genetic engineering & gene therapy

7/23/2019 Genetic Engineering & Gene Therapy

http://slidepdf.com/reader/full/genetic-engineering-gene-therapy 1/28

1

REKAYASA GENETIKABioteknologi: gabungan teknologi modern &

biologi terapan; bertuuan untuk meningkatkanmutu kebutu!an !idup manu"ia #Karl Erek$%

e'ini"i Bioteknologi:1( Kegiatan peman'aatan prin"ip ilmia! dalam

reka$a"a

)( Kegiatan peman'aatan akti'ita" biologi dalamlingkup teknologi pro"e" dan teknologi produk"i

dalam indu"triBioteknologi meliputi: B( Kedokteran* B( +arma"i*

B( ,ertanian* B( ,eternakan ll(



)

REKAYASA GENETIKA

- Bioteknologi kedokteran: upa$a pengobatan danpen$embu!an pen$akit(

- Reka$a"a genetika #geneti. engineering% merupakanprimadona dalam bioteknologi(

- Reka$a"a genetika/teknik NA rekombinan: pembentukan

rekombinan material genetik baru* $ang "elanutn$a dapatditurunkan ke genera"i berikutn$a(

- engan diketemukann$a en0im re"trik"i* !al inimemungkinkan dilakukann$a pemutu"an 'ragmen NA"pe"i'ik( ntuk menggandakan 'ragmen ter"ebut dalam

umla! be"ar* maka 'ragmen perlu di"i"ipkan ke dalam "uatu2ektor #kendaraan $ang berupa "egmen NA* $ang mampubereplika"i "e.ara autonom%(



3

REKAYASA GENETIKA

- 4ara: engan men$i"ipkan "uatu gen atau 'ragmen NA#$ang di!a"ilkan "el lain% ke dalam "uatu 2ektor* terbentukla!rekombinan NA( Rekombinan ter"ebut kemudiandima"ukkan ke dalam !o"t/"el inang* "e!ingga memungkinkanteradin$a penggandaan gen di dalam !o"t(

- ,ro"e" ter"ebut uga dikenal dengan "ebutan gene cloning *karena organi"me $ang "e.ara genetik terbentuk adala!identik* dan memba5a "eluru! gen atau 'ragmen NA $angdi"i"ipkan* dan uga memperban$ak gen "i"ipan ter"ebut(

- A"pek penting dari pro"e" ini: kemampuan menerobo" barier

alamia! "uatu "pe"ie" dan kemungkinan dapat memperole!dan memanipula"i gen* $ang "elanutn$a gen ter"ebut dapatmen$andi "uatu 'ung"i "pe"i'ik(



6

GENE CLONING

- ua da"ar penerapan gene cloning:1( apat melakukan i"ola"i dan mempelaari gen tertentu*

"e!ingga dapat diperole! pengertian mendalam tentang"truktur* 'ung"i dan regula"i gen(

)( iperole! peningkatan produk"i gen "pe"i'ik dalam "kala

indu"tri #umla! be"ar%* $ang !a"iln$a dapat diman'aatkanuntuk ke"ea!teraan manu"ia( 7i"( 1( ,roduk"i !ormonin"ulin dengan pertolongan bakteri dalam umla! be"ar"e.ara .epat* untuk terapi pa"ien dengan pen$akit diabete"melitu" karena "el8 9 pankrea"n$a tidak atau kurangber'ung"i* )( ,roduk"i protein pembeku dara! 'aktor dan *

untuk mengobati pa"ien $ang mengalami pen$akit !emo'ilia*karena de'ek gen untuk mengek"pre"ikan protein 'aktor *&( dll



<

=EKT>R* EN?I7 RESTRIKSI* &

EN?I7 @IGASE

- Teknik NA rekombinan berkaitan erat denganpenemuan berbagai 2ektor* en0im re"trik"i* danen0im liga"e(

