyebabkan hilangnya terminator pada proses

transkripsi dan plasmid men"adi defektif, sehingga tidak dapat mengekspresikan gen tertentu,

khususnya gen penyandi resistensi antibiotik dan membuat sel men"adi tidak tumbuh pada

kontrol positif (%edric et al. 2005. $ementara itu, tumbuhnya bakteri donor pada kontrol

negatif donor disebabkan oleh kontaminasi bakteri lain yang resisten rifampisin. >al tersebut

menun"ukkan bakteri donor sebenarnya tidak tumbuh pada media kontrol negatif. Tumbuhnya

bakteri pada kontrol negatif "uga dapat ter"adi karena bakteri donor mengalami mutasi titik

pada gen rpoB yang mengkodekan subunit pada &' polimerase sehingga &'

polimerase tidak bisa mengikat rifampisin dan men"adi resisten (7oy 200. $ementara itu,

tumbuhnya bakteri resipien pada kontrol negatif resipien dapat disebabkan oleh tekanan dari

lingkungan luar yang menyebabkan mutasi dan reorganisasi genomik, khususnya pada

ribosom, sehingga ter"adi resistensi terhadap antibiotik tertentu misalnya kanamisin


6/15

(+c+ahon et al. 200. ?agalnya proses kon"ugasi pada bakteri dapat disebabkan oleh

mutasi pada gen trapada bakteri donor sehingga tidak dapat melangsungkan kon"ugasi. ?en

traberperan penting dalam kon"ugasi sebagai gen yang mengatur pembentukkan "embatan

pilus. +utasi tersebut kemungkinan ter"adi saat melakukan perema"aan bakteri (+origuchi et

al. 2013. $elain itu, Rhodobacter sphaeroides 2..1 "uga diketahui memiliki sistem 7'i

(7' interference dan memiliki en#im argonaut yang berfungsi untuk melindungi bakteri,

sehingga dapat memotong &' yang dikon"ugasikan karena bakteri menganggapnya sebagai

benda asing (:an der Aost et al. 201. $elain itu, banyaknya plasmid pada R.sphaeroides

2..1 "uga dapat menyebabkan transposon menyisip pada plasmid yang berbeda dan tidak

memiliki regulasi gen sehingga meski kon"ugasi sudah ter"adi, tapi tetap tidak tumbuh pada

media ()ontur et al. 2012. ?agalnya kon"ugasi "uga dapat disebabkan konsentrasi bakteri

yang terlalu rendah akibat pengenceran, dimana seharusnya proses kon"ugasi membutuhkankonsentrasi dalam "umlah yang cukup tinggi agar berhasil (in et al. 2011. )ontaminasi

dapat disebabkan oleh cenda*an yang tumbuh pada media. >al tersebut karena spora

cenda*an dapat beterbangan dan dapat menular secara aerosol. $elain itu, suhu optimum

cenda*an untuk tumbuh adalah 30%, sama seperti suhu untuk inkubasi petri mating ($tarr et

al. 2011. $elain itu, cenda*an "uga dapat tumbuh di ($chuck 201. )ontaminasi "uga

dapat ter"adi karena bakteri lain yang resisten terhadap antibiotik yang diberikan. ntibiotik

hanya beker"a pada spektrum tertentu sehingga tidak semua bakteri dapat dicegah

pertumbuhannya (+addison et al. 2004.

Pada kon"ugasi, bakteri memiliki elemen yang dapat menularkan diri (self-

transmissible element dan elemen yang dapat berpindah sendiri (mobilizable element.

9lemen yang dapat menularkan diri akan mengkodekan seluruh fungsi kon"ugasi yang

dibutuhkan untuk memediasi transfer dari donor menu"u resipien. 9lemen tersebut adalah

oriT, &tr, dan +pf. 9lemen yang dapat berpindahpindah dapat ditransfer secara kon"ugasi,

namun tidak mengkodekan seluruh fungsi yang dibutuhkan untuk transmisi. !iasanya, elemen

yang dapat berpindahpindah tersebut mengandung oriT dan &tr, namun tidak ada sistem +pf

disana. 9lemen yang dapat berpindah tersebut bergantung pada fungsi +pf dari elemen yang

dapat menularkan diri lain untuk transfer dari donor ke resipien. )on"ugasi memiliki tiga

komponen utama, yaitu situs &' yang berperan secara cisyang dinamakan a*al transfer

atau oriT@ protein &' transfer dan replikasi (&tr yang mengenal oriT dan membuat

potongan utas tunggal pada situs tersebut. Protein yang mengikat pada oriT dan menciptakan

potongan kecil dinamakan protein relaksase. )emudian, pada &tr terdapat "uga protein yang

menggabungkan kompleks oriT yang terpotong dan relaksase ke sistem pembentukkan

pasangan mating(+pf yang dinamakan coupling protein.Bungsi &tr disebut "uga gen mob@


7/15

lalu ada protein +pf yang membentuk struktur pili atau fimbria yang berasosiasi dengan

kon"ugasi, "uga membentuk poripori kon"ugasi yang berperan sebagai kanal pada transfer

&'. )omponen +pf pada hampir seluruh sistem kon"ugasi terdapat pada keluarga sekresi

tipe C: pada mekanisme sekresi protein di bakteri. $istem sekresi ini telah berkembang untuk

transpor &' dan substrat protein dan telah tersebar luas di antara spesies bakteri, termasuk

patogen. Bungsi +pf disebut "uga gen tra. +ekanisme rolling-circle replication pada

kon"ugasi adalah sebagai berikut. Protein relaksase mengikat oriT pada substrat &' dan

memotong salah satu utas &' untuk menghasilkan potongan utas tunggal. 7eaksi

pemotongan menghasilkan relaksase yang terikat secara kovalen pada u"ung 5D pada &'

yang dipotong pada residu tirosin yang ter"aga pada daerah u"ungpada protein. )emudian,

protein coupling, yang membentuk homoheksamer dan berasosiasi dengan bagian +pf pada

membran sitoplasma akan memfasilitasi interaksi antara oriT!relaksase dengan pori kon"ugasi.Protein coupling dapat melaksanakan transfer kompleks oriT!relaksase melalui poripori +pf

dan ke dalam sel resipien. $etelah transfer a*al dari kompleks ori;relaksase, &' utas

tunggal yang tersisa akan dipompa menu"u poripori +pf menu"u resipien. $etelah transfer

selesai, u"ung dari molekul utas tunggal akan digabungkan kembali oleh aktivitas ligase dari

protein relaksase, yang dihasilkan dari reaksi ini (Eilson 2006.

&onor yang digunakan adalah Escherichia coli $11 pir. !akteri ini merupakan

bakteri donor ?ram negatif dan bersifat anaerob fakultatif. !akteri ini dapat memobilisasi

plasmid yang mengandung oriT menu"u galur resipien dalam "angkauan luas melalui transfer

kon"ugasi yang bergantung pada 7P. )emudian, profage pir diintroduksi pada bakteri ini

untuk mengaktifkan replikasi vektor bunuh diri yang bergantung pada protein . !akteri ini

memba*a turunan 7P, 7P2Tc88+u pada lokasi kromosom yang berbeda, dimana gen

resisten tetrasiklin diganggu oleh profage temperate +u yang berfungsi secara penuh

sehingga dapat mengalami perkembangan men"adi partikel fage yang litik dan bebas.E.coli

$11 pir bersifat sensitif kanamisin dan resisten streptomisin;trimethoprim. Protein pir

yang mengkodekan terdapat pada transbakteri ini. Tanpa adanya protein pada resipien,

plasmid tidak dapat bereplikasi (Berrieres et al. 2010. $elain itu, bakteri ini tidak hanya

memobilisasi plasmid yang memba*a oriT, tapi "uga &' kromosomnya sendiri ke galur

resipien pada frekuensi 10per sel donor ($trand et al. 201.

7esipien yang digunakan adalah Chromobacterium violaceum dan Rhodobacter

sphaeroides 2..1. C.violaceum merupakan bakteri ?ram negatif berbentuk batang, besar,

motil, memiliki satu flagela polar dan satu atau dua flagela lateral, dan bersifat anaerob

fakultatif. !akteri ini dapat hidup pada media dengan nutrisi sederhana, seperti agar

+ac%onkey pada suhu 353%. !akteri ini positif pada reaksi katalase dan oksidase, dan


8/15

biasanya hidup di tanah dan air daerah tropis dan subtropis. C.violaceum dapat berperan

sebagai patogen oportunis pada he*an dan manusia. Arganisme ini menghasilkan pigmen

tidak larut air ber*arna ungu yang bernama violacein, dan merupakan antibiotik alami.

