知っておきたい！尿蛋白定量検査douou/syouroku/101014nyoutanpakuteiryou.pdf2010/10/30...

Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

２０１０.１０.１４和光純薬工業（株）

谷本和仁

知っておきたい！

尿蛋白定量検査

道央地区一般検査研修会資料

2010/10/302 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

腎臓の働き

・尿として老廃物を出す

・電解質のイオンのバランスを保つ

・血圧の調整を行う

・造血ホルモン（エリスロポエチン）を分泌する

・活性型ビタミンＤ3を作る

⇒骨の生成に必要


尿として老廃物を出す腎臓の働き


腎臓の構造と働き

糸球体：濾過尿細管：再吸収と分泌


尿の一般正常検査（１）

放置によりアンモニア臭

膀胱炎：腐臭

ケトン体↑：果実様臭気

一種の芳香性尿臭気

尿酸塩、炭酸塩、リン酸塩、Ca塩、

細菌尿排尿直後は透明尿混濁

黄褐色：ﾋﾞﾘﾙﾋﾞﾝ尿、ｳﾛﾋﾞﾘﾝ尿

赤色：血尿麦わら黄色～淡黄褐色尿色調

2000mL ：多尿

500mL ：乏尿

100mL ：無尿

1000～1500mL尿量

備考健常人項目


尿の一般正常検査（２）

電解質(Na+､Cl-)と尿素のﾓﾙ数に支配

50～1300mOsm/kg

通常は

500～800mOsm/kg尿浸透圧

尿中固形分の含量を示す

1.035を超えることはない⇒ 腎の濃縮力の限界

1.005～1.030尿比重

動物性食品 ⇒ 酸性

植物性食品 ⇒ アルカリ性

細菌尿 ⇒ アルカリ性

一般に酸度の高い尿は色が濃く、低い尿は色が淡い

弱酸性 pH６程度

（摂取した食物でpH4.5～7.5）

ｐＨ

備考健常人項目


尿成分の代表的検査（１）

0.4～1.2g/日酵素法尿酸

6.5～13.0g/日(尿素量14～28g/日)酵素法尿素窒素

0.5～1.5g/日酵素法、Jaffé法クレアチニン

2～20mg/dL, 40～85mg/日酵素法グルコース

11～253μg/L免疫法(Latex他)β２-ﾐｸﾛｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ

蓄尿 23.8mg/L以下(18.6mg/g Cr以下)

早朝尿16.5mg/L以下(10.8mg/g Cr以下)

随時尿29.3mg/L以下(24.6mg/g Cr以下)