- =ektor: kendaraan $ang dapat dititipi/di"i"ipi

gen/'ragmen NA( =ektor $ang paling umumdigunakan adala!: 1( pla"mid bakteri #molekul NA"irkuler $ang mengandung gen re"i"ten antibiotik%* )(2iru"

- En0im re"trik"i: en0im $ang dapat digunakan untuk

memotong nukleotida pada "itu" tertentu- En0im liga"e: en0im $ang dapat men$ambungpotongan8potongan atau 'ragmen8'ragmen NA



TAA,8TAA, TEKNIK NA

REK>7BINAN

1( I"ola"i NA atau RNA

)( ,emotongan NA menadi gen tunggal ataumenadi kelompokan gen

3( I"ola"i 2ektor NA6( ,en$i"ipan dan pen$ambungan gen pada

2ektor

<( Anali"i" pemotongan & pen$ambungan gen

pada 2ektor ( Tran"'orma"i pada !o"t & ui tran"'orma"i



C

IS>@ASI NA

- 1( ,eng!an.uran membran pla"ma "el:

- a( Se.ara mekanik

- b( Se.ara en0imatik

- )( @i"i" "el: di"u"pen"ikan di dalam bu'er atau dalamdetergen SS* atau triton D81

- 3( 7ember"i!kan debri": dengan "entri'uga"i* untuk

memi"a!kan protein dari li"at

- 6( ,re"ipita"i NA dengan alko!ol



,E7>T>NGAN NA

- ,emotongan NA dengan en0im re"trik"i- Si'at en0im re"trik"i:

1( 7engenal "e.ara "pe"i'ik 68 pa"ang urutan nukleotida NApalindrom #diba.a dari kiri/kanan* dari uung $ang "ama*bun$in$a "ama%* mi"(<F88 GAATT4883F

3F88 4TTAAG88<F)( 7emotong NA pada kedua untai pada tempat "pe"i'ik

#re.onition "ite%( 4onto! E( re"trik"i: EcoR1* memotongGAATT4 8H G AATT4* dan meng!a"ilkan 'ragmen denganuung menggantung #"ti.k$ end% $ang berguna untukmeningkatkan perlekatan "ambungan antara ) 'ragmen NA#Gambar%( Tidak "emua en0im re"trik"i meng!a"ilkan stickyend, mis.PvuII meng!a"ilkan blunt end #uung tumpul%memotong 4AG4TG 8H 4AG 4TG



1



11



1)

,ENYISI,AN & ,ENYA7BNGAN GEN

,AA =EKT>R

- I"ola"i 2ektor(

- =ektor $ang "uda! dii"ola"i kemudiandipotong dengan E( re"trik"i* mi"( EcoRI(

- Gen di"i"ipkan di antara tempat pemotongan2ektor(

- ,en$ambungan gen $ang di"i"ipkan pada2ektor dengan menggunakan en0im liga"e*

pada "u!u 681< E4* "elama 1 malam#Gambar%(



13

ANA@ISIS ,E7>T>NGAN &

,ENYA7BNGAN GEN ,AA =EKT>R

- Anali"i" pemotongan & pen$ambungan gen pada 2ektordengan teknik elektro'ore"i" gel agaro"a atau poliakrilamid(

- Elektro'ore"i" gel agaro"a "e.ara umum digunakan untukmemi"a!kan 'ragmen NA dengan 2aria"i panang dariratu"an !ingga )( pa"ang nukleotida* Sedang poli8

akrilamid untuk memi"a!kan 'ragmen NA $ang lebi! ke.il(- 7olekul NA bermuatan 8 maka dalam medan li"trik akanbergerak ke elektroda (

- Bila molekul NA dengan berbagai ukuran dima"ukkan kedalam "umur8"umur gel agaro"a dan aliran li"trik dialankan*maka mol( NA bergerak melalui matrik" gel ke ara! (