C.violaceum bersifat sensitif terhadap aminoglikosida, kloramfenikol, dan tetrasiklin tetapi

resisten terhadap amfisilin, penisilin, dan sefalosporin ()umar 2012. $elain itu, C.violaceum

"uga resisten terhadap rifampisin (7ashid et al. 2013.R.sphaeroides 2..1 merupakan bakteri

?ram negatif,purple nonsulfur photos"nthetic, dan terdapat dalam kelas lphaproteobacteria.

!akteri ini dapat tumbuh secara kemoheterotrof maupun autotrof, dan dapat mengikat

dinitrogen. R.sphaeroides 2..1 memiliki dua buah kromosom (C dan CC dan lima buah

plasmid (, !, %, &, dan 9 ()ontur et al. 2012. !akteri ini memproduksi sebuah >, ,4

cis--(tetradecenoyl homoserin lakton, dan memiliki gen cerR (homoloh lu#R dan cer$

(homolog lu#$%. +utasi pada cer$menyebabkan agregasi sel karena produksi yang berlebihandari polisakarida ekstraseluler.R.sphaeroides 2..1 memiliki sistem &uorum sensing(Eon et

al. 2004. !akteri ini tidak dapat melakukan denitrifikasi karena tidak memiliki en#im nitrit

reduktase yang menghasilkan 'A dari nitrit. kan tetapi, bakteri ini memiliki gen norCB

yang mengkodekan sitrokrom tipe bc 'A reduktase yang terikat pada membran, yang

mereduksi 'A men"adi '2A. Pertumbuhan bakteri ini dihambat oleh keberadaan 'A yang

dihasilkan oleh bakteri denitrifikasi lain. !akteri ini "uga memiliki regulator oksigen (Bnr,

regulator 'A ('nr7, dan regulator besi (rai et al. 2013. $elain itu, R.sphaeroides 2..1

"uga memiliki resistensi terhadap rifampisin ()im et al. 2004.

p/T adalah vektor bunuh diri yang bersifat kon"ugatif dan hanya dapat dipertahankan

pada galurE.coli yang mengekspresikan protein sepertiE.coli $11 pir. Plasmid ini biasa

disisipkan miniTn5 yang ditransposisikan ke dalam kromosom bakteri resipien. p/T "uga

dapat memba*a penanda antibiotik, seperti kanamisin sehingga turunannya yang resisten

kanamisin dinamakan p/T miniTn5 )mr ()adurugamu*a = Brancis 2004. p/T biasanya

didapat dari bakteri Bur'holderia mallei (Eaag = &e$ha#er 2005. Transposon pemba*a

miniTn5 adalah transposon komposit yang resisten terhadap kanamisin, bleomisin, dan

streptomisin, dan diapit oleh kopi dari C$(). 9lemen miniTn5 mengandung hanya sekuens

terminal dari elemen sisipan dan mengapit satu atau lebih determinan resisten. +iniTn5 "uga

mengandung situs restriksi internal otC untuk kloning gen yang diinginkan. +iniTn5

terintegrasi pada vektor bunuh diri, p/T. $aat disisipkan ke dalam kromosom, miniTn5 akan

tetap berada pada posisinya sebab transposase yang berperan dalam pergerakkannya berada di

belakang bersama plasmid (7ice = !onomo 2005.

*uicide plasmid adalah vektor yang memiliki "angkauan inang yang sempit dan tidak

dapat bereplikasi pada bakteri dengan "angkauan luas karena tidak adanya faktor atau protein


9/15

spesifik pada inang. %ontoh suicide plasmid adalah p$/P202, p?$:3, dan p/T (Eaag =

&e$ha#er 2005. Plasmid seperti ini biasanya memba*a transposon ke dalam sel tapi tidak

dapat bereplikasi dalam sel yang tidak memiliki protein tertentu sehingga tidak ada gen dari

plasmid tersebut yang terekspresi pada inang, hanya gen dari transposon. %ontoh transposon

yang biasa disisipkan padasuicide plasmid adalah Tn5 (odge et al. 200.