免疫法微量ｱﾙﾌﾞﾐﾝ

20～120mg／日比濁法､

色素比色法蛋白

健常人の排泄量原理（例）項目


尿成分の代表的検査（２）

70～250mEq/日イオン電極(ISE)Na

25～100mEq/日〃K

70～250mEq/日〃Cl

20～120mg/日酵素法､

色素結合法Ca

0.1～0.2g/日酵素法、

ｷｼﾘｼﾞﾙﾌﾞﾙｰ法Mg

0.5～1g/日酵素法、

ﾓﾘﾌﾞﾃﾞﾝ酸UV法無機リン



尿成分の代表的検査（３）

S-Amy：P-Amy≒4：6

ACCR（ｱﾐﾗｰｾﾞ尿中ｸﾘｱﾗﾝｽとｸﾚｱﾁﾆﾝｸﾘｱﾗﾝｽ比）:2.3±0.5（1.4～4.0%）

各種基質法アミラーゼ

随時尿 1～4.2U/日

男性 1.9～8.7U/日

女性 1.3～4.5U/日

各種基質法

NAG

(N-ｱｾﾁﾙ-β-D-ｸﾞﾙｺｻﾐﾆﾀﾞｰｾﾞ

100μg/L以下ラテックス凝集法、

金コロイド比色法シスタチンC


その他

尿沈査、妊娠検査、尿路結石検査、乱用薬物検査


クレアチニン補正とは

尿中成分濃度は尿の濃縮や希釈により異なる

運度など汗をたくさんかいた → 濃縮水やビールをいっぱい飲んだ → 希釈

なんらかの補正が必要

クレアチニンは筋肉中に存在するクレアチンの代謝物で尿中に排泄されるクレアチニンの絶対量は水分や食事に関係なくほぼ一定である

尿中成分濃度の補正にクレアチニンが使われる


クレアチニン補正の効果健常人随時尿中アミラーゼ活性の日差変動

一見日差変動の激しいアミラーゼ活性もクレアチニン補正をすると、安定していることがわかる。

0

100

200

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9

測定日

クレ

アチ

ニン

濃度

0

200

400

600

アミ

ラー

ゼ活

性

クレアチニン濃度 (mg/dL) アミラーゼ随時尿中 (U/L)

アミラーゼ Cre補正 (U/g･Cr)

補正式：アミラーゼ(U/L)÷クレアチニン(g/L) → U/g･ｸﾚｱﾁﾆﾝ


尿タンパク測定の臨床的意義血液中のタンパクは、腎臓の糸球体でろ過される。(原尿。)糸球体はふるい状になっており、分子量の小さいタンパクは、原尿に排出されるが、尿細管で再吸収されるため、通常尿中ではほとんど検出されない。糸球体や尿路系に障害があるとタンパクが尿中に漏出する。 →腎機能の指標


蛋白尿の分類

蛋生・機能性蛋白尿：激しい運動後、入浴後、興奮後、妊娠時

白理・体位性蛋白尿：起立性、体を弓なりに反らせたとき

尿的

・腎前性蛋白尿：

病全身性疾患：発熱、静脈うっ血、心不全など

的特殊蛋白尿：ミオグロビン尿、ヘモグロビン尿、

蛋ベンスジョーンズ蛋白尿など

白・腎性蛋白尿：

尿糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎腫瘍など

・腎後性蛋白尿：

尿管、膀胱、尿道、結石、炎症、腫瘍など

→いずれも良性


体位性蛋白尿

安静時には蛋白尿は陰性だが、起立や体を弓なりに反らせたときに腎臓を圧迫して出る蛋白尿身長が急速に伸びる時期に多く見られる

尿蛋白の判定は早朝尿で行うべき

学童検診の一次検尿では2.5%の陽性率→二次検尿で0.2%、腎臓病と診断されるのは0.01%*1)

*1)平成13年神奈川県学校・腎疾患管理研究会医師部会第30回研究会講演（竹中道子）資料より


尿中蛋白測定方法測定

対象

Kingsbury-Clark法 3%スルホサリチル酸溶液尿尿 1ml+試薬 3ml 蛋白種による濁度差大

比濁法 (K-C法) 髄液 →室温10分放置 (ｱﾙﾌﾞﾐﾝはｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝの2～4