Ke.epatan bergerak tergantung ukuran mol( NA* $ang lebi!ke.il bergerak lebi! .epat & lebi! au!(



16

ANA@ISIS ,E7>T>NGAN &

,ENYA7BNGAN GEN ,AA =EKT>R

- Gel $ang beri"i NA $ang "uda! dielektro'ore"i"dalam 5aktu tertentu "egera diangkat dari medanli"trik* kemudian di5arnai dengan etidium bromida(

- Gel8NA kemudian diamati dengan "inar =* maka

pita NA akan ber'luore"en"i(- kuran potongan NA dibandingkan dengan ukurankontrol(

- Gel agaro"a uga dapat digunakan untuk i"ola"i'ragmen NA( 4aran$a dengan memotong gel $ang

mengandung 'ragmen NA tadi* kemudian agardi!an.urkan* dan NA dipre"ipita"ikan(



1<

TRANS+>R7ASI & JI

TRANS+>R7ASI

- Tran"'orma"i: adala! teknik untuk mema"ukkan NArekombinan $ang "uda! dipro"e" "e.ara in vitro ke dalam"uatu "el organi"me #!o"t%(

- 4onto!: =ektor $ang "uda! di"i"ipi "uatu gen* "etela!dianali"i" dan ber!a"il* dima"ukkan ke dalam "el E. coli (

- 4ara:1( =ektor ber"i"ipan dan E. coli di.ampur dalam larutan 4a4l)

pada "u!u E4 8< E4(

)( ilakukan heat shock #3C E4 86< E4%* untuk meningkatkan'rekuen"i tran"'orma"i(

3( ari pengalaman !a"il ui tran"'orma"i dengan .aramengkultur* dan ui !a"il ek"pre"i gen $ang di"i"ipkan* !an$a1 popula"i E. coli $ang mampu mengambil NA(



1

IENTI+IKASI GEN/+RAG7EN NA

- 7etoda lainn$a untuk identi'ika"i gen/'ragmen NA dapatdilakukan dengan mi"( ibridi"a"i(

- etek"i "euen.e gen tertentu dapat dilakukan dengan teknik!ibridi"a"i molekular( ibridi"a"i dapat dilakukan denganmetoda Sout!ern blotting(

- Teknik ini berda"arkan pada ketentuan: !ibridi"a"i teradi bila""NA dapat membentuk pa"angan ba"a #anneal % dengan.omplementar$ "ingle "tranded NA8n$a(

- Sementara itu gagaln$a annealing berarti keduan$a tidakberkomplemen/tidak !omolog/tidak .o.ok(



1C

IENTI+IKASI GEN/+RAG7EN NA

- ntuk !ibridi"a"i 'ragmen NA genom "e"eorang #"eumla!klon gen% didige"ti dengan en0im re"trik"i( +ragmen $angdi!a"ilkan dipi"a!kan dengan elektro'ore"i" gel* kemudianditran"'er dan di'ik"ir pada 'ilm nitro"elulo"a( ibridi"a"idilakukan dengan NA pela.ak #probe/marker% $ang dilabel

dengan radioi"otop* dan ditangkap dengan 'ilm "inar8D*"e!ingga klon $ang mengandung "euen.e nukleotida!omolog dengan NA probe dapat didetek"i #Gambar !al( %

- +ragmen NA/gen $ang "uda! diklon dapat digunakan"ebagai penanda/marker/probe !ibridi"a"i

- 7uta"i $ang ditandai ole! adan$a peruba!an ukuran 'ragmendapat didetek"i bila dibandingkan dengan pola normal(



1

4omplementar$ NA #.NA%

- Seringkali identi'ika"i "uatu gen dimulaidengan identi'ika"i mRNA $ang

ditran"krip"ikan ole! gen $ang ber"angkutan(

ntuk itu "ingle "tranded RNA dikon2er"i lebi!da!ulu menadi double8"tranded NA dengan

menggunakan en0im re2er"e tran"kripta"e(

a"il kon2er"i ini di"ebut .omplementar$

NA #.NA%(



1

ARI 7ANA ASA@ ,R>BEL

- ari gen $ang "uda! diidenti'ika"i "ebelumn$a- engan menggunakan .NA( 7i"( .NA dari mRNA retikulo"it

