pkmp 2008 (aktivtas pemotongan dna)

7/22/2019 PKMP 2008 (Aktivtas Pemotongan DNA)

1/124

Program Kreativitas Mahasiswa

Judul Program:

Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil Untai Ganda Getah Patah Tulang

(Euphorbia tirucalli, L.) terhadap Plasmid pUC 19

Bidang Kegiatan :

PKM Penelitain

Diusulkan oleh :

Nurul Isnaini K 100 060 181

Kendri Sri Yuliati K 100 060 193

Fairus Zabadi K 100 070 134

Universitas Muhammadiyah Surakarta

Surakarta

2008


2/124

1

a. Judul ProgramAktivitas Pemotongan DNA Superkoil Untai Ganda Getah Patah Tulang


b. Latar Belakang MasalahIndonesia dikenal sebagai negara yang memiliki kekayaan hayati

terbesar kedua setelah Brazil. Hutan hujan tropis Indonesia memiliki

sekitar 3000 spesies tumbuhan berbunga (Zuhud dan Haryono, 1994).

Banyak sekali tumbuhan berkhasiat obat di sekitar masyarakat. Ada yang

berupa bumbu dapur, tanaman hias, tanaman sayuran dan tanaman buah.

Selain itu ada pula yang berupa tanaman liar tumbuh di sembarang tempat

tanpa ada yang memperhatikan (Muhlisah, 2003). Keanekaragaman ini

merupakan modal potensial untuk pengembangan obat baru.

Dewasa ini pengetahuan dan pemahaman masyarakat mengenai

tumbuhan berkhasiat semakin berkembang. Masyarakat mulai memahami

bahwa penggunaan tumbuhan untuk obat sebenarnya bisa sejajar dan

saling mengisi dengan pengobatan modern (Kusuma, 2005). Oleh karena

itu sekarang banyak dilakukan penelitian terhadap bahan-bahan alam dan

pengembangan senyawa kimia baru yang ditelusuri dari bahan alam yang

secara empiris digunakan oleh masyarakat dan terbukti memberi khasiat

obat, namun belum diketahui secara pasti kandungan zat aktifnya

(Wijayakusuma, 1993).

Kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian terbesar

di dunia. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menyatakan bahwa setiap

tahun penyakit kanker di dunia bertambah 6,25 juta orang dan dalam tahun

2010 mendatang diperkirakan 9 juta orang meninggal akibat kanker. Di

Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap

100.000 penduduk. Penyakit kanker saat ini menduduki urutan ke-3

penyebab kematian sesudah penyakit jantung dan paru-paru (Sofyan,

2000).


3/124

2

Pengobatan terhadap kanker dapat dilakukan dengan cara

pembedahan, kemoterapi (termasuk imunoterapi dan pemberian hormon),

radioterapi, atau alternatif lain melalui ramuan tradisional dari tanaman

(Sukardiman et al., 2003). Tanaman obat yang berkhasiat mengatasi

beberapa penyakit sudah banyak dibuktikan walaupun baru pada tahap

empiris. Agar peranan obat tradisional dapat lebih ditingkatkan perlu

didorong upaya pengenalan, penelitian, pengujian dan pengembangan

khasiat serta keamanan suatu tumbuhan obat, sehingga keberadaannya

dapat dikenal di kalangan medis (Wijayakusuma, et al., 1995). Obat

tradisional dikatakan rasional, jika terbukti secara ilmiah memberikan

manfaat klinik dalam pencegahan atau pengobatan penyakit dan tidak

menyebabkan efek samping serius dalam arti aman pada manusia

(Dalimartha, 2000)

Tanaman obat telah banyak digunakan untuk pengobatan

penyakit kanker, baik sebagai pencegahan maupun pengobatan. Berbeda

dengan pengobatan kanker menggunakan obat sintetik yang dapat

diberikan sebagai obat utama atau sebagai terapi adjuvant, pengobatan

dengan obat berasal dari tumbuhan dapat pula digunakan untuk

pencegahan. Dalam prakteknya, pengobatan selalu menggunakan terapi

kombinasi dari bermacam-macam tumbuhan obat dengan memperhatikan

efek samping yang mungkin terjadi (Kurnia, 2006). Antikanker diharapkan

dapat memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa

merusak sel jaringan normal (Ganiswara, 2003). Suatu tanaman dapat

dikembangkan sebagai alternatif antikanker dengan mengetahui

keberadaanRibosom Inactivating Proteintanaman tersebut (Sismindari et

al., 2002).

Ribosom Inacivating Proteins (RIPs) merupakan sekelompok

protein toksik dalam tanaman yang mempunyai aktivitas RNA N-

glikosidase (Sismindari et al., 2002). RIP mempunyai kemampuan

memotong DNA superkoil untai ganda, RNA N-glikosidase,


4/124

3

immunosupresive,sitotoksik, abortifacient, antiviral dan anti HIV (Stripe

et al., 1992)

Tanaman Euphorbia tirucalli L. telah secara empiris digunakan

untuk gastritis, tukak rongga hidung, rematik, tulang terasa sakit dan

sifilis. Sedangkan batang kayunya digunakan untuk sakit kulit kusta,

mengeluarkan duri, pecahan kaca, tulang ikan dan benda tajam lainnya

dari kulit tertusuk duri serta kutil (Dalimartha, 2003).

Tanaman patah tulang getahnya mengandung sifat asam (acid

latex), mengandung senyawa euphorbia taraksaterol, -laktucerol, euphol,

senyawa dammar yang menyebabkan rasa tajam ataupun kerusakan pada

selaput lendir, kautschuk (zat karet) dan zat pahit. Sedangkan herba patah

tulang mengandung glikosid, sapogenin, dan asam ellaf (Dalimartha,

2003).

Getah patah tulang bisa digunakan sebagai obat tradisional di

antaranya obat kulit, namun belum pernah dilakukan penelitian yang dapat

membuktikan khasiat getah tanaman ini secara ilmiah. Menurut Morales;

Forero; Roldan (2002) yang telah melakukan penelitian terhadap beberapa

tanaman keluarga Euphorbiaceae, salah satu di antaranya adalah aktivitas

antiviral daunEuphorbia tirucalli, L. terhadap virus herpes simplek type 2

(HSV-2) dengan metode MTT dan EPTT. Dari penelitian ini diketahui

bahwa ekstrak metanol air dari daun patah tulang dapat menghambat

pertumbuhan virus herpes simplek type 2 (HSV-2) dengan sangat

bermakna.

Menurut Ernawati et al.,(2007), membuktikan bahwa getah patah

tulang dapat memberikan aktivitas terhadap virus ND yang diinokulasikan

pada telur ayam berembrio dengan IC50 sebesar 0,05%. Semakin besar

konsentrasi getah patah tulang yang diinokulasikan, semakin besar titer

virus yang disebabkan sifat getah patah tulang yang iritatif.

Ribosom Inavtivating Proteins (RIPs) merupakan suatu protein.

Ekstraksi terhadap protein dari tanamanEuphorbia tirucalli, L. diharapkan

dapat meningkatkan aktivitas pemotongan DNA superkoil untai ganda.


5/124

4

Hal ini dilakukan sejalan dengan pengembangan RIPs sebagai salah satu

bahan obat yang dapat dimanfaatkan untuk antikanker. Untuk itu perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut tentang aktivitas getah Euphorbia

tirucalli, L. dalam memotong DNA superkoil untai ganda.

c. Perumusan MasalahDengan dasar dan pertimbangan di atas maka dapat dirumuskan

suatu permasalahan sebagai berikut :

1. Apakah getah Euphorbia tirucalli L. mempunyai aktivitas pemotonganDNA plasmid pUC 19 dan berpotensi sebagai Ribosom Inactivating

Protein?

2. Berapa konsentrasi getah Euphorbia tirucalli, L. yang dapatmemberikan aktivitas pemotongan DNA terhadap plasmid pUC 19?

d. Tujuan PenelitianPenelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui aktivitas pemotongan DNA getah patah tulang (Euphorbiatirucalli L) terhadap plasmid pUC 19.

2. Mengetahui besarnya konsentrasi minimal getah patah tulang(Euphorbia tirucalli, L.) yang dapat memberikan aktivitas pemotongan

DNA.

e. Luaran Yang DiharapkanLuaran yang diharapkan dengan adanya program Kreativitas

Mahasiswa Penelitian (PKMP) adalah ditemukannya aktivitas pemotongan

DNA oleh getah patah tulang untuk menguji adanya kandungan RIP dalam

tanaman yang dapat berpotensi sebagai antikanker dan dapat menghasilkan

sebuah karya/artikel paten.


6/124

5

f. Kegunaan ProgramApabila terbukti bahwa getah Euphorbia tirucalli, L. mempunyai

aktivitas pemotongan DNA terhadap Plasmid pUC 19 maka tanaman

tersebut dapat diteliti lebih lanjut menjadi salah satu obat antikanker.

g. Tinjauan Pustaka1. Tanaman patah tulang (Euphorbia tirucalli, L)

a. Uraian TanamanPatah tulang berasal dari Afrika tropis. Di Indonesia, ditanam

sebagai tanaman pagar, tanaman hias, di pot, tanaman obat, atau

tumbuhan liar. Patah tulang dapat ditemukan dari dataran rendah

sampai ketinggian 600 m di bawah permukaan laut. Tanaman ini

menyukai tempat terbuka yang terkena cahaya matahari langsung

(Dalimartha, 2003).

Perdu yang tumbuh tegak ini mempunyai tinggi 2-6 m dengan

pangkal berkayu, bercabang banyak dan bergetah seperti susu yang

beracun. Patah tulang mempunyai ranting yang bulat silindris

berbentuk pensil, beralur halus membujur, dan berwarna hijau.

Rantingnya setelah tumbuh sekitar 1 jengkal akan segera bercabang

dua yang letaknya melintang, demikian seterusnya sehingga tampak

seperti percabangan yang terpatah-patah daunnya jarang, terdapat

pada ujung ranting yang masih muda kecil-kecil berbentuk ionset,

panjang 7-25 mm, dan cepat rontok, bunga majemuk, tersusun

seperti mangkuk, warnanya kuning kehijauan, keluar dari ujung

ranting. Jika masak buahnya akan pecah dan melemparkan biji-

bijinya (Dalimartha, 2003).

Jika dibakar, ranting patah tulang yang telah kering dapat

mengusir nyamuk. Getahnya untuk meracuni ikan sehingga mudah

ditangkap. Namun, jika getah patah tulang mengenai mata, bisa

menyebabkan buta. Di Jawa, tanaman ini jarang berbunga.

Perbanyakan dilakukan dengan stek batang (Dalimartha, 2003).


7/124

6

Patah tulang dirawat dengan disiram air yang cukup, dijaga

kelembaban tanahnya dan dipupuk dengan pupuk dasar (Hariana A.

2007)

b. Sistematika dan Klasifikasi TanamanEuphorbia tirucalli, L.

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermayophyta

Divisi : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Rosidae

Ordo : Euphorbiales

Family : Euphorbiaceae

Genus : Euphorbia

Species :Euphorbia tirucalli, L.

c. Kandungan KimiaTanaman Euphorbia tirucalli L. getahnya mengandung sifat

asam (acid latex), mengandung senyawa euphorbia taraksaterol, -

laktucerol, euphol, senyawa dammar yang menyebabkan rasa tajam

ataupun kerusakan pada selaput lendir, kautschuk (zat karet) dan zat

pahit. Herba patah tulang mengandung glikosid, sapogenin, dan asam

ellaf (Dalimartha, 2003).