→吸光度測定(660nm) 倍の濁度を示す),薬剤,

温度の影響大

Meulemans法 3%ｽﾙﾎｻﾘﾁﾙ酸-7%硫酸Na溶液試料lml+試薬4ml 蛋白種による濁度差

ベンゾニウム ①NaOH･EDTA･4Na溶液, →室温10分放置あり,温度の影響あり,ｳｼ

クロライド法 ②0.2%ﾍﾞﾝｿﾞﾆｳﾑｸﾛﾗｲﾄﾞ溶液 →吸光度測定ｱﾙﾌﾞﾐﾝは標準物質として

(尿：600nm, 髄液 450nm) 使用不可

ﾋﾟﾛｶﾞﾛｰﾙﾚｯﾄﾞ･市販キット尿試料50μl(または20μl) 蛋白種による呈色差小,

ﾓﾘﾌﾞﾃﾞﾝ錯体発色法 (Micro TP-Test Wako, 髄液＋発色試液 3ml 検量線200mg/dl(試料50

色素に和光純薬) →室温20分放置 μl)まで直線,ｾﾙや器具類

よる →吸光度測定(600nm) への汚染がほとんどない

比色法ﾌﾞﾛﾓﾋﾟﾛｶﾞﾛｰﾙﾚｯﾄﾞ市販キット (専用機ｵｰｼｮﾝﾏｽﾀ ,ー蛋白種による呈色差小,

(色素ｲﾝｼﾞｳﾑ錯体発色法 (ﾏｽﾀｰﾃｽﾄPRO,ｱｰｸﾚｲ) ｱｰｸﾚｲ)167検体/時ｾﾙや器具類への汚染が

結合法) ほとんどない

Coomassie Brilliant CBB G250:100mg, 95%ｴﾀﾉｰﾙ: 試料 0.lml十試薬 5ml 操作法簡単,高感度,蛋白

Blue G250法 50ml, 85%ﾘﾝ酸:100mlを →室温10分放置種による呈色差小,色素に

(CBB G250法または精製水で1Lにする市販ｷｯﾄ →吸光度測定(595nm) よる器具類の汚染あり

CBB法) (ﾄﾈｲﾝTP-Ⅱ,大塚ｱｯｾｲ)

測定法試薬測定操作概略特徴


蛋白尿の分類と疾患

１．腎前性蛋白尿 (血清アルブミンより小さな蛋白成分）

①肝臓由来低分子蛋白（α1、α2糖蛋白）・・・慢性感染症、悪性腫瘍

②M蛋白（BJP、H鎖フラグメント）・・・骨髄種

③組織破壊（ヘモグロビン、ミオグロビン）・・・生体内溶血、筋組織破壊

２．糸球体性蛋白尿（血清蛋白）→糸球体基底膜に損傷

①炎症性病変

②病的物質の沈着・・・アミロイド腎、糖尿病性糸球体、ＩｇA腎症

③糸球体内の血流うっ帯・・・腎静脈血栓症、うっ血性心不全

④体位性蛋白尿

３．尿細管性蛋白尿（組織蛋白、β2MG、α1MG、ﾘｿﾞﾁｰﾑ、ﾚﾁﾉｰﾙ結合ｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ）

・・・カドミウム中毒、低カリウム血症による腎障害、骨髄腫腎、先天性異常（Fanconi症候群、Lowe症候群、Wilson病、アミノ酸尿症）

生理的蛋白尿

４．破綻性蛋白尿

尿路系を囲む脈管系（血管、リンパ管）の破綻


平成21年度日臨技サーベイより

尿タンパク測定の現状

測定法施設数割合

ピロガロールレッド法 1675 86%

ピロカテコールバイオレット法 109 5.6%

ブロモピロガロールレッド法 27 1.4%

ベンゾニウムクロライド法 50 2.6%

CBB－Ｇ２５０法 57 2.9%

その他 32 1.6%

合計 1950

CBB－Ｇ２５０法

2.9% その他1.6%

ベンゾニウムクロライド

法2.6%ブロモピロ

ガロールレッド法

1.4%

ピロカテコールバイオレット法

5.6%

ピロガロールレッド法

86%


ＰＲ法測定原理

O

OHOH

OOH

SO3H

ピロガロールレッド（ＰＲ）

－Ｍｏ(Ⅳ) ＰＲ－Ｍｏ－蛋白結合体

ピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法

ピロガロールレッド(PR)はモリブデン酸と結合し、赤色錯体を形成する。この錯体は、酸性条件下でタンパクと結合すると、極大吸収波長が長波長

側にシフトし青紫色を呈する。この青紫色の吸光度を測定することにより試料中のタンパク濃度を求める。

(660nm)

＋蛋白


①アルブミンとγ-グロブリンの反応性が異なる→検体のA/G比が変わると測定値が変わる

②低値直線性のもぐり→正常域の測定値が低値になる

現行PR試薬の問題点


①アルブミンとグロブリンの反応性を同一化（１：１）→検体のA/G比に依らず、測定値が一定

②低値直線性の改善→正常域の精度向上

改良点


*蛋白標準液(100mg/dL)はヒトアルブミン100%

現製品(AR)