#$ang bila ditran"la"ikan akan meng!a"ilkan !emoglobin%(- engan menggunakan pengeta!uan kode genetik*

oligonukleotida dapat di"inte"i" "e.ara kimia5i dari !a"il

"euen.ing a"am8a"am amino produk protein "uatu gen(engan men$atukan beberapa oligonukleotida* ak!irn$a dapatdide"ain .NA probe(

- engan adan$a kodon degenerati' pembuatan oligonukleotidaini dilakukan dengan membuat beberapa kemungkinan(

- Bila tidak ter"edia protein* pembuatan .NA probe dapat

di.apai dari antibodi ter!adap produk gen itu(



)

,>@Y7ERASE 4AIN REA4TI>N

#,4R%

- ,4R #polimera"e .!ain rea.tion%: "uatu teknik $angdipergunakan untuk menggandakan "ampel NA $ang

umla!n$a terlalu ke.il dalam ukuran nanogram* dari "uatu.ampuran komplek"* dengan menggunakan a"a en0im NApolimera"e(

-Teknik ini diil!ami ole! pro"e" penggandaan/replika"i alamiNA pada "etiap "el organi"me $ang bernukleu"* denganmenggunakan en0im NA polimera"e(

- En0im polimera"e adala! uni2er"al* dan di!a"ilkan "ertadigunakan ole! "el organi"me untuk mengadakan replika"iatau penggandaan NA "ebelum mengadakan pembela!an

"el(- Teknik ini memungkinkan anali"i" 'ragmen NA tertentu tanpa

!aru" melakukan kloning lebi! da!ulu(



)1


#,4R%

1( Sinte"i" ) primer oligonukleotida dengan panang )83<nukleotida*berda"arkan "euen.e $ang dikenal pada 'ragmenNA(

)(Kedua primer ditamba!kan pada NA genom #$ang berlaku"ebagai template%* kemudian NA didenatura"i untuk

memi"a!kan kedua untai NA* promer akan3(itamba!kan en0im a! polimera"e #di!a"ilkan ole! bakteri

hermus a!uaticus $ang !idup di "umber air pana" ", aktivitasse#erti NA polimera"e* dan ta!an ter!adap "u!u < E4(

6( Selain itu uga ditamba!kan: ba!an pembangun berupa

dNT,* bu'er dan auabide"(



))


#,4R%

<( Ta!ap8ta!ap ,4R: M enatura"i:pemi"a!an NA template(

M Annealing: !ibridi"a"i primer8NA template(

M Eten"ion: elonga"i/"inte"i" NA(

M Inkuba"i

( ilakukan penentuan 5aktu:

7i"( enatura"i NA pada "u!u 68< E4* 3FF; Annealingprimer pada kedua uung "egmen NA pada "u!u <8<< E4*3FF;

Elonga"i pada "u!u E4* FF*

ilakukan "eban$ak 386 "iklu" ( Inkuba"i pada 6 E4(



)3

=ERI+IKASI ASI@ ,4R

a"il berupa pangkat dari penamba!an umla!NA( Jumla! material menadi dobel pada "etiap

ak!ir "iklu"( >le! karena itu pada ak!ir dari "iklu"

ke 3 mi"aln$a* 'ragmen NA "uda! diampli'ika"i

"eban$ak )3E kali* atau "ekitar "euta kali(=eri'ika"i !a"il ,4R dapat dilakukan dengan

elektro'ore"i" gel* untuk 2i"uali"a"i pita8pita

'ragmen NA k!u"u"(



)6

A,@IKASI ,4R

- Tidak terbata" pada detek"i peruba!an nukleotida $angmenguba! "itu" re"trik"i "aa* #karena muta"i%(