Patah tulang mempunyai rasa tawar, tetapi semakin lama

menimbulkan rasa tebal di lidah, berbau lemah, dan getahnya

beracun. Beberapa bahan kimia yang terkandung dalam getah patah

tulang diantaranya senyawa euphorbone, taraksasterol, -laktucerol,

euphol, senyawa dammar. Hingga saat ini efek farmakologis patah

tulang belum banyak diketahui (Hariana, 2007).

d. Nama Daerah, Nama Asing, Nama SimplisiaTanaman patah tulang di Indonesia memiliki beberapa nama

daerah seperti patah tulang (Sumatra); susuru (Sunda); kayu urip,


8/124

7

pancing tawa, tikel balung (Jawa), kayu potong (Jawa Timur)

(Hariana, 2007). Kayu jaliso, kayu leso, kayu longtolangan, kayu

tabar (Madura); Lu san hu (Cina); milk bush, finger tree, fotbad plant

tirucalli (Inggris). Nama simplisia Tirucalli Herba (Dalimartha,

2003).

e. Manfaat TanamanTanaman patah tulang secara tradisional digunakan sebagai

obat. Bagian akar dan ranting digunakan untuk pengobatan

gastritis/nyeri lambung, tukak rongga hidung, rematik, tulang terasa

sakit, nyeri saraf, wasir dan siphilis (Dalimartha, 2003).

Bagian batang kayu digunakan untuk sakit kulit, kusta (Marbus

Hansen) dan kaki dan tangan baal. Herbanya dapat digunakan untuk

mengobati bisul, kurap, terkilir, tulang patah, rematik, tahi lalat

membesar dan gatal, cacar ular (Herpes zoster), borok/ulkus karena

frambusia, sakit gigi, radang telinga, dan tertusuk duri atau tulang

ikan, atau dapat juga dicampur dengan susu untuk mengobati

penyakit kulit, seperti gatal-gatal, kurap, tumor, kutil dan hafalan

(alavus) (Dalimartha, 2003). Gilingan halus kulit luar dahan patah

tulang, hasil gilingan ditempelkan pada kulit di atas tulang yang

patah dapat mengobati tulang patah (Hariana, 2007).

2.Ribosom Inactivating Protein(RIP)a. Definisi

Ribosom inactivating Protein (RIP), merupakan sekelompok


glikosidase yang mampu menghambat sintesis protein pada mamalia

(Sismindari, 2004). Aktivitas RNA N-glikosidase yang dapat

mendepurinasi rRNA mamalia dan 28S ribosom bakteri. Sisi

depurinasi terletak pada A4324 dalam mamalia dan 28S ribosom

RNA eukariot atau A2660 dalam 26S rRNA prokariot sehingga

menyebabkan ketidakmampuan untuk mengikat faktor elongasi

2(EF2), akibatnya sel tidak dapat melaksanakan perpanjangan asam


9/124

8

amino pada sintesis protein (Barbieri et al., 1993 cit Sulistyani,

2003).

b. Distribusi RIPs pada tanamanRIPs dapat dibagi dalam dua grup yaitu RIPs tipe I (Holo RIPs)

dan RIPs tipe II (Chimero RIPs). Secara luas RIP terdistribusi pada

tanaman tingkat tinggi (Ling et al., 1994) dan kebanyakan spesies

yang mengandung RIPs dari klas Angiospermae, baik monokotil

maupun dikotil. RIPs dapat dijumpai di berbagai organ dan jaringan

tumbuhan meliputi biji, buah segar, akar, daun, getah, dan batang

(Hartley et al., 1994). Banyak tanaman lain yang menunjukkan

aktivitas menyerupai RIPs hanya saja belum terkarakterisasi

sempurna. RIPs dengan struktur yang mirip dan fungsi yang sama

dapat ditemukan dalam tanaman yang secara taksonomi tidak

membuat ini, meskipun hanya beberapa bagian dari tanaman yang

digunakan memiliki hubungan kekerabatan (Stripe et al., 1992).

Daftar RIPs tipe II tertera secara historis beberapa protein ini

sudah dikenal sebelum diketemukannya. RIPs tipe I, ricin dan abrin

dikenal pada akhir abad ini, meskipun hanya beberapa bagian dari

tanaman yang digunakan untuk pemurnian (Stripe et al., 1992).

c. Aktivitas enzimatikEndonuklease dan co-workers menunjukkan bahwa RIPs

merupakan suatu enzim. Di mana ricin mengenali daerah 28s dari

rRNA membentuk ikatan N-C glikosidik spesifik antara adenin dan

nukleotida. RNA setelah adenin dipindahkan, sisi adenin menjadi

tidak stabil karena reaksi eliminasi setelah digabung dengan asam

anilin. Pemindahan 1 basa adenin mengakibatkan subunit 60s dari

ribosom eukariot tidak mampu berikatan dengan faktor elongasi 2

(EF2) sebagai konsekuensinya sintesis protein terhenti (Stripe et al.,

1992).


10/124

9

d. Aktivitas BiologiAda beberapa aktivitas biologi yang dimiliki oleh RIPs seperti

sitotoksisitas pada mamalia, immunosuppresive, abortifacient,

antiviral, antifungi, antimikroba, pemotongan DNA superkoil untai

ganada serta menghambat replikasi HIV.

1) Aktivitas sitotoksitas pada sel mamaliaEfek secara langsung RIPs tipe I dan II terhadap fungsi dan

struktur sel adalah merusak ribosom secara irreversible lebih

tepat lagi subunit 28s ribosom gagal mengikat faktor elongasi 2,

akibat sintesis protein menjadi terhambat pada sel mamalia RIPs

tipe II mempunyai aktivitas yang lebih tinggi daripada RIPs tipe I

dalam menghambat sintesin protein. Tetapi toksisitas tinggi bila

dikonjugasi pada suatu pembawa sehingga membantu masuknya

rantai A ke dalam sel, rantai A bersifat katalitik. Pembawanya

dapat berupa antibody monoclonal, lektin, hormon atau dengan

menaikkan permiabilitas membran sel sehingga rantai A mudah

masuk ke dalam sel.

Ketoksikan RIPs tipe I lebih rendah daripada RIPs tipe II

karena tidak mempunyai subunit disebabkan konsekuensinya

kemampuan penghalang dan masuk ke dalam sel lebih rendah.

Rantai lektin pada RIPs tipe II dapatmengikat gula dengan

konformasi D-galaktose dan pada ujung resptor galaktosil yang

terdapat pada kebanyakan sel mamlia sehingga sel teraglutinasi

secara in vitro dan toksin dapat memasuki sel tetapi juga

menfasilitasi masuknya rantai A dengan mekanisme yang belum

diketahui terjadi pemasukan melalui perantara resptor endositosis

sehingga RIPs mampu mencapai golgi apparatus dimana ikatan

disulfida di antara kedua sisinya dapat diputus oleh disulfida

oksidoreduktase.


11/124

10

2) Aktivitas immunosupressiveAktivitas RIPs sebagai immunosupressive ditunjukkan bila

RIPs tersebut dikonjugasikan ke molekul sebagai carrier yang

dapat membawa ke populasi sel target spesifik. Antibodi

monoklonal merupakan pilihan terbaik sebagai carrier untuk

membawa konjugat (immunotoksin), tatapi hormon faktor

pertumbuhan dan lektin dapat juga digunakan sebagai carrier.

Ligan toksin dan imunotoksin telah banyak digunakan

untuk memindahkan secara selektif fibroblast yang

terkontaminasi dari kultur sel darah pankreas. Imunotoksin telah

digunakan untuk membasahi sel T secara ex vivo dari tulang

belakang sebelum dilakukan transplantasi prophylaxis dari graft

mico host disease secara in vivo. Penggunaan imunotoksin

memberi harapan terbesar terhadap hasil perawatan pada

pengcangkokan tumor. Imunotoksin telah sukses digunakan

untuk mengobati resisten steroid graft, melawan host penyakit

dengan suatu imunotoksin yang anti T limphosit. Aplikasi lain

dari imunotoksin meliputi perawatan autoimmune, penyakit

thyreopathy, myasthenia gravis dan membunuh parasit.

Imunotoksin dapat ditambahkan secara tidak langsung

dengan menggunakan antibiotik melawan sel antigen senjutnya

ditambahkan ke dalam preparasi imunotoksin dengan antibodi

melawan imunoglobulin G. Mekanisme lain dari perjalanan

toksin ke sel target spesifik menggunakan campuran antibodi

atau fragmen F (antibodi) yang salah satu sisinya berikatan

dengan sel target dan lainnya dengan toksin. Selain ricin

beberapa RIPs tipe I lain yang digunakan sebagai imunotoksin

diantaranya gelonin, PAP, saponin, momordin, bryodin, dan

barley (Stripe et al., 1992).


12/124

11

3) AktivitasAbortifacientTelah ditemukan dalam suatu protein yaitu trikosantin

protein ini memicu aborsi pada mencit, kelinci, dan kera tetapi

tidak pada tikus. Diduga mekanisme abortifacient sebagai

berikut:

a) Menyebabkan nekrosis selektif pada bagian nLi plasenta,b) Terjadi formasi pembekuan pada sirkulasi lokal yang

menginuksi infra pada daerah yang luas,

c) Perubahan yang disertai perusakan aktivitas fungsionaldengan penurunan drastis kadar HCG dan hormon steroid

perubahan metabolisme serta meningkatkan sintesis

prostaglandin yang kemudian menginduksi terjadinya aborsi

(Barbieri et al., 1993).

e. Aktivitas antiviralSemua RIPs tipe I telah terbukti beraktivitas sebaga antivirus

kecuali RIPs tipe II (Kumar dkk, 1993) pada beberapa RIPs yang

telah diketemukan diantaranya diketahui mempunyai aktivitas

antiviral baik pada virus tanaman maupun hewan, antara lain PAP

(Pokeweed Antiviral Protein) dan diantaranya merupakan suatu RIPs

yang mampu menghambat infeksi Tobacco Mozaic Viruspada daun

Nucotiana tobacum (Stripe et al, 1981 cit Barbieri et al, 1993).

Mekanisme antivirus berdasarkan pada

1) RIPs masuk lewat sitosol masuk lewat sitosol sel yang terinfeksikarena lebih permiabel kemudian menghancurkan mesin sintesis

protein sehingga virus tak bisa bereplikasi dan sel yang terinfeksi

saling berdekatan

2) RIPs bertindak secara tidak langsung melalui pengaktivan sistempertahanan tanaman (Willey et al, 2001)

f. Aktivitas pemotongan DNA superkoil untai ganda secara in vivoBeberapa RIPs seperti Ricini (mengandung rantai A) seperti

ditemukan pada : Luffin, cinnamomi dan champhoril yang mampu


13/124

12

mengekpresikan aktivitas enzim untuk memotong DNA superkoil

untai ganda dan khususnya sarcin yaitu suatu RIPs dengan aktivitas

ribonuklease, RIPs dapat memotong DNA superkoil untai ganda

menjadi nick circular pada kadar tinggi, tetapi hal itu tidak berefek

pada DNA linier walaupun RIPs tipe II utuh tidak mengekpresikan

aktivitas RNA N-glikosidase tapi terbukti dapat memotong DNA

superkoil (Ling et al, 1994)

Rantai A cinnamomi dilaporkan dapat membelah DNA

superkoil untai ganda ke linier (Ling et al, 1994) pemecahan molekul

dari DNA superkoil ke linier dengan deadenilasi rantai A cinnamomi

terjadi secara spontan pada ikatan fosfodiester setelah pemindahan

adenin sebagai bagian aktif dari RNA N-Glikosidase kerusakan di

dalam DNA superkoil terletak pada daerah yang kaya akan pasangan

basa AT yang mengarah pada aksi rantai A cinnamomi ikatan

fosfodiester pada daerah superkoil akan menjadi rapuh dan mudah

rusak karena tarikan dari dalam DNA superkoil. Pemecahan satu sisi

purin dalam satu untai dari deadenilasi DNA superkoil akan

menghasilkan bentuk nick dan linier (Ling,1995) menyatakan bahwa

aktivitas dari RIPs ini seperti enzim endonuklease pada 3D sebelah

deoksinukleotida meninggalkan sisi 5fosfat akhir dari DNA

superkoil.

3. PlasmidPlasmid adalah molekul untai ganda ekstra kromosomal dengan

ukuran bervariasi antara 1 kb sampai lebih dari 200 kb ditemukan pada

berbagai spesies bakteri yang dipakai sebagai unit gen untuk melakukan

replikasi (Sambrook et al., 1989). Plasmid membawa tipe gen yang

sangat bervariasi fungsi seperti resisten terhadap antibodi, resisten

terhadap logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau resisten

terhadap bakteriophage kemampuan untuk membentuk membentuk

hubungan simbiosis dan transfer DNA antar kingdom (Feinbaum, 1998)


14/124

13

Berdasarkan atas sifat umum yang yang dikode oleh gen dalam

plasmid dapat diklasifikasikan menjadi 5 jenis utama:

a. F membawa gen fertilitas dan tidak memiliki sifat lain kecualikemampuan untuk melakukan transfer plasmid dengan cara

konjugasi

b. R membawa gen yang menyebabkan resisten bakteri tuan rumahterhadap satu atau lebih gen antibiotik seperti ampisilin

c. Plasmid kolisigenik dapat mengkode kolisin suatu protein yang dapatmembunuh bakteri lain

d. Plasmid degradatif memungkinkan bakteri untuk mengadakanmetabolisme molekul yang tidak biasa

e. Plasmid virulensi dapat menyebabkan patogenesis pada bakteri tuanrumah (Brown, 1991)

Semua plasmid memiliki paling sedikit satu urutan

rangkaian DNA yang dapat bertindak sebagai asal replika sehingga

plasmid itu mampu memperbanyak diri dalam sel tanpa tergantung pada

kromosom bakteri. Plasmid mempunyai gen yang mengkode enzim yang

spesifik untuk replikasi plasmid itu sendiri, tetapi juga menggunakan

enzim replikasi dari sel host (Brown, 1991)

Sedikitnya ada tiga keuntungan dengan memanfaatkan plasmid

a. Mudah ditangani karena tahan terhadap kerusakanb. Bersifat multiple copy di dalam sel inangnya sehingga lebih efektif

digunakan untuk kloning DNA

c. Jarang memiliki sisi perpotongan dari enzim endonuklease yangsama sehingga temapt penyisipan gen menjadi spesifik (Mulando,

2002). Jumlah kopi plasmid yaitu jumlah molekul plasmid dalam

tiap sel bakteri dibawah kondisi pertumbuhan, dibagi menjadi 2

yakni: plasmid high copy dengan jumlah kopi lebih besar dari 20

kopi per sel bakteri dan number low copy number dengan jumlah

kopi lebih kecil dari 20 kopi per sel (Feinbaum, 1998).


15/124

14

4.Escherichia coliEscherichia coli merupakan gram negatif, fakultatif aerob,

tumbuh baik pada media sederhana, berbentuk batang pendek, kadang

berderet seperti rantai biasanya hidup di dalam saluran usus manusia,

hewan sebagai flora normal dan intertin. Escherichia coli dapat

melakukan fermentasi laktosa dan glukosa, serta menghasilkan gas

(Endang, 2003). JenisE. coliDH5 mempunyai aktivitas serupa dengan

JM 103 dan JM 109 yakni -galaktosidase -complementation, yaitu bila

ditumbuhkan dalam medium yang berisi IPTG dan X-GAL jenis ini

mempunyai kemampuan recA1, yakni kemampuan penggabungan ulang

rekombinan, menyusun kembali struktur koloni DNA denagn cara

memasukkan atau menyisipkan (Davis et a.l, 1994).

h. Metode Penelitian1.Definisi Operasional Penelitian

Variabel bebas : konsentrasi getah daun patah tulang

Variabel tergantung : aktivitas pemotongan terhadap DNA superkoil

dari getah patah tulang

2.Bahan dan AlatBahan-bahan yang digunakan :

a. Bahan utama : getah segar dari tanamanEuphorbia tirucalli, L.b. Bahan pelarut untuk getah : aquadestc. Daun pukul empat (Mirabillis jalapaL) jenis bunga warna merahd. E. colligalur DH 5e. Medium Luria Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989)

1) LB cair terdiri dari tripton 1% (b/v), ekstrak yeast 0,5 % (b/v),NaCl 1% (b/v), aquabides sampai volume yang dikehendaki,

ampicilin 50 g/ml.

2) Medium LB padat dapat dibuat dengan penambahan agar oxoid1,5% (b/v)pada LB cair.

f. DNA plasmid pUC 19


16/124

15

g. Bahan isolasi pUC 19 antara lain (Sambrook et al., 1989)1) Larutan lisis I : glukosa 50 mM, Tris Cl 25 mM pH 8,0 dan etilen

diamin tetraasetat 10 mM pH 8,0, aquadest

2) Larutan lisis II : NaOH 0,2 N dan Na dodesil sulfat 1% pH 7,03) Larutan lisis III : kalium asetat 5 mM pH 4,8 60 ml, asam asetat

1,5 ml, aquabidest

4) Larutan TE pH 7,4; tris klorida 10 mM pH 7,4 dan etilendiamintetraasetat 1 mM

5) Larutan pengekstraksi : fenol, kloroform, 0,01 mM triskloridapH 7,5

6) Larutan pengendap dan pencuci : Na asetat, etanol 96%, etanol70 %

h. Larutan CaCl 0,1 Mi. Bahan elektroforesis gel agarose antara lain (Sambrook et al.,1989)

1) Agarose 0,8% (b/v)2) Dapar TBE (1X) : tris borat 0,889 mM dan etilen diamin

tetraasetat (EDTA) 0,2 mM pH 8,0

3) Larutan pewarna : etidium bromide 0,25 g/ml4) Dapar pemuat (loading buffer), silen sianol 0,25%, biru brom

fenol 0,25%, dan gliserol 30%

j. Dapar untuk ekstraksi protein : dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2(NaH2PO4 dan Na2HPO4) yang mengandung NaCl 0,14 M

k. Dapar untuk uji aktivitas pemotongan DNA superkoil, dapar TMN :tris Cl 50 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM dan NaCl 100 mM.

Alat-alat yang digunakan :

Alat-alat gelas, autoklaf (Hiclave H-25), penangas air, sentrifus,

bejana elektroforesis, alat elektroforesis, lampu UV (UV

transiluminator), timbangan analitik, pH meter, vortex, spektrofotometer,

kuvet, mikropipet, tip kuning, tip biru, tip putih, eppendorf, tabung


17/124

16

conical, pembakar bunsen, ose, lemari pendingin, incubator orbital

shaker, foto digital.

3.Rencana Penelitiana. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan dengan mencocokkan keadaan

morfologi tanaman berdasarkan kunci-kunci determinasi

menggunakan literatur untuk memastikan identitas tanaman dan

menghindari kesalahan dalam pengambilan tanaman.

b. Sterilisasi alatAlat-alat yang akan dipergunakan terlebih dahulu dicuci

dengan sabun sampai bersih kemudian dikeringkan menggunakan

serbet bersih. Setelah kering, disterilkan dengan autoklaf selama 20

menit pada 121C.

c. Preparasi Getah Patah TulangGetah patah tulang langsung ditampung dan dibuat seri

konsentrasi. Dibuat beberapa seri konsentrasi yaitu 0.5%; 0,25%;

0,125%; 0,625%; 0,3125%, dengan melarutkan getah dalam

aquadest.

d. Pembuatan Media Luria BertaniMedia Luria Bertani (LB) ditimbang dan dilarutkan dalam

aquadest dengan bantuan pemanasan. Media LB padat dibuat dengan

penambahan agar Oxoid 1,5%, kedua bahan disterilkan dalam

autoklaf pada suhu 121 C selama 20 menit. Antibiotik ampisillin

ditambahkan terakhir secara aseptik dengan konsentrasi akhir

100g/ml.

e. Pengukuran kadar protein ekstrak gubal dengan metodespektrofotometri UV

Kadar protein dalam sampel ekstrak gubal diukur serapannya

dalam dapar Na fosfat 5 mM dengan spektrofotometer UV pada

280 nm dan 260 nm, menggunakan blangko dapar natrium fosfat 5

mM. Kadar protein dihitung dengan rumus :


18/124

17

Kadar protein (mg/ml) = A280x faktor koreksi x faktor pengenceran

(Layne, 1957)

f. Preparasi DNA pUC 191) Pembuatan sel kompetanE. coli

Suspensi E.coli DH 5 sebanyak 100 l ditumbuhkan

dalam 5 ml medium LB cair. Kemudian diinkubasi dalam

incubatororbital shaker24 jam pada suhu 37C. Selanjutnya 1

ml kultur tersebut disubkulturkan kembali dalam 50 ml medium

LB cair dan dinkubasi pada suhu 37C selama 3-4 jam, yaitu saat

mencapai pertengahan fase eksponensial (kepadatan 5 x 106 2 x

107 sel/ml LOD600= 0,6). Kultur yang didapat disentrifus dengan

kecepatan 4000 ribu rpm pada suhu 4C selama 5 menit, lalu

supernatan dibuang, pellet disuspensikan dalam 0,1 M CaCl2

yang telah didinginkan dalam es sebanyak 0,2 x volume kultur

awal. Kemudian diletakkan di atas es selama 5 menit dan segera

disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang

dengan hati-hati. Pellet yang diperoleh dicuci dengan 0,1 M

CaCl2yang telah didinginkan dalam es sebanyak 0,04 x volume

kultur awal dan didiamkan dalam es selama 30 menit (Sambrook

et al.,1989).

2) Transformasi DNA plasmid pUC 19 padaE. coliDH5.Suspensi E. coli kompeten sebanyak 200l dimasukkan

dalam tabung ependorf steril. Selanjutnya diletakkan dalam es

selama 5 menit, lalu ditambahkan DNA plasmid pUC 19

(sejumlah 50 ng dalam volume 10l) pada masing-masing

tabung. Kemudian dicampur isinya dengan menggoyang tabung

secara perlahan-lahan. Selanjutnya didiamkan dalam es selama

30 menit. Setelah itu dilakukan kejutan panas (heat shock)pada

suhu 42C selama 90 detik, tabung tidak digoyang dan segera

dimasukkan kembali ke dalam es selama 1-2 menit, kemudian

ditambahkan 800l medium LB cair. Lalu dicampur perlahan-


19/124

18

lahan dengan membolak-balik tabung 5-10 kali dan diinkubasi

pada 37C selama 45 menit. Suspensi sebanyak 100l ditebarkan

pada medium LB padat yang mengandung antibiotik ampisilin.

Cairan diratakan agar memenuhi seluruh permukaan media,

kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam (Sambrook

et al., 1989).

3) Isolasi DNA plasmid pUC 19.Koloni E. coli yang mengandung plasmid pUC 19

ditumbuhkan dalam 50ml medium LB cair-ampisilin pada suhu

37C 24 jam dalam incubator orbital shaker. Kultur tersebut

dituang ke dalam ependorf steril lalu disentrifuse dengan

kecepatan 12.000 rpm pada suhu 37C selama 10 menit,

kemudian supernatan dibuang. Pelet disuspensikan dalam 100l

buffer lisis I dingin divortek dan dibiarkan di dalam es selama 5

menit. Selanjutnya ditambahkan 200l larutan lisis II dan

dicampur dengan membolak-balikkan tabung 5 kali, lalu

dibiarkan dalam es selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan

150l larutan netralisasi (lisis III), divortek dan dibiarkan dalam

es selama 5 menit. Suspensi disentrifugasi 12.000rpm selama 10

menit. Supernatan diambil dengan mikropipet, dipindahkan

dalam tabung ependorf baru yang steril, selanjutnya supernatan

diekstraksi dengan fenol kloroform sama banyak, divortek dan

disentrifugasi 12.000rpm selama 10 menit. Fase paling atas

dipisahkan dalam tabung ependorf baru dan steril kamudian

ditambahkan natrium asetat 3M sepersepuluh kali volume dan

alkohol absolut dua kali volume, selanjutnya disimpan pada suhu

-20C selama 1 jam. Tahapan dilanjutkan dengan sentrifugasi

pada kecepetan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang

diperoleh dibuang kemudian dicuci dengan 1 ml etanol 70% dan

disentrifugasi 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang

diperoleh dibuang, pelet dikeringkan pada 37C, kemudian


20/124

19

dilarutkan dalam 20l buffer TE 1 kali dan disimpan pada suhu

4C semalam (Sambrook et al.,1989).

g. Uji aktivitas pemotongan DNA superkoil oleh ekstrak gubal.Tiga mikroliter DNA plasmid pUC 19 dicampur dengan 1l

buffer TMN dan diinkubasi dengan ekstrak gubal daun bunga pukul

empat dan getah patah tulang dalam satu seri kadar protein yang

meningkat hingga volume akhir 10l. Kemudian diinkubasi pada

temperatur kamar (30C) selama 1 jam. Pada akhir reaksi

ditambahkan 2l buffer pemuat, kemudian dielektroforesis pada gel

agarosa yang sudah mengandung pewarna etidium bromid,

menggunakan buffer TBE. Elektroforesis dilakukan pada 50 volt

hingga kurang lebih tiga perempat panjang gel. Identifikasi

dilakukan dengan sinar ultraviolet.

