dna rekombinan dan vektor kloning

7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning

1/21

Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta

tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA

kromosom dan DNA vektor, pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi,

pembentukan molekul DNA rekombinan, dan transformasi sel inang oleh molekul

DNA rekombinan. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasisa

diharapkan mampu menjelaskan!

1. pengertian teknologi DNA rekombinan,

2. dua segi manfaat teknologi DNA rekombinan,

3. tahapan-tahapan kloning gen,

4. pengertian dan cara kerja enzim restriksi, dan

5. garis besar cara seleksi transforman dan seleksi rekombinan.

"engetahuan aal yang diperlukan oleh mahasisa agar dapat mempelajari pokok

bahasan ini dengan lebih baik adalah struktur dan sifat-sifat asam nukleat seperti

yang telah dibahas pada #ab $$.

Pengertian Teknologi DNA Rekombinan

Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan

organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan

untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun %&'(-an

berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam

mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang

bertanggung jaab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.


2/21

)eknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah

yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen

tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan

sebagai kloning gen. #anyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan

pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin

paling representatif, menyebutkan baha teknologi DNA rekombinan adalah

pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul

DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan

mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai

sel inang.

)eknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. "ertama, dengan

mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan

tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. *edua, teknologi ini memungkinkan

diperolehnya produk gen tertentu dalam aktu lebih cepat dan jumlah lebih besar

daripada produksi secara konvensional.

"ada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui

teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu +ambar &.%.

)ahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomikkromosom yang akan diklon,

pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran,

isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan

molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA

rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA

rekombinan.

Isolasi DNA


3/21

$solasi DNA diaali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang

dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-

leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. /angkah berikutnya

adalah lisis sel. #ahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah

diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang

lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton 0-%(( atau

dengan sodium dodesil sulfat +SDS. "ada eukariot langkah ini harus disertai

dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-

remukan sel harus dibuang. #iasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan

sentrifugasi. "rotein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut

organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara

enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan

sel masih tercampur dengan 1NA sehingga perlu ditambahkan 1NAse untuk

membersihkan DNA dari 1NA. 2olekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian

dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan

sentrifugasi kerapatan menggunakan 3s3l +lihat #ab $$.

Gambar 9.1. Skema tahapan kloning gen

)eknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun

DNA vektor, khususnya plasmid. 4ntuk memilih di antara kedua macam molekul

DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. "ertama, plasmid

pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan

mempunyai bentuk covalently closed circular+333, sedangkan DNA kromosom

jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat

tinggi. "erbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap


4/21

denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. 5leh karena itu, aplikasi

kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

"endekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat

pearna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul

DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah

yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian,

perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA

kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat

dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

Enzim Restriksi

)ahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik

maupun plasmid. "erkembangan teknik pemotongan DNA beraal dari saat

ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli,yang

berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda +l. 6irus l digunakan untuk

menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain * dan 3. 7ika l yang telah menginfeksi

strain 3 diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi

strain 3, maka akan diperoleh l progeni +keturunan yang lebih kurang sama

banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini,

dikatakan baha efficiency of plating+85" dari strain 3 ke strain 3 adalah %.

Namun, jika l yang diisolasi dari strain 3 digunakan untuk menginfeksi strain *,

maka nilai 85"-nya hanya %(-9. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak

%%(.((( kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain *

mempunyai nilai 85" sebesar %, baik ketika direinfeksikan pada strain * maupun


5/21

pada strain 3. :al ini terjadi karena adanya sistem restriksimodifikasi +rm pada

strain *.

"ada aktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain 3 diinfeksikan ke strain *, molekul

DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain *.

Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain *

juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa

pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan

(recognition sites)bagi enzim restriksi tersebut.

DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada

siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan

terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diariskan dan harus

dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang

diinfeksikan dari strain * ke strain 3 dan dikembalikan lagi ke strain * akan menjadi

rentan terhadap enzim restriksi.

2etilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.

#erlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga

molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.

8nzim restriksi dari strain * telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim

ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi

tipe I. #anyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies

bakteri lainnya.

"ada tahun %&'( ).7. *elly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan

ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. $a


6/21

mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzaestrain 1d, dan sejak

saat itu ditemukan lebih dari 9'; enzim restriksi tipe $$ dari berbagai spesies dan

strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam

tata kerja rekayasa genetika.

8nzim restriksi tipe $$ antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai

berikut!

%. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di

dalam molekul DNA


7/21

)empat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa

pasang basa. "emotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan

menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung ;> yang runcing karena masing-

masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan

ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung

runcing sering pula disebut sebagai !ng lengket (sticky end) atau !ng

kohesi".

:al itu berbeda dengan enzim restriksi seperti :ae $$$, yang mempunyai tempat

pemotongan DNA pada posisi yang sama. *edua fragmen hasil pemotongannya

akan mempunyai ujung ;> yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya

sama panjangnya. ?ragmen-fragmen DNA dengan !ng tmpl (blunt end)akan

sulit untuk disambungkan. #iasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk

menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul

linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk

menyintesis untai tunggal homopolimerik =>.

#igasi $olekl % molekl DNA

"emotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus

menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen

DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan +diligasi dengan DNA vektor

yang sudah berbentuk linier.

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in

vitro. "ertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. *edua, ligasi

menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coliyang telah diinfeksi dengan bakteriofag


8/21

)9 atau lazim disebut sebagai enzim )9ligase. 7ika cara yang pertama hanya dapat

digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan

baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang

ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase

untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik =>. Dengan untai tunggal semacam

ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi

menggunakan DNA ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya ='@3. Akan tetapi, pada suhu

ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan

menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan

tersebut. 5leh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 9 dan %;@3

dengan aktu inkubasi +reaksi yang diperpanjang +sering kali hingga semalam.

"ada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor,

khususnya plasmid, dapat terjadi peristia religasi atau ligasi sendiri sehingga

plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler

kembali. :al ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. 4ntuk meningkatkan efisiensi

ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan

konsentrasi tinggi +lebih dari %((gml, perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase

untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung ;> pada molekul DNA yang telah

terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim

deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik =>

seperti telah disebutkan di atas.

)ransformasi Sel $nang


9/21

)ahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA

genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut.

menggunakan teknik elektroforesis +lihat #ab 0. 7ika hasil elektroforesis

menunjukkan baha fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik

pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi

ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat.

Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA

rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak

terligasi satu sama lain. )ahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel

inang ini dinamakan trans"ormasikarena sel inang diharapkan akan mengalami

perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

)eknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun %&'( oleh 2. 2andel

dan A. :iga, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi

pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami

seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. *emampuan transformasi B. subtilis

pada aktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof +tidak

dapat tumbuh pada medium minimal menjadi prototrof +dapat tumbuh pada medium

minimal dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. #aru beberapa aktu

kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya

juga dikembangkan pada transformasi E.coli.

:al terpenting yang ditemukan oleh 2andel dan :iga adalah perlakuan kalsium

klorid +3a3l


10/21

?rekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di

dalam larutan 3a3l


11/21

berarti transformasi gagal, +


12/21

#ab ini akan membahas pengertian dan macam-macam vektor kloning, baik yang

digunakan pada sel inang prokariot maupun eukariot. