jornal forensik 1

7/22/2019 Jornal Forensik 1

http://slidepdf.com/reader/full/jornal-forensik-1 1/25

PEDOMAN UNTUK INTERPRETASI

SEQUENCING DNA MITOKONDRIA

Disusun oleh :

Maria ulfa

Pembimbing :

Dr. Feryal basbeth , Sp.F



PENDAHULUAN

Analisis urutan DNA mitokondria manusia(mtDNA) diekstraksi dari spesimen biologiforensik menjadi hal rutin, terutama ketika ada

DNA nuklir cukup dalam sampel. Rambut poros, tulang, gigi dan sampel lain

yang sangat membusuk dapat dicirikan denganmtDNA.

Mitokondria adalah organel subselular yangberisi genom extrachromosomal yang terpisahdan berbeda dari genom nuklir. Manusiamitokondria DNA (mtDNA) berbeda dari DNA

nuklir.



Karena karakteristik yang berbeda dari mtDNAdibandingkan dengan DNA nuklir, penerapan mtDNAmengkode dan interpretasi hasil tidak harus dalamsegala hal sama seperti yang secara rutin dilakukanuntuk mengkode DNA nuklir.

Sebuah tingkat yang lebih tinggi keberhasilan denganmengkode mtDNA, sebagai lawan DNA nuklir, daritulang tua, sangat membusuk atau hangus sisa-sisa,atau poros rambut tunggal yang diharapkan danberpengalaman dan karena salinan tinggi jumlahmtDNA (19). Lokus pada genom nuklir biasanya terjadi

karena hanya dua eksemplar per sel, mtDNA, padasisilain, hadir dalam ratusan atau ribuan salinan per sel.



Termasuk mutasi, urutan mtDNA identik untuksemua kerabat maternal terkait (sementara DNAnuklir berasal dari kedua orang tua). Fitur warisanibu dapat berguna dalam membangun atau

menyangkal identitas sampel diduga denganmenggunakan kerabat ibu yang dikenal sebagaiacuan untuk membandingkan denganmempertanyakan jenis mtDNA (4,6,9,16).

Secara umum, transmisi tipe mtDNA konsisten

lintas generasi. Bahkan, seperti lokus nuklir yangberada pada kromosom autosom, hubunganbeberapa generasi dihapus mungkin dievaluasioleh mtDNA mengetik.



Kurangnya ketepatan polimerase mtDNA, sertakurangnya mekanisme perbaikan mtDNA mengarah keyang lebih tinggi tingkat mutasi dalam genom mitokondriadibandingkan dengan genom nuklir. Beberapa daerah dimtDNA genom tampaknya berkembang pada 5 sampai

10 kali tingkat gen nuklir salinan tunggal (23,24). Tingkat tertinggi 2 variasi dalam mtDNA antar individu

yang ditemukan di wilayah kontrol non-coding di daerahhypervariable I dan II (HVI dan HVII, masing-masing).Bahkan, untuk HVI dan HVII daerah, rata-rata, Afrika

Amerika berbeda dari satu sama lain di sekitar 14 lokasi,bule, walaupun kurang polimorfik, berbeda rata-rata pada8 posisi nukleotida



Tampaknya tidak akan ada rekombinasi padamtDNA. Dengan demikian, urutan mtDNAdiperlakukan sebagai satu lokus atauhaplotype. Yang paling informatif lokus

tunggal yang digunakan untuk pengujianidentitas adalah daerah HVI dan HVII. Itulokus nuklir yang digunakan untuk pengujianidentitas cenderung independen dari satu

sama lain (26-31), karena mereka beradapada kromosom yang berbeda, atau jikamereka berada pada kromosom yang sama,rekombinasi mendestabilkan fisik linkage.



Karena mtDNA diwariskan dari ibu, mtDNA dasarnya

monoklonal dalam individu hanya satu jenis urutan

mtDNA harus diamati per individu. Namun, kondisi yang

dikenal sebagai heteroplasmi dapat terjadi. Heteroplasmi

didefinisikan sebagai lebih dari satu jenis mtDNA yang

dilakukan oleh seorang individu. Tipe A didefinisikan

sebagai urutan mtDNA atau haplotype.

Dua jenis dalam individu biasanya berbeda hanya pada

satu dasar. Namun, heteroplasmi di dua atau lebih situsdiperkirakan akan terjadi di tingkat yang jauh lebih

rendah.