Jalannya Penelitian

Gambar 1. Skema Jalannya Penelitian

Pengumpulan getah

patah tulang

Determinasi tanaman

Dibuat seri

konsentrasi

DNA plasmid pUC 19

TransfomasiE.coli

DH 5

Isolasi DNA pIC 19

Uji aktivitas pemotongan

DNA

Elektroforesis DNA

Pengamatan UV

Analisis hasil


21/124

20

i. Teknis AnalisisData-data yang diperoleh dari hasil uji aktiivitas ekstrak getah

dianalisis secara kualititatif yakni:

Aktivitas pemotongan DNA superkoil ditentukan dengan mengamati 3

kriteria yakni: penipisan DNA superkoil, penebalan DNA nick sirkuler,

dan pembentukan DNA linier pada pita DNA hasil elektroforesis di bawah

lampu UV. Uji dikatakan positif apabila pada hasil digesti ekstrak terjadi

pola penipisan DNA superkoil dan penebalan nick sirkuler pada kadar

rendah, sedangkan pada kadar yang lebih tinggi akan muncul pita DNA

linier yang makin menebal.

j. Jadwal KegiatanBulan ke

Kegiatan1 2 3 4 5 6

1. Persiapan

2.Pelaksanaana. Determinasi tanaman

b.Penyiapan alat dan bahanc. Preparasi getahd.Transformasi DNAe. Isolasi DNAf. Uji Aktivitas Pemotongan

DNA

3. Analisis data

4. Penyusunan Laporan

k. Nama dan Biodata Ketua serta Anggota Kelompok1. Ketua Pelaksana Kegiatan

Nama Lengkap : Nurul Isnaini

NIM : K 100 060 181

Fakultas/Program Studi : Farmasi/Farmasi

Perguruan Tinggi : Universitas Muhammadiyah Surakarta

Waktu untuk Kegiatan PKM : 6 jam/minggu


22/124

21

2. Anggota PelaksanaNama Lengkap : Kendri Sri Yuliati

NIM : K 100 060 193




Nama Lengkap : Fairus Zabadi

NIM : K 100 070 134




l. Nama dan Biodata Dosen Pendamping1. Nama lengkap dan gelar : Peni Indrayudha, S.F., Apt

2. Golongan Pangkat dan NIP : Penata Muda / IIIa, 132313376

3. Jabatan Fungsional : Lektor

4. Jabatan Struktural : -

5. Fakultas / Program Studi : Farmasi / Farmasi

6. Perguruan Tinggi : Universitas Muhammadiyah Surakarta

7. Bidang Keahlian : Bioteknologi Farmasi

8. Waktu untuk Kegitan PKM : 4 jam/minggu


23/124

22

m. Biaya1. Bahan Untuk Preparasi GetahEuphorbia tirucalli, L.

No Jenis Bahan Banyak HargaSatuan

Jumlah

1 TanamanEuphorbia tirucalli 1 35.000 35.000

2 Determinasi Tanaman 50.000 50.000

3 Aqudest 10 L 2.500 25.000

4 Blue Tips 150 500 75.000

5 Yellow Tips 150 500 75.000

6 Speader Glass 1 15.000 15.000

7 Aluminium Foil 1 15.000 15.000

Total 290.000

2. Bahan Untuk Medium Luria BertaniNo Jenis Bahan Banyak Harga Satuan Jumlah

1 Tripton 1% 1 75.000 75.000

2 Ekstrak Yeast 0,5% 1 75.000 75.000

3 NaCl 1% 100 1800 180.000

4 Ampicilin 1 100.000 100.000

5 Aqubides 1L 100 100.000

6 Agar oxoid 1,5% 1 50.000 50.000

7 Cawan Petri 10 20.000 200.000

Total 780.000

3. Bahan untuk Transformasi dan IsolasiNo Jenis Bahan Banyak Harga Satuan Jumlah

1. BakteriE. coli 1 150.000 150.0002. Plasmid pUC 19 50 5.000 250.000

3. Tris Cl 25 mM pH 8,0 100 2.000 200.000

4 Larutan NaOH 100 500 50.000

5 Na dodesil sulfat pH 7,0 100 1.500 150.000

6 Kalium asetat 5 mM pH 4,8 100 2.000 200.000

27 Asam asetat 100 1.000 100.000

8 Larutan TE pH 7,4 100 2.500 250.000

9 EDTA 1mM 200 600 120.00010 Na asetat 100 2.600 260.000

11 Etanol 96 % 1 L 40.000 40.000

12 Etanol 70% 1 L 35.000 35.000

13 Larutan CaCl2 0,2 M 100 1.000 100.000

14 Agarose gel 100 1.200 120.000

15 Gloves 1 pak 40.000 40.000

16 Masker 5 3.000 15.000


24/124

23

17 Dapar TBE 100 2.000 200.000

18 Etidium bromide 100 1.300 130.000

19 Tabung Reaksi 15 5.000 75.000

20 Cawan Petri 15 20.000 300.00021 Ependorf 1 pak 175.000 175.000

22 Erlenmeyer 10 20.000 200.000

Total 3.220.000

4. Biaya Untuk Uji Pemotongan DNANo Jenis Bahan Banyak Harga

Satuan

Jumlah

1. Tris Cl 50 mM 100 1.800 180.0002. MgCl2 10 mM 100 2.000 200.0003.

NaCl 100mM 100 1.800 180.0004. Loading Buffer 1 80.000 80.000

Total 640.000

5. Biaya Penunjang PenelitianNo Jenis Bahan Biaya

1. Biaya Sewa Laboratorium UMS 300.000

2. Pencarian Data 50.000

Total 350.000

6.

Biaya Pembutan LaporanNo Jenis Bahan Jumlah

Satuan

Harga

Satuan

Jumlah

1 Penggandaan 6 10.000 60.000

2 Fotocopy 6 7.500 45.000

3 Penjilidan Soft Cover 6 5.000 30.000

4 Kertas HVS 1 rim 35.000 35.000

5 Catride Refill 1 150.000 150.000

6 CD Blank 1 5.000 5.000

7 Flash Disk 1 Gb 1 90.000 90.000

8 Dokumentasi Hasil 5 56.000 280.000

9 Rental Pangetikan 10 2.500 / jam 25.000Total 720.000


25/124

24

Rekapitulasi Rincian Biaya

1 Bahan Untuk Preparasi GetahEuphorbia tirucalli, L. Rp. 290.0002 Bahan Untuk Medium Luria Bertani Rp. 780.0003 Bahan untuk Transformasi dan Isolasi Rp. 3.220.0004 Biaya Untuk Uji Pemotongan DNA Rp. 640.0005 Biaya Penunjang Penelitian Rp. 350.0006 Biaya Pembutan Laporan Rp. 720.000

Total Rp. 6.000.000


26/124

25

DAFTAR PUSTAKA

Barbieri, L., Batteli, M. G., Stripe, F., 1993, Ribosom-inactivating Protein fromPlants, BiochemBiophy Acta,1154, 681-694.

Brown, T. A., 2003, Pengantar Kloning Gen, diterjemahkan oleh Prasena, 11-15,

Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta.

Dalimartha, S., 2003, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 3. Puspa Swara,

Jakarta, Hal. 89-92.

Davis, L. G., Kuehl, W. M., and Battey, J. F., Basic Methods in Molecular

Biology,Second edition, Applenton and Lange Norwalk, Connecticut.

Feinbaum, R., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley andSons inc, 1.5.1-1.5.17, cit: Dewi Ngolady, 2000, Identifikasi Ribosome

Inactivating Protein dari Ekstrak Gubal Daun Cangkringan (Erythrina

fusca Lour), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

Ganiswara, 2003,Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, 636-701, Bagian Farmakologi

Fakultas Kedokteran, Jakarta.

Hartley, M. R., Chaddoch, A., Bonness, M., S., 1996, The Structure and Function

of Ribosome Inactivating Protein, Trends Plant SCL, Vol.1, No.8, 254-

260.

Kurnia, A., Pertamawati., Rifatul W., Hendig, W., 2005, Efek Penghambat

Pertumbuhan Cell-line Secara In-Vitro dari Ekstrak Etanol Buah

Mahkota Dewa(Phaleria macrocarpa Scheff.).,Artocarpus, Vol 5 (2),

89.

Kusuma, Fauzi, R., Zaky, M., 2005, Tanaman Liar Berkhasiat Obat, Hal. 6,

Andromedia Pustaka, Jakarta.

Ling, J., Liu, W., Wang, T. P., 1994, Cleavage of Supercoil Double Stranded

DNA by Several RIPs in vitro,Febs Letters, Vol. 345, 143-146.

Mulando, 2002, Seputar TeknologiRekayasa Genetika, Pustaka Wira Usaha

Mandiri, Jakarta.

Sambrook, Fritish, E. F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning : a laboratory

Manual, Edisi 1, Hal 1.1.2-1.1.3, Cold Spring Harber Laboratory

Press, USA.


27/124

26

Sismindari, Sudjadi, Sulistyani, N., 2002, Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil

oleh Fraksi Protein Daun Morinda citrifolia, Majalah Farmasi

Indonesia, 13 (4), 174-179.

Stripe, F., Bateli, M. G., Soria, M., Lappi, D. A., 1992, Ribosom-Inactivating

Proteins from Plants Present Status and Future Prospect, Bio

Technology,Vol 10.

Sukardiman, Puspitasari, H.p., Widyawaryanti., 2003, Uji Aktivitas Ekstrak

Metanol Herba Ageratum congzides L pada Kultur Sel Myeloma

Mencit,Majalah Farmasi Airlangga, Vol.3, 93.

Sulistyani, N., 2003, Perbandingan Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil antara

Ekstrak Gubal Umbi dan Daun Bawang Putih (Allium sativum L),

Pharmacon,4 (1), 1-5.

Wijayakusma, H. M.,1993, Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia, Cetakan

Pertama, Jilid II, Pustaka Kartini, Jakarta.

Zuhud, E. A dan Haryanto, 1994. Pelestarian Pemanfaatan Keanekaragaman

Tanaman Obat Hutan Tropika, Jurusan Konversi Sumber Daya Hutan

Fakultas Kehutanan IPB dan Lembaga Alam Tropika Indonesia,

Bogor, Hal. 229-230.