2000

2500

3000

3500

4000

4500

OD

×10000

blank 蛋白標準液

アルブミン γ-グロブリン　

改良品

2000

2500

3000

3500

4000

4500

OD

×10000

blank 蛋白標準液

アルブミン γ-グロブリン　

現行品改良品

アルブミン　(100mg/dL) 100.1 99.8

グロブリン　(100mg/dL) 77.3 98.7

アルブミンとグロブリンの反応性

現行品


直線性①

(mg/dL) vs理論値

現製品改良品現製品改良品

1 7.6 9.8 85% 98%2 16.0 19.5 89% 98%3 24.5 29.0 91% 97%4 33.3 38.8 93% 97%5 42.2 49.3 94% 99%6 51.7 59.0 96% 98%7 61.0 69.0 97% 99%8 70.1 79.7 97% 100%9 79.0 89.2 98% 99%10 89.9 99.9 100% 100%

低値直線性の改善（コントロール血清I（Glb含有）50倍希釈））

低値直線性が改善され、正常値付近の精度が向上

0

20

40

60

80

100

120

希釈系列

mg/dL

現製品

改良品

現行品現行品


直線性②

高値直線性（コントロール血清I（Glb含有）9倍希釈）

(mg/dL) vs 理論値

現行品改良品現行品改良品

1 58.9 66.6 94% 96%

2 125.0 139.4 100% 100%

3 189.8 213.6 101% 102%

4 258.9 284.8 104% 102%

5 323.5 351.4 104% 101%

6 389.6 418.2 104% 100%

7 458.3 483.6 105% 99%

8 506.3 544.8 101% 98%

9 557.7 601.8 99% 96%

10 611.8 666.0 98% 96%

0

100

200

300

400

500

600

700

800

希釈系列

mg/

dL

現行品

改良品


コントロール測定値

血清コントロールはグロブリンを約41％含有している。現行品のグロブリン反応率は約75％であるため、改良品は41％×25％=10％程度高値となる。

現行品改良品

尿コントロールI mean 14.9 17.2

対現行品 100.0% 115.4%

尿コントロールII mean 52.5 55.8

対現行品 100.0% 106.3%

血清コントロールI mean 88.9 99.0

(50倍希釈) 対現行品 100% 111%

血清コントロールII mean 138.2 151.2

(50倍希釈) 対現行品 100% 109%


現行品との相関（尿検体）

実検体尿(n=50)

y = 1 .0633x + 1 .0072

R2 = 0 .9993

0

100

200

300

400

500

600

700

0 100 200 300 400 500 600 700

現製品(AR)

改良

品

y = 1 .0285x + 1 .826

R2 = 0 .9976

0

50

100

150

200

0 50 100 150 200

現製品(AR)改

良品拡大


現行品との相関（髄液）

実検体髄液(n=30)

y = 1 .1192x + 2 .9831

R2 = 0 .9998

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300

現製品(AR)

改良

品

y = 1 .0947x + 3 .3932

R2 = 0 .9983

0

20

40

60

80

0 20 40 60 80

現製品(AR)改

良品

拡大


現製品との相関（２）

尿検体(n150) 髄液検体(n84)

y = 1 .0181x + 3 .7332

R2 = 0 .9979

0

100

200

300

400

500

0 100 200 300 400 500

現製品　H7180

改良

品　

H7

18

0

y = 1 .0751x + 5 .3638

R2 = 0 .9992

0

100

200

300

400

500

0 100 200 300 400 500

現製品　H7180改

良品

　H

71

80


各種蛋白との反応性

[mg/dL]