Heteroplasmi dapat diamati dalam beberapa cara: 1) individu mungkin memiliki lebih dari satu jenis mtDNA dalam

jaringan tunggal

2) individu mungkin menunjukkan satu jenis mtDNA dalam satu jaringan dan jenis yang berbeda dalam jaringan lain, dan / atau

3) individu mungkin heteroplasmic dalam satu sampel jaringandan homoplasmic dalam sampel jaringan lain. Ketiga skenario ituheteroplasmic diamati pada situs 16.355 dalam sampel rambutdari anggota keluarga maternal terkait .

Studi yang dilakukan oleh Wilson, dkk dan Bendall dan Sykes(35) menunjukkan bahwa tingkat mutasi titik heteroplasmic dalamindividu rambut yang berbeda dapat bervariasi dari homoplasmyberbagai tingkat heteroplasmi.



Panjang heteroplasmi juga diamati dan biasanyabermanifestasi sebagai variasi dalam jumlah basisyang berada dalam hamparan homopolymeric(yaitu, C peregangan).

Bentuk yang paling sering terjadi dari heteroplasmi(lebih sehingga Titik heteroplasmi) adalah variasidalam jumlah C dalam hampara homopolymeric.Sejumlah penelitian telah didokumentasikanpanjang heteroplasmi dalam individu.

Mekanisme yang diusulkan untuk menghasilkanpanjangheteroplasmi adalah replikasi (menyelipkan)



Meskipun ada perbedaan mtDNA dibandingkan dengan DNA nuklir,

pengujian identitas forensik cukup lurus maju. Biasanya urutan konkordansidinilai antara referensi dan urutan mtDNA bukti.

Ketika heteroplasmi timbul, analisis yang cermat dan perbandingan

langsung antara sampel referensi ganda dan sampel harus dipertanyakan,

dalam banyak kasus, mengurangi perbedaan tafsir. Jika urutan mtDNA dari

dua sampel yang dibandingkan menunjukkan heteroplasmi (yaitu, baik

urutan yang diamati dalam setiap sampel), interpretasi tersebut tidak bisa

mengecualikan (atau konkordansi). Jika mereka berbagi urutan umum

(yaitu, satu sampel heteroplasmic dan homoplasmic lainnya, dan salah satu

jenis heteroplasmic adalah sesuai dengan jenis homoplasmic), maka

interpretasi adalah kegagalan untuk mengecualikan.

Jika kedua sampel dianggap homoplasmic dan sedikit berbeda (yaitu,biasanya hanya pada satu lokasi), penyelidikan lebih lanjut diperlukan, jika

ada resolusi dapat dicapai, interpretasi yang meyakinkan. Namun, ketika

render interpretasi (untuk konkordansi, pengecualian, atau meyakinkan dan

untuk menilai berat bukti) pada setiap perbandingan forensik, orang harus

hati untuk tidak melampaui keterbatasan saat dalam pengetahuan, mtDNA

atau sebaliknya.

Interprestasi



Ketika mtDNA dari sampel bukti dan salah satu dari sampel

referensi yang dikenal tidak dapat dikecualikan sebagai berasaldari sumber yang sama, hal ini diinginkan untuk menyampaikanbeberapa informasi tentang kelangkaan mtDNA profile.

Jika dicurigai jenis mtDNA dan jenis mtDNA bukti dianggapsesuai (yaitu, satu tidak bisa mengecualikan sampel sebagaiberasal dari sumber yang sama), praktek saat ini adalah untukmenghitung berapa kali urutan tertentu diamati dalam database(s).

Sebuah interval keyakinan dapat ditempatkan pada pengamatan.

Dengan demikian, berdasarkan pada ukuran database (s) dandiamati sampling, kisaran ditempatkan pada frekuensi mtDNA

haplotype (namun hanya perkiraan batas atas biasanyadisediakan).



PEDOMAN INTERPRESTASI Mengingat pertimbangan di atas, pedoman interprestasi untuk

mengevaluasi hasil sekuensing dari bukti dan sampel referensi yang

diperlukan. Laboratorium FBI telah mengembangkan dan

menerapkan pedoman tersebut untuk membantu pemeriksa.