28/124


29/124

28

n. LampiranDaftar Riwayat Hidup

1.Nama : Nurul Isnaini2. Tempat / tgl lahir : Pekalongan, 9 Maret 19883. Jenis Kelamin : Perempuan4. Pekerjaan : Mahasiswi5. Alamat Rumah : Jl. KH.Samanhudi No.60 RT:03/06 Kelurahan

Pasirsari Pekalongan

6.No. HP : 085647185178

7. Riwayat Pendidikan 1992 - 1993 : TK Masyithoh IX Kergon Pekalongan 1993 1994 : SDN Sapuro IV Pekalongan 1994 1999 : SDN Tirto 0I Pekalongan 1999 2002 : SMPN 2 Pekalongan 2002 2005 : SMUN 3 Pekalongan 2006 Sekarang : Pend. S1 Fakultas Farmasi UMS

8. Riwayat Organisasi 2002 2003 : Pramuka Jabatan : Anggota 2003 2004 : Pramuka Jabatan : Bendahara Bantara 2006 2007 : LPM Natural Jabatan : Anggota Bidang Redaksi 2007 2008 : LPM Natural Jabatan : Sekretaris Umum 2006 Sekarang : RMC Jabatan : Anggota Bidang PPSDM

9. Mottto Hidup : Jangan pernah menyerah untuk meraih mimpidan jalani hidup ini untuk meraih ridho Illahi


30/124

29

Daftar Riwayat Hidup

1. Nama : Kendri Sri Yuliati2. Tempat / tgl lahir : Wonosobo, 20 Juli 19883. Jenis Kelamin : Perempuan4. Pekerjaan : Mahasiswi5. Alamat Rumah : Karasan Jetis Rt:2 RW:6 Juwiring Klaten6. No. HP : 085647105720

7. Riwayat Pendidikan 1992 - 1994 : TK Pertiwi Kenaiban 1994 1997 : SDN Jetis I Juwiring 1997 2000 : SDN (UNGGULAN) Tanjung II Juwiring 2000 2003 : SMPN 19 Surakarta 2003 - 2006 : SMAN 4 Surakarta 2006 Sekarang : Pend. S1 Fakultas Farmasi UMS

8. Riwayat Organisasi 2002 2003 : PMR Jabatan : Anggota 2003 2004 : PMR Jabatan : Sie Logistik 2006 Sekarang : RMC Jabatan : Anggota Bidang PPSDM

9. Mottto Hidup : Jadikan hidup sebagai hal yang terindah

Daftar Riwayat Hidup

1. Nama : Fairus Zabadi2. Tempat / tgl lahir : Pasuruan, 2 Juli 19883. Jenis Kelamin : Laki-laki4. Pekerjaan : Mahasiswa5. Alamat Rumah : Pegalangan No 35, Maron Probolinggo6. No. HP : 0852369833827. Riwayat Pendidikan


31/124

30

1995 2000 : MI Raudlatul Ulum 2000 2003 : SMPN 1 Gending 2003 2007 : SMF Jember 2007 Sekarang : Pend. S1 Fakultas Farmasi UMS

8. Riwayat Organisasi 2005 : Pramuka Jabatan : Anggota 2007 sekarang : SPC Jabatan : Anggota 2007 sekarang : RMC Jabatan : Anggota

9. Mottto Hidup: Berlarilah untuk mengejar mimpi


32/124

Program Kreativitas Mahasiswa

Judul Program:

Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil Untai Ganda Getah Patah Tulang


Bidang Kegiatan :

PKM Penelitain

Diusulkan oleh :

Nurul Isnaini K 100 060 181

Kendri Sri Yuliati K 100 060 193

Fairus Zabadi K 100 070 134

Universitas Muhammadiyah Surakarta

Surakarta

2008


33/124

1

a. Judul ProgramAktivitas Pemotongan DNA Superkoil Untai Ganda Getah Patah Tulang


b. Latar Belakang MasalahIndonesia dikenal sebagai negara yang memiliki kekayaan hayati

terbesar kedua setelah Brazil. Hutan hujan tropis Indonesia memiliki

sekitar 3000 spesies tumbuhan berbunga (Zuhud dan Haryono, 1994).

Banyak sekali tumbuhan berkhasiat obat di sekitar masyarakat. Ada yang

berupa bumbu dapur, tanaman hias, tanaman sayuran dan tanaman buah.

Selain itu ada pula yang berupa tanaman liar tumbuh di sembarang tempat

tanpa ada yang memperhatikan (Muhlisah, 2003). Keanekaragaman ini

merupakan modal potensial untuk pengembangan obat baru.

Dewasa ini pengetahuan dan pemahaman masyarakat mengenai

tumbuhan berkhasiat semakin berkembang. Masyarakat mulai memahami

bahwa penggunaan tumbuhan untuk obat sebenarnya bisa sejajar dan

saling mengisi dengan pengobatan modern (Kusuma, 2005). Oleh karena

itu sekarang banyak dilakukan penelitian terhadap bahan-bahan alam dan

pengembangan senyawa kimia baru yang ditelusuri dari bahan alam yang

secara empiris digunakan oleh masyarakat dan terbukti memberi khasiat

obat, namun belum diketahui secara pasti kandungan zat aktifnya

(Wijayakusuma, 1993).

Kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian terbesar

di dunia. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menyatakan bahwa setiap

tahun penyakit kanker di dunia bertambah 6,25 juta orang dan dalam tahun

2010 mendatang diperkirakan 9 juta orang meninggal akibat kanker. Di

Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap

100.000 penduduk. Penyakit kanker saat ini menduduki urutan ke-3

penyebab kematian sesudah penyakit jantung dan paru-paru (Sofyan,

2000).


34/124

2

Pengobatan terhadap kanker dapat dilakukan dengan cara

pembedahan, kemoterapi (termasuk imunoterapi dan pemberian hormon),

radioterapi, atau alternatif lain melalui ramuan tradisional dari tanaman

(Sukardiman et al., 2003). Tanaman obat yang berkhasiat mengatasi

beberapa penyakit sudah banyak dibuktikan walaupun baru pada tahap

empiris. Agar peranan obat tradisional dapat lebih ditingkatkan perlu

didorong upaya pengenalan, penelitian, pengujian dan pengembangan

khasiat serta keamanan suatu tumbuhan obat, sehingga keberadaannya

dapat dikenal di kalangan medis (Wijayakusuma, et al., 1995). Obat

tradisional dikatakan rasional, jika terbukti secara ilmiah memberikan

manfaat klinik dalam pencegahan atau pengobatan penyakit dan tidak

menyebabkan efek samping serius dalam arti aman pada manusia

(Dalimartha, 2000)

Tanaman obat telah banyak digunakan untuk pengobatan

penyakit kanker, baik sebagai pencegahan maupun pengobatan. Berbeda

dengan pengobatan kanker menggunakan obat sintetik yang dapat

diberikan sebagai obat utama atau sebagai terapi adjuvant, pengobatan

dengan obat berasal dari tumbuhan dapat pula digunakan untuk

pencegahan. Dalam prakteknya, pengobatan selalu menggunakan terapi

kombinasi dari bermacam-macam tumbuhan obat dengan memperhatikan

efek samping yang mungkin terjadi (Kurnia, 2006). Antikanker diharapkan

dapat memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa

merusak sel jaringan normal (Ganiswara, 2003). Suatu tanaman dapat

dikembangkan sebagai alternatif antikanker dengan mengetahui

keberadaanRibosom Inactivating Proteintanaman tersebut (Sismindari et

al., 2002).

Ribosom Inacivating Proteins (RIPs) merupakan sekelompok


glikosidase (Sismindari et al., 2002). RIP mempunyai kemampuan

memotong DNA superkoil untai ganda, RNA N-glikosidase,


35/124

3

immunosupresive,sitotoksik, abortifacient, antiviral dan anti HIV (Stripe

et al., 1992)

Tanaman Euphorbia tirucalli L. telah secara empiris digunakan

untuk gastritis, tukak rongga hidung, rematik, tulang terasa sakit dan

sifilis. Sedangkan batang kayunya digunakan untuk sakit kulit kusta,

mengeluarkan duri, pecahan kaca, tulang ikan dan benda tajam lainnya

dari kulit tertusuk duri serta kutil (Dalimartha, 2003).

Tanaman patah tulang getahnya mengandung sifat asam (acid

latex), mengandung senyawa euphorbia taraksaterol, -laktucerol, euphol,

senyawa dammar yang menyebabkan rasa tajam ataupun kerusakan pada

selaput lendir, kautschuk (zat karet) dan zat pahit. Sedangkan herba patah

tulang mengandung glikosid, sapogenin, dan asam ellaf (Dalimartha,

2003).

Getah patah tulang bisa digunakan sebagai obat tradisional di

antaranya obat kulit, namun belum pernah dilakukan penelitian yang dapat

membuktikan khasiat getah tanaman ini secara ilmiah. Menurut Morales;

Forero; Roldan (2002) yang telah melakukan penelitian terhadap beberapa

tanaman keluarga Euphorbiaceae, salah satu di antaranya adalah aktivitas

antiviral daunEuphorbia tirucalli, L. terhadap virus herpes simplek type 2

(HSV-2) dengan metode MTT dan EPTT. Dari penelitian ini diketahui

bahwa ekstrak metanol air dari daun patah tulang dapat menghambat

pertumbuhan virus herpes simplek type 2 (HSV-2) dengan sangat

bermakna.

Menurut Ernawati et al.,(2007), membuktikan bahwa getah patah

tulang dapat memberikan aktivitas terhadap virus ND yang diinokulasikan

pada telur ayam berembrio dengan IC50 sebesar 0,05%. Semakin besar

konsentrasi getah patah tulang yang diinokulasikan, semakin besar titer

virus yang disebabkan sifat getah patah tulang yang iritatif.

Ribosom Inavtivating Proteins (RIPs) merupakan suatu protein.

Ekstraksi terhadap protein dari tanamanEuphorbia tirucalli, L. diharapkan

dapat meningkatkan aktivitas pemotongan DNA superkoil untai ganda.


36/124

4

Hal ini dilakukan sejalan dengan pengembangan RIPs sebagai salah satu

bahan obat yang dapat dimanfaatkan untuk antikanker. Untuk itu perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut tentang aktivitas getah Euphorbia

tirucalli, L. dalam memotong DNA superkoil untai ganda.

c. Perumusan MasalahDengan dasar dan pertimbangan di atas maka dapat dirumuskan

suatu permasalahan sebagai berikut :

1. Apakah getah Euphorbia tirucalli L. mempunyai aktivitas pemotonganDNA plasmid pUC 19 dan berpotensi sebagai Ribosom Inactivating

Protein?

2. Berapa konsentrasi getah Euphorbia tirucalli, L. yang dapatmemberikan aktivitas pemotongan DNA terhadap plasmid pUC 19?

d. Tujuan PenelitianPenelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui aktivitas pemotongan DNA getah patah tulang (Euphorbiatirucalli L) terhadap plasmid pUC 19.

2. Mengetahui besarnya konsentrasi minimal getah patah tulang(Euphorbia tirucalli, L.) yang dapat memberikan aktivitas pemotongan

DNA.

e. Luaran Yang DiharapkanLuaran yang diharapkan dengan adanya program Kreativitas

Mahasiswa Penelitian (PKMP) adalah ditemukannya aktivitas pemotongan

DNA oleh getah patah tulang untuk menguji adanya kandungan RIP dalam

tanaman yang dapat berpotensi sebagai antikanker dan dapat menghasilkan

sebuah karya/artikel paten.


37/124

5

f. Kegunaan ProgramApabila terbukti bahwa getah Euphorbia tirucalli, L. mempunyai

aktivitas pemotongan DNA terhadap Plasmid pUC 19 maka tanaman

tersebut dapat diteliti lebih lanjut menjadi salah satu obat antikanker.

g. Tinjauan Pustaka1. Tanaman patah tulang (Euphorbia tirucalli, L)

a. Uraian TanamanPatah tulang berasal dari Afrika tropis. Di Indonesia, ditanam

sebagai tanaman pagar, tanaman hias, di pot, tanaman obat, atau

tumbuhan liar. Patah tulang dapat ditemukan dari dataran rendah

sampai ketinggian 600 m di bawah permukaan laut. Tanaman ini

menyukai tempat terbuka yang terkena cahaya matahari langsung

(Dalimartha, 2003).

Perdu yang tumbuh tegak ini mempunyai tinggi 2-6 m dengan

pangkal berkayu, bercabang banyak dan bergetah seperti susu yang

beracun. Patah tulang mempunyai ranting yang bulat silindris

berbentuk pensil, beralur halus membujur, dan berwarna hijau.

Rantingnya setelah tumbuh sekitar 1 jengkal akan segera bercabang

dua yang letaknya melintang, demikian seterusnya sehingga tampak

seperti percabangan yang terpatah-patah daunnya jarang, terdapat

pada ujung ranting yang masih muda kecil-kecil berbentuk ionset,

panjang 7-25 mm, dan cepat rontok, bunga majemuk, tersusun

seperti mangkuk, warnanya kuning kehijauan, keluar dari ujung

ranting. Jika masak buahnya akan pecah dan melemparkan biji-

bijinya (Dalimartha, 2003).