+erodiploid adalah peristi*a dimana suatu bakteri memba*a dua kopi dari suatu

segmen kromosom tertentu dan dikenal sebagai diploid sebagian. !iasanya, satu kopi berada

pada kromosom dan kopi kedua pada elemen genetik yang lain seperti plasmid atau

bakteriofage (+adigan et al. 2012. $el mendapatkan kopi kedua setelah ter"adinya kon"ugasi

dengan bakteri lain yang memiliki sel tersebut serta sedikit gen dari inang (%haudhuri 201.

%ontoh merodiploid adalah pada peristi*a high fre&uenc" recombination (>fr pada plasmid

B diE.coli. Plasmid B mengalami kon"ugasi secara >fr kepada sel E.coli B

sehingga plasmidB akan masuk ke dalam sel E.coli B dengan memba*a sedikit kromosom sel E.coli B

sehingga pada sel resipienE.coliBterdapat sebagian kromosomE.coli donor dan plasmid B.

$el yang menerima sebagian plasmid B tersebut tidak men"adi Bkarena hanya sebagian

plasmid dan sebagian kromosom yang ditransfer, sehingga sel yang seperti itu dinamakan sel

BD (Bprime (?ubbins et al. 2005.

Perbedaan biparental mating dengan triparental mating adalah biparental mating

hanya melibatkan satu bakteri donor dan satu bakteri resipien dalam proses kon"ugasinya,

sementara triparental mating membutuhkan satu bakteri donor, satu bakteri resipien, dan satu

plasmid pembantu dalam proses kon"ugasinya. Pada biparental mating, galur khusus pada

bakteri donor yang memiliki kopi &' tertentu pada kromosomnya diperlukan untuk

melakukan fungsi transfer in trans. $ementara itu, pada triparental mating, fungsi transfer

dilakukan oleh plasmid pembantu yang memiliki gen tra yang digunakan untuk transfer

plasmid tu"uan dari bakteri donor yang terpisah menu"u bakteri resipien (%hoi et al. 2004.

%ontoh dari biparental mating adalah ketika bakteri dari lingkungan dicampurkan oleh sel

resipien langsung untuk melakukan mating lalu langsung disebar padaplate. $ementara itu,

pada triparental mating, donor kedua yang memba*a plasmid CncF yang dapat berpindah

pindah dan memediasi ter"adinya transfer materi genetik ($malla et al. 2015.

ntibiotik yang digunakan pada praktikum adalah rifampisin dan kanamisin.

7ifampisin atau rifampin adalah antibiotik yang diisolasi secara sintetis dari bakteri

*treptom"ces mediterranei dan biasanya digunakan untuk pengobatan penyakit T!% pada

manusia. 7ifampin berperan dengan menghambat en#im 7' polimerase yang mengkatalisis

transkripsi &' men"adi 7'. 7ifampisin biasanya tidak mempan terhadap bakteri ?ram

negatif. !eberapa bakteri mengalami mutasi pada kromosomnya sehingga men"adi resisten


10/15

rifampisin. +utasi tersebut antara lain menyebabkan perubahan stabil pada 7' polimerase

yang mencegah ter"adinya pengikatan dengan rifampisin. 7ifampisin bersifat bakterisidal dan

memiliki aktivitas dengan "angkauan luas, seperti membunuh bakteri ?ram positif aerob

seperti *taph"lococcus dan Rhodococcus, membunuh Brucella, menghambat bakteri ?ram

positif dan ?ram negatif pada konsentrasi rendah, membunuh M"cobacterium tuberculosis,

beberapa "enis proto#oa, beberapa "enis cenda*an dan po#virus. 7ifampisin efektif pada

bakteri intraseluler dan dapat melakukan diasetilasi di hati men"adi metabolit aktif (+addison

et al. 2004. $ementara itu, kanamisin adalah antibiotik aminoglikosida yang diproduksi

secara alami pada fermentasi bakteri *treptom"ces 'anam"ceticus. !iasanya, kanamisin

digunakan untuk penyakit yang disebabkan oleh bakteri ?ram negatif dan bakteri ?ram

positif. $elain itu, kanamisin "uga dapat digunakan untuk pengobatan T!% karena

aktivitasnya terhadap M"cobacterium tuberculosis. )anamisin beker"a dengan menghambatsintesis protein pada sel bakteri. )anamisin akan mengikat secara irreversiblepada subunit

ribosom 30$ dan 50$, sehingga sintesis protein terganggu. )anamisin mengandung kanamisin

sebagai komponen aktif utamanya dan se"umlah kecil komponen yang mirip strukturnya,

seperti kanamisin ! dan %. )anamisin memiliki empat gugus amino primer dan tu"uh gugus

A> sekunder ()och et al. 2011.