- Kemampuan ,4R untuk meng!a"ilkan "ampel 'ragmen NAtunggal $ang murni* memungkin8kan !a"iln$a dapatdigunakan untuk !ibridi"a"i* $ang memungkinkan untukmendetek"i perbedaan nukleotida tunggal "ampel NA(

- 7enggandakan RNA- iagno"i"- 7empelaari "ampel NA dalam umla! "angat ke.il

#Kepentingan Ilmu Kedokteran +oren"ik/Ke!akiman%

- 7embandingkan genom $ang berbeda* guna mempelaarikekerabatan "uatu "pe"ie"- Identi'ika"i gen "uatu organi"me



)<

N>RTERN B@>TTING

- Teknik $ang digunakan untuk anali"i" mRNA"uatu gen( 4aran$a "ama dengan Sout!ern

blotting* !an$a "aa "ampel berupa mRNA*

di!ibridi"a"ikan dengan NA probe(



)

TERA,I GEN

- Terapi gen: teknik pen$embu!an "uatu pen$akit dengan .aramen$i"ipkan atau meng!ilangkan bagian gen pa"ien $angmenderita pen$akit tertentu

- Ada ) .ara pen$i"ipan material genetik ke dalam kromo"ommanu"ia:

1( Teknik e 2i2o: "el diambil dari aringan $ang "akit kemudiandikultur dan diinek"i dengan NA baru( NA baru ma"uk kedalam "el* mengorek"i gen $ang mengalami kelainan*kemudian dibiarkan membela!( Sel8"el atau aringan barukemudian dima"ukkan kembali ke bagian tubu! $ang "akit(

)( Teknik in 2i2o: tidak memerlukan pembeda!an( NA normal

dalam 2ektor retro2iru" atau adeno2iru" diinek"ikan ke aringan tubu!( Retro2iru" mengandung RNA* dan adeno2iru"mengandung NA



)C

TERA,I GEN

- Teknik e 2i2o* bia"an$a menggunakan kultur "el "um"umtulang belakang* "ebab akan meng!a"ilkan dara! $ang akanber"irkula"i ke "eluru! tubu!( ,embeda!an ini "angatmen$akitkan dan !aru" dilakukan dua kali* pertama "aatmengeluarkan dari tubu! untuk dikultur "elama beram8am*

dan kedua "aat mema"ukkan kembali kultur "el $ang "e!at(- Teknik in 2i2o: penggunaan 2ektor adeno2iru" lebi!

menguntungkan dari "egi 5aktu* bia$a dan kuantita"dibandingkan dengan retro2iru"( E'ek adeno2iru" dalam )!ari* "edangkan retro2iru" berminggu8minggu( an$a

dibutu!kan beberapa m@ larutan adeno2iru" untukmen$embu!kan pa"ien* "edangkan dengan retro2iru"dibutu!kan beberapa liter larutan(



)

A+TAR RE+ERENSI

1( Bro5n* TA( Gene 4loning: an introdu.tion( 3t! ed( 4!apman &all ,ub( Ne5York* 1<(

)( Gele!rter* T and 4ollin"* +S( ,rin.iple" o' 7edi.al

Geneti."( Oilliam" & Oilkin" ,ub( @ondon( 1

3( Gli.k* BR and ,a"ternak* JJ( 7ole.ular

Biote.!nolog$: ,rin.iple" and Appli.ation" o'

Re.ombinant NA( AS7 ,re""( Oa"!ington* 4( 16(

6( Strat.!an T( and Read* A,( uman 7ole.ular

Geneti.( 1"t ed( Bio" S.ienti'i. ,ub( K( 1(

<( !ttp://librar$(t!inkue"t(org/)</genePt!erap$(!tm

genetic engineering & gene therapy

Documents