Jika dibakar, ranting patah tulang yang telah kering dapat

mengusir nyamuk. Getahnya untuk meracuni ikan sehingga mudah

ditangkap. Namun, jika getah patah tulang mengenai mata, bisa

menyebabkan buta. Di Jawa, tanaman ini jarang berbunga.

Perbanyakan dilakukan dengan stek batang (Dalimartha, 2003).


38/124

6

Patah tulang dirawat dengan disiram air yang cukup, dijaga

kelembaban tanahnya dan dipupuk dengan pupuk dasar (Hariana A.

2007)

b. Sistematika dan Klasifikasi TanamanEuphorbia tirucalli, L.

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermayophyta

Divisi : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Rosidae

Ordo : Euphorbiales

Family : Euphorbiaceae

Genus : Euphorbia

Species :Euphorbia tirucalli, L.

c. Kandungan KimiaTanaman Euphorbia tirucalli L. getahnya mengandung sifat

asam (acid latex), mengandung senyawa euphorbia taraksaterol, -

laktucerol, euphol, senyawa dammar yang menyebabkan rasa tajam

ataupun kerusakan pada selaput lendir, kautschuk (zat karet) dan zat

pahit. Herba patah tulang mengandung glikosid, sapogenin, dan asam

ellaf (Dalimartha, 2003).

Patah tulang mempunyai rasa tawar, tetapi semakin lama

menimbulkan rasa tebal di lidah, berbau lemah, dan getahnya

beracun. Beberapa bahan kimia yang terkandung dalam getah patah

tulang diantaranya senyawa euphorbone, taraksasterol, -laktucerol,

euphol, senyawa dammar. Hingga saat ini efek farmakologis patah

tulang belum banyak diketahui (Hariana, 2007).

d. Nama Daerah, Nama Asing, Nama SimplisiaTanaman patah tulang di Indonesia memiliki beberapa nama

daerah seperti patah tulang (Sumatra); susuru (Sunda); kayu urip,


39/124

7

pancing tawa, tikel balung (Jawa), kayu potong (Jawa Timur)

(Hariana, 2007). Kayu jaliso, kayu leso, kayu longtolangan, kayu

tabar (Madura); Lu san hu (Cina); milk bush, finger tree, fotbad plant

tirucalli (Inggris). Nama simplisia Tirucalli Herba (Dalimartha,

2003).

e. Manfaat TanamanTanaman patah tulang secara tradisional digunakan sebagai

obat. Bagian akar dan ranting digunakan untuk pengobatan

gastritis/nyeri lambung, tukak rongga hidung, rematik, tulang terasa

sakit, nyeri saraf, wasir dan siphilis (Dalimartha, 2003).

Bagian batang kayu digunakan untuk sakit kulit, kusta (Marbus

Hansen) dan kaki dan tangan baal. Herbanya dapat digunakan untuk

mengobati bisul, kurap, terkilir, tulang patah, rematik, tahi lalat

membesar dan gatal, cacar ular (Herpes zoster), borok/ulkus karena

frambusia, sakit gigi, radang telinga, dan tertusuk duri atau tulang

ikan, atau dapat juga dicampur dengan susu untuk mengobati

penyakit kulit, seperti gatal-gatal, kurap, tumor, kutil dan hafalan

(alavus) (Dalimartha, 2003). Gilingan halus kulit luar dahan patah

tulang, hasil gilingan ditempelkan pada kulit di atas tulang yang

patah dapat mengobati tulang patah (Hariana, 2007).

2.Ribosom Inactivating Protein(RIP)a. Definisi

Ribosom inactivating Protein (RIP), merupakan sekelompok


glikosidase yang mampu menghambat sintesis protein pada mamalia

(Sismindari, 2004). Aktivitas RNA N-glikosidase yang dapat

mendepurinasi rRNA mamalia dan 28S ribosom bakteri. Sisi

depurinasi terletak pada A4324 dalam mamalia dan 28S ribosom

RNA eukariot atau A2660 dalam 26S rRNA prokariot sehingga

menyebabkan ketidakmampuan untuk mengikat faktor elongasi

2(EF2), akibatnya sel tidak dapat melaksanakan perpanjangan asam


40/124

8

amino pada sintesis protein (Barbieri et al., 1993 cit Sulistyani,

2003).

b. Distribusi RIPs pada tanamanRIPs dapat dibagi dalam dua grup yaitu RIPs tipe I (Holo RIPs)

dan RIPs tipe II (Chimero RIPs). Secara luas RIP terdistribusi pada

tanaman tingkat tinggi (Ling et al., 1994) dan kebanyakan spesies

yang mengandung RIPs dari klas Angiospermae, baik monokotil

maupun dikotil. RIPs dapat dijumpai di berbagai organ dan jaringan

tumbuhan meliputi biji, buah segar, akar, daun, getah, dan batang

(Hartley et al., 1994). Banyak tanaman lain yang menunjukkan

aktivitas menyerupai RIPs hanya saja belum terkarakterisasi

sempurna. RIPs dengan struktur yang mirip dan fungsi yang sama

dapat ditemukan dalam tanaman yang secara taksonomi tidak

membuat ini, meskipun hanya beberapa bagian dari tanaman yang

digunakan memiliki hubungan kekerabatan (Stripe et al., 1992).

Daftar RIPs tipe II tertera secara historis beberapa protein ini

sudah dikenal sebelum diketemukannya. RIPs tipe I, ricin dan abrin

dikenal pada akhir abad ini, meskipun hanya beberapa bagian dari

tanaman yang digunakan untuk pemurnian (Stripe et al., 1992).

c. Aktivitas enzimatikEndonuklease dan co-workers menunjukkan bahwa RIPs

merupakan suatu enzim. Di mana ricin mengenali daerah 28s dari

rRNA membentuk ikatan N-C glikosidik spesifik antara adenin dan

nukleotida. RNA setelah adenin dipindahkan, sisi adenin menjadi

tidak stabil karena reaksi eliminasi setelah digabung dengan asam

anilin. Pemindahan 1 basa adenin mengakibatkan subunit 60s dari

ribosom eukariot tidak mampu berikatan dengan faktor elongasi 2

(EF2) sebagai konsekuensinya sintesis protein terhenti (Stripe et al.,

1992).


41/124

9

d. Aktivitas BiologiAda beberapa aktivitas biologi yang dimiliki oleh RIPs seperti

sitotoksisitas pada mamalia, immunosuppresive, abortifacient,

antiviral, antifungi, antimikroba, pemotongan DNA superkoil untai

ganada serta menghambat replikasi HIV.

1) Aktivitas sitotoksitas pada sel mamaliaEfek secara langsung RIPs tipe I dan II terhadap fungsi dan

struktur sel adalah merusak ribosom secara irreversible lebih

tepat lagi subunit 28s ribosom gagal mengikat faktor elongasi 2,

akibat sintesis protein menjadi terhambat pada sel mamalia RIPs

tipe II mempunyai aktivitas yang lebih tinggi daripada RIPs tipe I

dalam menghambat sintesin protein. Tetapi toksisitas tinggi bila

dikonjugasi pada suatu pembawa sehingga membantu masuknya

rantai A ke dalam sel, rantai A bersifat katalitik. Pembawanya

dapat berupa antibody monoclonal, lektin, hormon atau dengan

menaikkan permiabilitas membran sel sehingga rantai A mudah

masuk ke dalam sel.

Ketoksikan RIPs tipe I lebih rendah daripada RIPs tipe II

karena tidak mempunyai subunit disebabkan konsekuensinya

kemampuan penghalang dan masuk ke dalam sel lebih rendah.

Rantai lektin pada RIPs tipe II dapatmengikat gula dengan

konformasi D-galaktose dan pada ujung resptor galaktosil yang

terdapat pada kebanyakan sel mamlia sehingga sel teraglutinasi

secara in vitro dan toksin dapat memasuki sel tetapi juga

menfasilitasi masuknya rantai A dengan mekanisme yang belum

diketahui terjadi pemasukan melalui perantara resptor endositosis

sehingga RIPs mampu mencapai golgi apparatus dimana ikatan

disulfida di antara kedua sisinya dapat diputus oleh disulfida

oksidoreduktase.


42/124

10

2) Aktivitas immunosupressiveAktivitas RIPs sebagai immunosupressive ditunjukkan bila

RIPs tersebut dikonjugasikan ke molekul sebagai carrier yang

dapat membawa ke populasi sel target spesifik. Antibodi

monoklonal merupakan pilihan terbaik sebagai carrier untuk

membawa konjugat (immunotoksin), tatapi hormon faktor

pertumbuhan dan lektin dapat juga digunakan sebagai carrier.

Ligan toksin dan imunotoksin telah banyak digunakan

untuk memindahkan secara selektif fibroblast yang

terkontaminasi dari kultur sel darah pankreas. Imunotoksin telah

digunakan untuk membasahi sel T secara ex vivo dari tulang

belakang sebelum dilakukan transplantasi prophylaxis dari graft

mico host disease secara in vivo. Penggunaan imunotoksin

memberi harapan terbesar terhadap hasil perawatan pada

pengcangkokan tumor. Imunotoksin telah sukses digunakan

untuk mengobati resisten steroid graft, melawan host penyakit

dengan suatu imunotoksin yang anti T limphosit. Aplikasi lain

dari imunotoksin meliputi perawatan autoimmune, penyakit

thyreopathy, myasthenia gravis dan membunuh parasit.

Imunotoksin dapat ditambahkan secara tidak langsung

dengan menggunakan antibiotik melawan sel antigen senjutnya

ditambahkan ke dalam preparasi imunotoksin dengan antibodi

melawan imunoglobulin G. Mekanisme lain dari perjalanan

toksin ke sel target spesifik menggunakan campuran antibodi

atau fragmen F (antibodi) yang salah satu sisinya berikatan

dengan sel target dan lainnya dengan toksin. Selain ricin

beberapa RIPs tipe I lain yang digunakan sebagai imunotoksin

diantaranya gelonin, PAP, saponin, momordin, bryodin, dan

barley (Stripe et al., 1992).


43/124

11

3) AktivitasAbortifacientTelah ditemukan dalam suatu protein yaitu trikosantin

protein ini memicu aborsi pada mencit, kelinci, dan kera tetapi

tidak pada tikus. Diduga mekanisme abortifacient sebagai

berikut:

a) Menyebabkan nekrosis selektif pada bagian nLi plasenta,b) Terjadi formasi pembekuan pada sirkulasi lokal yang

menginuksi infra pada daerah yang luas,

c) Perubahan yang disertai perusakan aktivitas fungsionaldengan penurunan drastis kadar HCG dan hormon steroid

perubahan metabolisme serta meningkatkan sintesis

prostaglandin yang kemudian menginduksi terjadinya aborsi

(Barbieri et al., 1993).

e. Aktivitas antiviralSemua RIPs tipe I telah terbukti beraktivitas sebaga antivirus

kecuali RIPs tipe II (Kumar dkk, 1993) pada beberapa RIPs yang

telah diketemukan diantaranya diketahui mempunyai aktivitas

antiviral baik pada virus tanaman maupun hewan, antara lain PAP

(Pokeweed Antiviral Protein) dan diantaranya merupakan suatu RIPs

yang mampu menghambat infeksi Tobacco Mozaic Viruspada daun

Nucotiana tobacum (Stripe et al, 1981 cit Barbieri et al, 1993).