!akteri donor tidak dapat melakukan kon"ugasi dengan sesama bakteri donor karena

terdapat eksklusi permukaan sehingga transfer antara keduanya tidak dapat dilakukan. Proses

kon"ugasi keduanya dapat menyebabkan hilangnya salah satu donor sel dan peristi*a #igosis

yang mematikan. Mating antara kedua bakteri donor dapat menyebabkan kematian karena

rusaknya membran dan peptidoglikan, serta induksi respon $A$ yang menyebabkan besarnya

arus &' utas tunggal. +ekanisme ekslusi permukaan melibatkan lipoprotein TraT dan Tra$

yang membentuk struktur pentamerik dan menghalangi poripori sehingga kon"ugasi tidak

dapat ter"adi atau bisa ter"adi namun dengan efisiensi yang sangat kecil (Brost 200.

$alah satu aplikasi kon"ugasi adalah transfer molekul &' eksogen ke dalam

mitokondria mamalia. +etode ini dilakukan dengan menyisipkan sekuens oriT ke konstruksi

&', memasukkan konstruksi &' ke dalam E.coli, dan mengintroduksi &' yang dapat

berpindahpindah melalui kon"ugasi. +etode ini dapat dilakukan untuk mengkonstruksi &'

secara in vitro dan untuk mempela"ari ekspresi dari &' mitokondria pada mamalia. Transfer

&' utas tunggal secara kon"ugasi merupakan substrat yang baik untuk rekombinasi ke

dalam genom mitokondria endogen, untuk mengkarakterisasi sistem rekombinasi mitokondria

dan kemungkinan "uga dapat memodifikasi genom tersebut sehingga merupakan aplikasi yang

baik untuk penelitian dasar maupun aplikatif (


11/15

regularl" interspaced short palindromic repeats yang ditransfer melalui kon"ugasi. $el akan

direkayasa berbeda dari sel target untuk melakukan 'noc'do+n gen, sehingga manipulasi

target populasi sel dapat dilakukan tanpa kontak langsung. Pada percobaan ini, sistem

%7C$P7 ditransfer melalui kon"ugasi pada sel target E.coli untuk menekan ekspresi gen

m7BP. 7egulasi gen oleh %7C$P7, represi atau aktivasi, diharapkan dapat membunuh sel

dengan cara pemotongan &' dengan situs %as yang aktif, bahkan transmisi sirkuit

%7C$P7 yang membuat respon seluler. Transfer sistem %7C$P7 melalui kon"ugasi ini

memiliki peran besar dalam mengatur populasi bakteri di berbagai tempat (-i et al. 201.

SIMPULAN

)ontrol positif pada donor tumbuh karena E.coli $11 pir memba*a transposon

miniTn5 )mryang resisten kanamisin sehingga dapat tumbuh di media. )ontrol negatif tidak

tumbuh karena donor tidak ada resisten terhadap rifampin. $ebaliknya, kontrol positif resipien

dapat tumbuh karena C.violaceum dan R.sphaeroides 2..1 memiliki resistensi terhadap

rifampin, namun tidak ada resistensi terhadap kanamisin. Tumbuhnya transkon"ugan pada

media yang berisi kedua antibiotik menun"ukkan kon"ugasi berhasil.

Plasmid p/TminiTn5 )mr dariEscherichia coli $11 pirberhasil dipindahkan ke

Rhodobacter sphaeroides 2..1 dan Chromobacterium violaceum. &engan demikian,

transkon"ugan yang resisten kanamisin dan rifampisin "uga berhasil didapat, khususnya pada

transkon"ugan C.violaceum. $ifat resisten kanamisin pada transkon"ugan didapat dari plasmid

yang memba*a transposon, transposon tersebut mengkodekan gen yang resisten kanamisin.