現製品(AR) 改良品

アルブミン mean 100.1 99 .8

対改良品

α1-アンチトリプシン mean 87.5 90 .3

(α-グロブリン分画) 対改良品 97%

トランスフェリン mean 110.1 149.8

(β-グロブリン分画) 対改良品 73%

γ-グロブリン mean 77.3 98 .7

対改良品 78%


発色色素；アシッドバイオレット（ポンソーよりも高感度）いずれの検体も5～10倍濃縮液を使用

尿蛋白分画図

アルブミン 80.1%α1-グロブリン 0.9%α2-グロブリン 3.6%β-グロブリン 4.9%γ-グロブリン 10.5%




サーベイ試料（H21年埼玉サーベイ結果）

測定データの互換性

現行試薬（報告値）　　*標準も現行使用

測定法日立7170 QUICK RUN 用手法

試薬 μTP AR μTP AR μTP テスト

液量　S/R（μL）　2/250 　5/300 用手50/3000

サーベイ試料№51A 62.7 60.8 62.6

vs 7170 97% 100%

サーベイ試料№52A 155.2 142.5 145.9

vs 7170 92% 94%

改良試薬　　*標準も改良品使用

測定法日立7170 QUICK RUN 用手法

試薬 μTP AR μTP AR μTP テスト

液量　S/R（μL）　2/250 　5/300 用手50/3000

サーベイ試料№51A 65.8 66.3 66.2

vs 7170 101% 101%

サーベイ試料№52A 156.1 156.4 157.6

vs 7170 100% 101%


多発性骨髄腫患者尿の反応性


その他の低分子血漿蛋白

α1-ミクログロブリン

レチノール結合蛋白（ＲＢＰ）

リゾチーム（ムラミターゼ）

尿中酸可溶性蛋白 (acid soluble protein:ASP)血清中のα1-酸性糖蛋白､トランスフェリン､Tamm-Horsfallムコ蛋白

Bence Jones蛋白

FDP（フィブリノゲン／フィブリン分解産物）

尿中特殊蛋白


開封安定性開封後期間初日 1週間 2週間 3週間 4週間 5週間

Blank n=1 2233 2257 2199 2204 2207 2204生食水 n=2 2244 2263 2202 2208 2209 2208

n=3 2252 2261 2200 2210 2203 2209Ave. 2243 2260 2200 2207 2206 2207

標準感度 n=1 813 810 821 797 803 811蛋白標準液 n=2 821 807 806 805 815 797

n=3 814 813 800 797 805 799AM382 Ave. 816 810 809 800 808 802

対初日 100% 99% 99% 98% 99% 98%

尿コントロールI n=1 17.5 16.9 16.9 17.3 18.1 17.6n=2 17.5 17.8 17.8 17.3 16.1 17.2

62241 n=3 17.1 17.7 16.9 17.8 17.7 18.1Ave. 17.4 17.5 17.2 17.5 17.3 17.6

対初日 100% 101% 99% 101% 99% 101%尿コントロールII n=1 56.2 57.2 56.1 57.2 56.2 57.7

n=2 55.3 56.9 56.2 57.9 57.0 55.862242 n=3 55.6 57.3 54.8 57.0 56.0 55.8

Ave. 55.7 57.1 55.7 57.4 56.4 56.4対初日 100% 103% 100% 103% 101% 101%

自動分析装置（日立７１７０ｓ）にセッティングした状態で開封試験実施。

開封5週間後でも試薬性能は維持されており、安定性は良好であった。


開封安定性

2260 2200 2207 2206

3070 3009 3007 3014

22072243

30093059

17.5 17.2 17.5 17.3

57.1 55.7 57.4 56.4

17.617.4

56.455.7

2000

2500

3000

3500

4000

0 1 2 3 4 5

週目

吸光

度(O

Dx1

0000

)

0

20

40

60

80

測定

値(m

g/dL

)

Blank(ODx10000)

標準液(ODx10000)

ﾗｲﾌｫﾁｪｯｸ尿ｺﾝﾄﾛーﾙ(1)(mg/dL)ﾗｲﾌｫﾁｪｯｸ尿ｺﾝﾄﾛーﾙ(2)(mg/dL)


御静聴ありがとう

ございました☆

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