Mekanisme antivirus berdasarkan pada

1) RIPs masuk lewat sitosol masuk lewat sitosol sel yang terinfeksikarena lebih permiabel kemudian menghancurkan mesin sintesis

protein sehingga virus tak bisa bereplikasi dan sel yang terinfeksi

saling berdekatan

2) RIPs bertindak secara tidak langsung melalui pengaktivan sistempertahanan tanaman (Willey et al, 2001)

f. Aktivitas pemotongan DNA superkoil untai ganda secara in vivoBeberapa RIPs seperti Ricini (mengandung rantai A) seperti

ditemukan pada : Luffin, cinnamomi dan champhoril yang mampu


44/124

12

mengekpresikan aktivitas enzim untuk memotong DNA superkoil

untai ganda dan khususnya sarcin yaitu suatu RIPs dengan aktivitas

ribonuklease, RIPs dapat memotong DNA superkoil untai ganda

menjadi nick circular pada kadar tinggi, tetapi hal itu tidak berefek

pada DNA linier walaupun RIPs tipe II utuh tidak mengekpresikan

aktivitas RNA N-glikosidase tapi terbukti dapat memotong DNA

superkoil (Ling et al, 1994)

Rantai A cinnamomi dilaporkan dapat membelah DNA

superkoil untai ganda ke linier (Ling et al, 1994) pemecahan molekul

dari DNA superkoil ke linier dengan deadenilasi rantai A cinnamomi

terjadi secara spontan pada ikatan fosfodiester setelah pemindahan

adenin sebagai bagian aktif dari RNA N-Glikosidase kerusakan di

dalam DNA superkoil terletak pada daerah yang kaya akan pasangan

basa AT yang mengarah pada aksi rantai A cinnamomi ikatan

fosfodiester pada daerah superkoil akan menjadi rapuh dan mudah

rusak karena tarikan dari dalam DNA superkoil. Pemecahan satu sisi

purin dalam satu untai dari deadenilasi DNA superkoil akan

menghasilkan bentuk nick dan linier (Ling,1995) menyatakan bahwa

aktivitas dari RIPs ini seperti enzim endonuklease pada 3D sebelah

deoksinukleotida meninggalkan sisi 5fosfat akhir dari DNA

superkoil.

3. PlasmidPlasmid adalah molekul untai ganda ekstra kromosomal dengan

ukuran bervariasi antara 1 kb sampai lebih dari 200 kb ditemukan pada

berbagai spesies bakteri yang dipakai sebagai unit gen untuk melakukan

replikasi (Sambrook et al., 1989). Plasmid membawa tipe gen yang

sangat bervariasi fungsi seperti resisten terhadap antibodi, resisten

terhadap logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau resisten

terhadap bakteriophage kemampuan untuk membentuk membentuk

hubungan simbiosis dan transfer DNA antar kingdom (Feinbaum, 1998)


45/124


46/124

14

4.Escherichia coliEscherichia coli merupakan gram negatif, fakultatif aerob,

tumbuh baik pada media sederhana, berbentuk batang pendek, kadang

berderet seperti rantai biasanya hidup di dalam saluran usus manusia,

hewan sebagai flora normal dan intertin. Escherichia coli dapat

melakukan fermentasi laktosa dan glukosa, serta menghasilkan gas

(Endang, 2003). JenisE. coliDH5 mempunyai aktivitas serupa dengan

JM 103 dan JM 109 yakni -galaktosidase -complementation, yaitu bila

ditumbuhkan dalam medium yang berisi IPTG dan X-GAL jenis ini

mempunyai kemampuan recA1, yakni kemampuan penggabungan ulang

rekombinan, menyusun kembali struktur koloni DNA denagn cara

memasukkan atau menyisipkan (Davis et a.l, 1994).

h. Metode Penelitian1.Definisi Operasional Penelitian

Variabel bebas : konsentrasi getah daun patah tulang

Variabel tergantung : aktivitas pemotongan terhadap DNA superkoil

dari getah patah tulang

2.Bahan dan AlatBahan-bahan yang digunakan :

a. Bahan utama : getah segar dari tanamanEuphorbia tirucalli, L.b. Bahan pelarut untuk getah : aquadestc. Daun pukul empat (Mirabillis jalapaL) jenis bunga warna merahd. E. colligalur DH 5e. Medium Luria Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989)

1) LB cair terdiri dari tripton 1% (b/v), ekstrak yeast 0,5 % (b/v),NaCl 1% (b/v), aquabides sampai volume yang dikehendaki,

ampicilin 50 g/ml.

2) Medium LB padat dapat dibuat dengan penambahan agar oxoid1,5% (b/v)pada LB cair.

f. DNA plasmid pUC 19


47/124

15

g. Bahan isolasi pUC 19 antara lain (Sambrook et al., 1989)1) Larutan lisis I : glukosa 50 mM, Tris Cl 25 mM pH 8,0 dan etilen

diamin tetraasetat 10 mM pH 8,0, aquadest

2) Larutan lisis II : NaOH 0,2 N dan Na dodesil sulfat 1% pH 7,03) Larutan lisis III : kalium asetat 5 mM pH 4,8 60 ml, asam asetat

1,5 ml, aquabidest

4) Larutan TE pH 7,4; tris klorida 10 mM pH 7,4 dan etilendiamintetraasetat 1 mM

5) Larutan pengekstraksi : fenol, kloroform, 0,01 mM triskloridapH 7,5

6) Larutan pengendap dan pencuci : Na asetat, etanol 96%, etanol70 %

h. Larutan CaCl 0,1 Mi. Bahan elektroforesis gel agarose antara lain (Sambrook et al.,1989)

1) Agarose 0,8% (b/v)2) Dapar TBE (1X) : tris borat 0,889 mM dan etilen diamin

tetraasetat (EDTA) 0,2 mM pH 8,0

3) Larutan pewarna : etidium bromide 0,25 g/ml4) Dapar pemuat (loading buffer), silen sianol 0,25%, biru brom

fenol 0,25%, dan gliserol 30%

j. Dapar untuk ekstraksi protein : dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2(NaH2PO4 dan Na2HPO4) yang mengandung NaCl 0,14 M

k. Dapar untuk uji aktivitas pemotongan DNA superkoil, dapar TMN :tris Cl 50 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM dan NaCl 100 mM.

Alat-alat yang digunakan :

Alat-alat gelas, autoklaf (Hiclave H-25), penangas air, sentrifus,

bejana elektroforesis, alat elektroforesis, lampu UV (UV

transiluminator), timbangan analitik, pH meter, vortex, spektrofotometer,

kuvet, mikropipet, tip kuning, tip biru, tip putih, eppendorf, tabung


48/124

16

conical, pembakar bunsen, ose, lemari pendingin, incubator orbital

shaker, foto digital.

3.Rencana Penelitiana. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan dengan mencocokkan keadaan

morfologi tanaman berdasarkan kunci-kunci determinasi

menggunakan literatur untuk memastikan identitas tanaman dan

menghindari kesalahan dalam pengambilan tanaman.

b. Sterilisasi alatAlat-alat yang akan dipergunakan terlebih dahulu dicuci

dengan sabun sampai bersih kemudian dikeringkan menggunakan

serbet bersih. Setelah kering, disterilkan dengan autoklaf selama 20

menit pada 121C.

c. Preparasi Getah Patah TulangGetah patah tulang langsung ditampung dan dibuat seri

konsentrasi. Dibuat beberapa seri konsentrasi yaitu 0.5%; 0,25%;

0,125%; 0,625%; 0,3125%, dengan melarutkan getah dalam

aquadest.

d. Pembuatan Media Luria BertaniMedia Luria Bertani (LB) ditimbang dan dilarutkan dalam

aquadest dengan bantuan pemanasan. Media LB padat dibuat dengan

penambahan agar Oxoid 1,5%, kedua bahan disterilkan dalam

autoklaf pada suhu 121 C selama 20 menit. Antibiotik ampisillin

ditambahkan terakhir secara aseptik dengan konsentrasi akhir

100g/ml.

e. Pengukuran kadar protein ekstrak gubal dengan metodespektrofotometri UV

Kadar protein dalam sampel ekstrak gubal diukur serapannya

dalam dapar Na fosfat 5 mM dengan spektrofotometer UV pada

280 nm dan 260 nm, menggunakan blangko dapar natrium fosfat 5

mM. Kadar protein dihitung dengan rumus :


49/124

17

Kadar protein (mg/ml) = A280x faktor koreksi x faktor pengenceran

(Layne, 1957)

f. Preparasi DNA pUC 191) Pembuatan sel kompetanE. coli

Suspensi E.coli DH 5 sebanyak 100 l ditumbuhkan

dalam 5 ml medium LB cair. Kemudian diinkubasi dalam

incubatororbital shaker24 jam pada suhu 37C. Selanjutnya 1

ml kultur tersebut disubkulturkan kembali dalam 50 ml medium

LB cair dan dinkubasi pada suhu 37C selama 3-4 jam, yaitu saat

mencapai pertengahan fase eksponensial (kepadatan 5 x 106 2 x

107 sel/ml LOD600= 0,6). Kultur yang didapat disentrifus dengan

kecepatan 4000 ribu rpm pada suhu 4C selama 5 menit, lalu

supernatan dibuang, pellet disuspensikan dalam 0,1 M CaCl2

yang telah didinginkan dalam es sebanyak 0,2 x volume kultur

awal. Kemudian diletakkan di atas es selama 5 menit dan segera

disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang

dengan hati-hati. Pellet yang diperoleh dicuci dengan 0,1 M

CaCl2yang telah didinginkan dalam es sebanyak 0,04 x volume

kultur awal dan didiamkan dalam es selama 30 menit (Sambrook

et al.,1989).

2) Transformasi DNA plasmid pUC 19 padaE. coliDH5.Suspensi E. coli kompeten sebanyak 200l dimasukkan

dalam tabung ependorf steril. Selanjutnya diletakkan dalam es

selama 5 menit, lalu ditambahkan DNA plasmid pUC 19

(sejumlah 50 ng dalam volume 10l) pada masing-masing

tabung. Kemudian dicampur isinya dengan menggoyang tabung

secara perlahan-lahan. Selanjutnya didiamkan dalam es selama

30 menit. Setelah itu dilakukan kejutan panas (heat shock)pada

suhu 42C selama 90 detik, tabung tidak digoyang dan segera

dimasukkan kembali ke dalam es selama 1-2 menit, kemudian

ditambahkan 800l medium LB cair. Lalu dicampur perlahan-


50/124

18

lahan dengan membolak-balik tabung 5-10 kali dan diinkubasi

pada 37C selama 45 menit. Suspensi sebanyak 100l ditebarkan

pada medium LB padat yang mengandung antibiotik ampisilin.

Cairan diratakan agar memenuhi seluruh permukaan media,

kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam (Sambrook

et al., 1989).

3) Isolasi DNA plasmid pUC 19.Koloni E. coli yang mengandung plasmid pUC 19

ditumbuhkan dalam 50ml medium LB cair-ampisilin pada suhu

37C 24 jam dalam incubator orbital shaker. Kultur tersebut

dituang ke dalam ependorf steril lalu disentrifuse dengan

kecepatan 12.000 rpm pada suhu 37C selama 10 menit,

kemudian supernatan dibuang. Pelet disuspensikan dalam 100l

buffer lisis I dingin divortek dan dibiarkan di dalam es selama 5

menit. Selanjutnya ditambahkan 200l larutan lisis II dan

dicampur dengan membolak-balikkan tabung 5 kali, lalu

dibiarkan dalam es selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan

150l larutan netralisasi (lisis III), divortek dan dibiarkan dalam

es selama 5 menit. Suspensi disentrifugasi 12.000rpm selama 10

menit. Supernatan diambil dengan mikropipet, dipindahkan

dalam tabung ependorf baru yang steril, selanjutnya supernatan

diekstraksi dengan fenol kloroform sama banyak, divortek dan

disentrifugasi 12.000rpm selama 10 menit. Fase paling atas

dipisahkan dalam tabung ependorf baru dan steril kamudian

ditambahkan natrium asetat 3M sepersepuluh kali volume dan

alkohol absolut dua kali volume, selanjutnya disimpan pada suhu

-20C selama 1 jam. Tahapan dilanjutkan dengan sentrifugasi

pada kecepetan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang

diperoleh dibuang kemudian dicuci dengan 1 ml etanol 70% dan

disentrifugasi 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang

diperoleh dibuang, pelet dikeringkan pada 37C, kemudian


51/124

19

dilarutkan dalam 20l buffer TE 1 kali dan disimpan pada suhu

4C semalam (Sambrook et al.,1989).

g. Uji aktivitas pemotongan DNA superkoil oleh ekstrak gubal.Tiga mikroliter DNA plasmid pUC 19 dicampur dengan 1l

buffer TMN dan diinkubasi dengan ekstrak gubal daun bunga pukul

empat dan getah patah tulang dalam satu seri kadar protein yang

meningkat hingga volume akhir 10l. Kemudian diinkubasi pada

temperatur kamar (30C) selama 1 jam. Pada akhir reaksi

ditambahkan 2l buffer pemuat, kemudian dielektroforesis pada gel

agarosa yang sudah mengandung pewarna etidium bromid,

menggunakan buffer TBE. Elektroforesis dilakukan pada 50 volt

hingga kurang lebih tiga perempat panjang gel. Identifikasi

dilakukan dengan sinar ultraviolet.