Pedoman ini didasarkan pada keterbatasan state-of-the-art dan

pengetahuan saat ini mengenai mtDNA genetika dan teknologi. Satu

harus berhati-hati melebihi batas tersebut. Untuk Misalnya, ada

bukti mutasi hotspot yang berada di dalam genom mtDNA . Dengan demikian, mungkin ada keinginan untuk menunjukkan

bahwa ketika ada perbedaan dasar, misalnya, di situs 16093 antara

referensi dan bukti sampel, bahwa bukti adalah dukungan kuat

untuk menafsirkan pertandingan (atau konkordansi) dibandingkan

dengan tidak meyakinkan atau pengecualian. Karena urutan mtDNAdapat mempengaruhi konfigurasi konformasi molekul, hotspot

mungkin mitotype tertentu (konformasi dapat mempengaruhi tingkat

mutasi), dengan demikian, dalam mitotypes spesifik situs mungkin

tidak hotspot. Dalam kebanyakan kasus, itu benar-benar mungkin

benar untuk menganggap bahwa 16093 adalah hotspot, namun,sampai data tersedia, pendekatan yang lebih konservatif harus



EVALUASI DAN MEMBANDINGKAN URUTAN

Setelah evaluasi yang tepat dari kontrol positif dan negatifdan setelah selesai elektroforesis gel dan data akuisisi,menilai kualitas setiap elektroforegram dan puncak.Pemeriksa memutuskan apakah atau tidak paraelectropherograms berguna untuk tujuan analisis urutan.

Mereka electropherograms yang bukan dari kualitasyang dibutuhkan untuk perbandingan tidak akanditafsirkan lebih lanjut, jika memungkinkan, sampel dapatdiekstraksi kembali, reamplified, dan / atau re-sequencing. Semua data urutan bertekad untuk menjadi

kualitas yang diperlukan digunakan untuk perbandingantujuan.

Namun, perbandingan data urutan ke database mtDNAterbatas saat ini menjadi basis 16.024 -16.365 (HVI) dan73-340 (HVII).



Para electropherograms diimpor ke dalam programperbandingan (saat Urutan Navigator ™, PE / ABD).

Urutan untai berat yang "terbalik dilengkapi" sehinggabasis selaras dalam untai cahaya orientasi, dengandemikian, pemeriksa dapat langsung membandingkanurutan (Catatan: umumnya kedua untai mtDNA amplikonyang diurutkan). Perbandingan perangkat lunakmemungkinkan untuk perbandingan data dari urutanterpisah berjalan pada layar komputer yang sama.Umumnya, penunjukan nukleotida pada setiap posisi

template dibuat. Setelah menyelesaikan analisis urutan, pemeriksa

memutuskan pada salah satu program berikut tindakan:



A. Bahwa semua ketidakjelasan (ditetapkan sebagai "N")

diselesaikan, dan urutan tersebut akan dibandingkan dengan urutanyang relevan dalam kasus (s) dan / atau database.

B. Itu basis tidak jelas tetap, dan template yang cukup ada yangakan memungkinkan sequencing tambahan berjalan harusdilakukan untuk menyelesaikan ambiguitas. Pemeriksa akanmemutuskan apakah resequence template, atau membiarkan

sebutan dasar tidak jelas tetap. Haruskah pemeriksa memutuskanuntuk re-urutan template, ia harus menunjukkan reaksi yangsequencing tambahan harus dilakukan untuk analisis urutanberikutnya template.

C. Itu semua reaksi sequencing yang relevan telah dicoba atau re-berusaha, dan basa rancu tetap. Pemeriksa kemudian akan memilihuntuk menunjuk basis rancu sebagai "N" s, dan membandingkanurutan untuk urutan lain yang relevan (s) dan / atau database (s).Dimana kerancuan tetap, keempat kemungkinan (yaitu, A, G, C, T disitus yang hanya) harus dimasukkan dalam pencarian perbandingandengan lainnya 4 urutan dalam database. Sebagai contoh,perhatikan sepuluh urutan nukleotida berikut mana dasar keenamadalah rancu.