$ifat resisten rifampisin berasal dari sel resipien sendiri yang memiliki sifat tersebut.

Transkon"ugan R.sphaeroides 2..1 cenderung sulit dikon"ugasi karena memiliki

sistem 7'i dan lima buah plasmid. )on"ugasi cenderung berlangsung secara acak sehingga

terdapat plasmid pada R.sphaeroides 2..1 ada yang tidak mengekspresikan sifat donor.

Plasmid bunuh diri p/T dapat tinggal pada donor karena keberadaan protein yang

dikodekan oleh genpirpada bakteri donor yang merupakan syarat bagi plasmid untuk dapat

bereplikasi.

$emakin banyak "umlah sel yang melakukan kon"ugasi, semakin besar kemungkinan

kon"ugasi dapat ter"adi karena semakin banyak sel yang melakukan kontak, terlihat dari hasil

pengamatan dimana resipien dengan volume 50 lebih berhasil melakukan kon"ugasi

dibandingkan dengan resipien yang volumenya 25 .


12/15

DAFTAR PUSTAKA

%edric lm 22226.

)im 9-, )im -$, ee C>, 7hee >-, ee -). 2004. $uperoGide generation by chlorophyllide a

reductase ofRhodobacter sphaeroides.4 Biol Chem 2438314330.

)limke E et al. 2005. The mating pair stabili#ation protein, Tra', of the B plasmid is an

outermembrane protein *ith t*o regions that are important for its function in

con"ugation.Microbiolog" 151(118352350.


13/15

)och , !asar $, 7ichter 7. 2011. >P% of carbohydrates. &i dalam8 Eaksmund#ka>a"nos

+, $herma -, editor. igh Performance 7i&uid Chromatograph" in Ph"tochemical

6nal"sis. !oca 7aton8 %7%. >lm 32.

)ontur E$ et al. 2012. 7evised seHuence and annotation of the Rhodobacter sphaeroides

2..1 genome.4 Bacteriol 1(2801601.

)umar +7. 2012. Chromobacterium violaceum8 rare bacterium isolated from a *ound over

the scalp.$nt 4 6ppl Basic Med Res 2(1802.

in et al. 2011. Cnhibition of bacterial con"ugation by phage +13 and its protein g3p8

Huantitative analysis and model.P7o* 8E 6(58111.

odge -, und P, +inchin $. 200. ene Cloning Principles and 6pplications. 'e* lm 1504.

7oy P>. 200. ?enetic mechanisms of transfer of drug resistance. &i dalam8 +ayers &,

editor.6ntimicrobial 5rug Resistance Mechanisms of 5rug Resistance. :olume ke1.

'e* umana. >lm 523.

$chuck $, Eeinhold , uu :T, !ald*in CT. 201. Csolating fungal pathogens from a

dynamic disease outbreak in a native plant population to establish plantpathogenbioassays for the ecological model planticotiana attenuata.P7o* 8E (811.


14/15

$malla ), -echalke $, Top 9+. 2015. Plasmid detection, characteri#ation, and ecology.

Microbiol *pec 3(3811.

$tarr %, 9vers %, $tarr . 2011.Biolog" Concepts and 6pplications +ithout Ph"siolog". 9d

ke4. !elmont8 !rooks;%ole.

$trand T, ale 7, &egnes )B, ando +, :alla $. 201. ne* and improved hostindependent plasmid system for 7)2based con"ugal transfer.P7o* 8E (3816.

:an der Aost -, $*ast &%, -ore ++. 201. Prokaryotic argonautesvariation on the 7'

interference theme.Microb Cell 1(5815415.

Eaag &+, &e$ha#er &. 2005. ?landers8 ne* insights into an old disease. &i dalam8

indler 9, ebeda B-, )orch ?E, editor. Biological 9eapons 5efense $nfectious

5isease and Counterbioterrorism. Toto*a8 >umana. >lm 20234.

Eilson -E. 2006. ?enetic eGchange in bacteria and the modular structure of mobile &'

elements. &i dalam8 'ickerson %, $churr +-, editor. Molecular Paradigms of$nfectious 5isease 6 Bacterial Perspective. 'e* lm 35.


15/15

LAMPIRAN

(

laporan transkonjugasi

Documents