Jalannya Penelitian

Gambar 1. Skema Jalannya Penelitian

Pengumpulan getah

patah tulang

Determinasi tanaman

Dibuat seri

konsentrasi

DNA plasmid pUC 19

TransfomasiE.coli

DH 5

Isolasi DNA pIC 19

Uji aktivitas pemotongan

DNA

Elektroforesis DNA

Pengamatan UV

Analisis hasil


52/124

20

i. Teknis AnalisisData-data yang diperoleh dari hasil uji aktiivitas ekstrak getah

dianalisis secara kualititatif yakni:

Aktivitas pemotongan DNA superkoil ditentukan dengan mengamati 3

kriteria yakni: penipisan DNA superkoil, penebalan DNA nick sirkuler,

dan pembentukan DNA linier pada pita DNA hasil elektroforesis di bawah

lampu UV. Uji dikatakan positif apabila pada hasil digesti ekstrak terjadi

pola penipisan DNA superkoil dan penebalan nick sirkuler pada kadar

rendah, sedangkan pada kadar yang lebih tinggi akan muncul pita DNA

linier yang makin menebal.

j. Jadwal KegiatanBulan ke

Kegiatan1 2 3 4 5 6

1. Persiapan

2.Pelaksanaana. Determinasi tanaman

b.Penyiapan alat dan bahanc. Preparasi getahd.Transformasi DNAe. Isolasi DNAf. Uji Aktivitas Pemotongan

DNA

3. Analisis data

4. Penyusunan Laporan

k. Nama dan Biodata Ketua serta Anggota Kelompok1. Ketua Pelaksana Kegiatan

Nama Lengkap : Nurul Isnaini

NIM : K 100 060 181





53/124

21

2. Anggota PelaksanaNama Lengkap : Kendri Sri Yuliati

NIM : K 100 060 193




Nama Lengkap : Fairus Zabadi

NIM : K 100 070 134




l. Nama dan Biodata Dosen Pendamping1. Nama lengkap dan gelar : Peni Indrayudha, S.F., Apt

2. Golongan Pangkat dan NIP : Penata Muda / IIIa, 132313376

3. Jabatan Fungsional : Lektor

4. Jabatan Struktural : -

5. Fakultas / Program Studi : Farmasi / Farmasi

6. Perguruan Tinggi : Universitas Muhammadiyah Surakarta

7. Bidang Keahlian : Bioteknologi Farmasi

8. Waktu untuk Kegitan PKM : 4 jam/minggu


54/124

22

m. Biaya1. Bahan Untuk Preparasi GetahEuphorbia tirucalli, L.

No Jenis Bahan Banyak HargaSatuan

Jumlah

1 TanamanEuphorbia tirucalli 1 35.000 35.000

2 Determinasi Tanaman 50.000 50.000

3 Aqudest 10 L 2.500 25.000

4 Blue Tips 150 500 75.000

5 Yellow Tips 150 500 75.000

6 Speader Glass 1 15.000 15.000

7 Aluminium Foil 1 15.000 15.000

Total 290.000

2. Bahan Untuk Medium Luria BertaniNo Jenis Bahan Banyak Harga Satuan Jumlah

1 Tripton 1% 1 75.000 75.000

2 Ekstrak Yeast 0,5% 1 75.000 75.000

3 NaCl 1% 100 1800 180.000

4 Ampicilin 1 100.000 100.000

5 Aqubides 1L 100 100.000

6 Agar oxoid 1,5% 1 50.000 50.000

7 Cawan Petri 10 20.000 200.000

Total 780.000

3. Bahan untuk Transformasi dan IsolasiNo Jenis Bahan Banyak Harga Satuan Jumlah

1. BakteriE. coli 1 150.000 150.0002. Plasmid pUC 19 50 5.000 250.000

3. Tris Cl 25 mM pH 8,0 100 2.000 200.000

4 Larutan NaOH 100 500 50.000

5 Na dodesil sulfat pH 7,0 100 1.500 150.000

6 Kalium asetat 5 mM pH 4,8 100 2.000 200.000

27 Asam asetat 100 1.000 100.000

8 Larutan TE pH 7,4 100 2.500 250.000

9 EDTA 1mM 200 600 120.00010 Na asetat 100 2.600 260.000

11 Etanol 96 % 1 L 40.000 40.000

12 Etanol 70% 1 L 35.000 35.000

13 Larutan CaCl2 0,2 M 100 1.000 100.000

14 Agarose gel 100 1.200 120.000

15 Gloves 1 pak 40.000 40.000

16 Masker 5 3.000 15.000


55/124

23

17 Dapar TBE 100 2.000 200.000

18 Etidium bromide 100 1.300 130.000

19 Tabung Reaksi 15 5.000 75.000

20 Cawan Petri 15 20.000 300.00021 Ependorf 1 pak 175.000 175.000

22 Erlenmeyer 10 20.000 200.000

Total 3.220.000

4. Biaya Untuk Uji Pemotongan DNANo Jenis Bahan Banyak Harga

Satuan

Jumlah

1. Tris Cl 50 mM 100 1.800 180.0002. MgCl2 10 mM 100 2.000 200.0003.

NaCl 100mM 100 1.800 180.0004. Loading Buffer 1 80.000 80.000

Total 640.000

5. Biaya Penunjang PenelitianNo Jenis Bahan Biaya

1. Biaya Sewa Laboratorium UMS 300.000

2. Pencarian Data 50.000

Total 350.000

6.

Biaya Pembutan LaporanNo Jenis Bahan Jumlah

Satuan

Harga

Satuan

Jumlah

1 Penggandaan 6 10.000 60.000

2 Fotocopy 6 7.500 45.000

3 Penjilidan Soft Cover 6 5.000 30.000

4 Kertas HVS 1 rim 35.000 35.000

5 Catride Refill 1 150.000 150.000

6 CD Blank 1 5.000 5.000

7 Flash Disk 1 Gb 1 90.000 90.000

8 Dokumentasi Hasil 5 56.000 280.000

9 Rental Pangetikan 10 2.500 / jam 25.000Total 720.000


56/124

24

Rekapitulasi Rincian Biaya

1 Bahan Untuk Preparasi GetahEuphorbia tirucalli, L. Rp. 290.0002 Bahan Untuk Medium Luria Bertani Rp. 780.0003 Bahan untuk Transformasi dan Isolasi Rp. 3.220.0004 Biaya Untuk Uji Pemotongan DNA Rp. 640.0005 Biaya Penunjang Penelitian Rp. 350.0006 Biaya Pembutan Laporan Rp. 720.000

Total Rp. 6.000.000


57/124

25

DAFTAR PUSTAKA

Barbieri, L., Batteli, M. G., Stripe, F., 1993, Ribosom-inactivating Protein fromPlants, BiochemBiophy Acta,1154, 681-694.

Brown, T. A., 2003, Pengantar Kloning Gen, diterjemahkan oleh Prasena, 11-15,

Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta.

Dalimartha, S., 2003, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 3. Puspa Swara,

Jakarta, Hal. 89-92.

Davis, L. G., Kuehl, W. M., and Battey, J. F., Basic Methods in Molecular

Biology,Second edition, Applenton and Lange Norwalk, Connecticut.

Feinbaum, R., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley andSons inc, 1.5.1-1.5.17, cit: Dewi Ngolady, 2000, Identifikasi Ribosome

Inactivating Protein dari Ekstrak Gubal Daun Cangkringan (Erythrina

fusca Lour), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

Ganiswara, 2003,Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, 636-701, Bagian Farmakologi

Fakultas Kedokteran, Jakarta.

Hartley, M. R., Chaddoch, A., Bonness, M., S., 1996, The Structure and Function

of Ribosome Inactivating Protein, Trends Plant SCL, Vol.1, No.8, 254-

260.

Kurnia, A., Pertamawati., Rifatul W., Hendig, W., 2005, Efek Penghambat

Pertumbuhan Cell-line Secara In-Vitro dari Ekstrak Etanol Buah

Mahkota Dewa(Phaleria macrocarpa Scheff.).,Artocarpus, Vol 5 (2),

89.

Kusuma, Fauzi, R., Zaky, M., 2005, Tanaman Liar Berkhasiat Obat, Hal. 6,

Andromedia Pustaka, Jakarta.

Ling, J., Liu, W., Wang, T. P., 1994, Cleavage of Supercoil Double Stranded

DNA by Several RIPs in vitro,Febs Letters, Vol. 345, 143-146.

Mulando, 2002, Seputar TeknologiRekayasa Genetika, Pustaka Wira Usaha

Mandiri, Jakarta.

Sambrook, Fritish, E. F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning : a laboratory

Manual, Edisi 1, Hal 1.1.2-1.1.3, Cold Spring Harber Laboratory

Press, USA.


58/124

26

Sismindari, Sudjadi, Sulistyani, N., 2002, Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil

oleh Fraksi Protein Daun Morinda citrifolia, Majalah Farmasi

Indonesia, 13 (4), 174-179.

Stripe, F., Bateli, M. G., Soria, M., Lappi, D. A., 1992, Ribosom-Inactivating

Proteins from Plants Present Status and Future Prospect, Bio

Technology,Vol 10.

Sukardiman, Puspitasari, H.p., Widyawaryanti., 2003, Uji Aktivitas Ekstrak

Metanol Herba Ageratum congzides L pada Kultur Sel Myeloma

Mencit,Majalah Farmasi Airlangga, Vol.3, 93.

Sulistyani, N., 2003, Perbandingan Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil antara

Ekstrak Gubal Umbi dan Daun Bawang Putih (Allium sativum L),

Pharmacon,4 (1), 1-5.

Wijayakusma, H. M.,1993, Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia, Cetakan

Pertama, Jilid II, Pustaka Kartini, Jakarta.

Zuhud, E. A dan Haryanto, 1994. Pelestarian Pemanfaatan Keanekaragaman

Tanaman Obat Hutan Tropika, Jurusan Konversi Sumber Daya Hutan

Fakultas Kehutanan IPB dan Lembaga Alam Tropika Indonesia,

Bogor, Hal. 229-230.


59/124

27

Lampiran

Gambar 2. TanamanEuphorbia tirucalli, L.


60/124

28

n. LampiranDaftar Riwayat Hidup

1.Nama : Nurul Isnaini2. Tempat / tgl lahir : Pekalongan, 9 Maret 19883. Jenis Kelamin : Perempuan4. Pekerjaan : Mahasiswi5. Alamat Rumah : Jl. KH.Samanhudi No.60 RT:03/06 Kelurahan

Pasirsari Pekalongan

6.No. HP : 085647185178

7. Riwayat Pendidikan 1992 - 1993 : TK Masyithoh IX Kergon Pekalongan 1993 1994 : SDN Sapuro IV Pekalongan 1994 1999 : SDN Tirto 0I Pekalongan 1999 2002 : SMPN 2 Pekalongan 2002 2005 : SMUN 3 Pekalongan 2006 Sekarang : Pend. S1 Fakultas Farmasi UMS

8. Riwayat Organisasi 2002 2003 : Pramuka Jabatan : Anggota 2003 2004 : Pramuka Jabatan : Bendahara Bantara 2006 2007 : LPM Natural Jabatan : Anggota Bidang Redaksi 2007 2008 : LPM Natural Jabatan : Sekretaris Umum 2006 Sekarang : RMC Jabatan : Anggota Bidang PPSDM

9. Mottto Hidup : Jangan pernah menyerah untuk meraih mimpidan jalani hidup ini untuk meraih ridho Illahi


61/124


62/124

30

1995 2000 : MI Raudlatul Ulum 2000 2003 :

pkmp 2008 (aktivtas pemotongan dna)

Documents