AATGCNTTCC Ketika urutan ini dicari dalam database referensi atau

dibandingkan dengan urutan lain yang relevan, seharusnya dapatditemukan dalam konkordansi dengan keempat dari urutanberikut:

AATGCATTCC AATGCCTTCC

AATGCGTTCC

AATGCTTTCC

Oleh karena itu urutan konkordansi didefinisikan sebagaitermasuk urutan pertandingan yang tepat, serta perbandinganurutan di mana ambiguitas yang hadir, (asalkan semua basisambigu yang sama), dan umum nukleotida hadir pada posisi (s)dari ambiguitas.



Dalam contoh-contoh di mana urutan mtDNA yang ditemukan dalamkonkordansi dengan urutan mtDNA dari item lain bukti dan hasilkonkordansi urutan disertakan dalam laporan, setiap template urutanakan independen dianalisis oleh dua pemeriksa. Suatu analisarangkaian dianggap selesai ketika kedua penguji telah tiba padakesimpulan yang sama. Jika salah satu pemeriksa menyimpulkan

bahwa urutan analisis selesai dan semua kerancuan diselesaikan, tapiyang lain menyimpulkan bahwa sequencing tambahan berjalandiperlukan, template tidak akan dianggap lengkap sampai reaksisequencing tambahan selesai, hasilnya dianalisis, dan hasil dari keduapenguji setuju.

Jika urutan tidak setuju, penguji harus memutuskan pada tindakan yangtepat. Ini tindakan biasanya akan menghasilkan Situasi b atau c di atas.Para pemeriksa dapat meminta reaksi sequencing tambahan dilakukan,atau meninggalkan sebagai rancu basis-basis di mana mereka tidaksetuju. Jika basis rancu yang tersisa di urutan terakhir, mereka akandiidentifikasi sebagai "N" dan dibandingkan dengan urutan lain dengancara yang dibahas di atas.



PERBANDINGAN (CARI) KE DATABASE DAN STATISTIK

Dalam kasus di mana tekad yang akan dibuat apakahsampel dipertanyakan dan sampel yang dikenal bisaberasal dari individu yang sama atau garis keturunanibu, kegagalan untuk mengecualikan akan dilaporkanpada saat konkordansi ditemukan. Haruskah basisambigu hadir dalam sampel baik, nukleotida umumatau panjang varian harus hadir pada posisi (s) dariambiguitas. Sebuah pencarian dari database mtDNAakan menentukan baik basa ambigu, serta mereka

yang tidak ditentukan. Basa yang ditetapkan dicatatsebagai A, C, G, atau T. Mereka yang tidakditentukan (ambigu) yang ditunjuk sebagai "N". Atau,kode IUPAC dapat digunakan (Tabel 2) dan mungkinlebih deskriptif.



Mereka basis yang tidak ditentukan tidak akan digunakan untuk tujuan

eksklusif.



Berat statistik pertandingan urutan disajikan dengancara berikut: urutan dicari terhadap databasependuduk (saat ini terdiri dari urutan mtDNA daripopulasi Kaukasia, Afrika, Asia, dan keturunanHispanik). Pernyataan yang dilaporkan akanmenyatakan berapa kali urutan tertentu hadir dalamdatabase dan akan mencakup jumlah entri dalamdatabase dari masing-masing populasi tercantum diatas.

Dalam beberapa kasus, perhitungan statistik dengantingkat kepercayaan 95% dapat dilakukan.

Nilai-nilai ini harus dimasukkan dalam catatanpemeriksa.



HETEROPLASMI

Karena ada kemungkinan bahwa mtDNA urutan heteroplasmic bisa

hadir dalam individu, perawatan harusdilakukan dalam kasus dimana urutan dipertanyakan dan dikenal sedikit berbeda. Dalamkasus tersebut, pemeriksa harus hati-hati memeriksa urutandiperoleh dari dipertanyakan dan dikenal sampel (s). Jika mungkin,tambahan yang dikenal (yaitu, referensi) sampel, termasuk namuntidak terbatas pada darah, swab bukal, dan rambut, harus diperolehdan diproses. Fragmen rambut dari standar rambut dikenal dapatdikombinasikan dan diproses sebagai single "dikumpulkan" sampeldikenal. Hingga lima (5) sampel dikenal tambahan dapat digunakansedemikian kasus.

Dalam kasus heteroplasmi, kromatogram dapat menunjukkanadanya lebih dari satu nukleotida pada posisi (s) perbedaan antarasampel dipertanyakan dan dikenal. Jika dipertanyakan dan sampel

dikenal berbeda dengan nukleotida tunggal, dan tidak ada buktiheteroplasmi hadir, perbandingan harus dilaporkan sebagaimeyakinkan. Dalam kasus di mana lebih dari perbedaan nukleotidatunggal ada antara dipertanyakan dan dikenal urutan, analisis yangcermat dari kromatogram pada posisi (s) yang berbeda akanmenentukan penafsiran yang tepat dari perbandingan.



Dalam kasus di mana lebih dari satu ekstraksi dilakukan padasampel, kegagalan untuk mengecualikan hanya akandilaporkan pada saat konkordansi lengkap (lagi mengabaikanambiguitas) dari urutan dari beberapa ekstrak ditemukan.

Namun, persyaratan ini tidak akan menghalangi penggunaanhasil sekuensing dari ekstrak tunggal harus lainnya analisissampel yang sama gagal untuk menganalisis berhasil. Dengan

kata lain, jika salah satu dari dua ekstrak dari sampel dianalisisdan yang lainnya tidak (karena, misalnya, kegagalanamplifikasi), hasil sampel yang sukses akan dilaporkan sesuaidengan pedoman.

Kedua HV I dan II HV dari daerah kontrol mtDNA manusiamengandung segmen urutan yang dapat homopolymeric.

Panjang heteroplasmi sering diamati di wilayah ini. Di HV I,daerah di mana ini paling sering mencatat dimulai padanukleotida nomor 16184.



Ketika transisi pada posisi 16.189 (TC) yang diamati, panjang heteroplasmi

sering terjadi. Dalam kasus tersebut, sulit untuk tegas menentukan jumlah

yang tepat residu sitosin hadir. Untuk alasan ini, tidak ada upaya akan

dilakukan untuk menghitung jumlah residu (untuk tujuan interpretasi), dan

semua perbandingan akan menganggap bahwa jumlah yang sama hadir.

Sebuah daerah yang sama panjang heteroplasmi ada di HVII, meliputi posisi

303-315. banyak orang menunjukkan panjang heteroplasmi di wilayah ini.

Dalam rangka untuk menilai adanya panjang heteroplasmi, hati-hati

Pertimbangan harus diberikan untuk posisi 309 dan 310 di kedua ringan dan

berat kromatogram untai. Demikian juga, harus transisi terjadi pada HV II pada

posisi 310, tidak ada upaya akan dilakukan untuk menghitung jumlah sitosin 6residu di wilayah homopolymeric untuk tujuan perbandingan. Panjang

heteroplasmi dipamerkan oleh "out-ofphase urutan carryover "hilir wilayah ini.

Oleh karena itu, posisi setelah 309 di untai cahaya dan sebelum 309 di untai

berat harus dibandingkan dengan posisi sebelum 309 di untai cahaya dan

setelah 309 di untai berat untuk bukti-bukti tersebut. Sekali lagi, dalam banyak

kasus, panjang heteroplasmi tidak digunakan untuk interpretasi. Namun, jika seseorang menentukan untuk menjadi nilai, varian umum panjang

harus hadir di kedua mempertanyakan sampel dan sampel diketahui dalam

rangka untuk kesimpulan urutan konkordansi untuk dicapai. Juga, jumlah

panjang variabilitas dalam sampel diketahui harus dipertimbangkan dalam

situasi seperti itu.



KESIMPULAN

Sebagai kesimpulan, mtDNA sequencing

menyediakan alat yang berguna untukmengkarakterisasi bukti biologis. Itu panduan yangdijelaskan dalam makalah ini akan berguna bagimereka menerapkan mtDNA sequencing. Dengankualitas tinggi praktek dan pertimbangan hati-hati

ketika mengevaluasi data mengetik (yaitu, denganmenggunakan pedoman), kepercayaan pada hasil dankesimpulan tafsir dapat dicapai. Sebagai informasilebih lanjut genetik dihasilkan dan perbaikan dalamteknologi terjadi, pedoman harus diubah untuk

mencerminkan perubahan tersebut. Ini adalah publikasi nomor 99-12 dari Divisi

Laboratorium Biro Investigasi Federal. Namaprodusen komersial disediakan untuk identifikasi, daninklusi tidak menyiratkan pengesahan oleh Biro

Investigasi Federal

jornal forensik 1

Documents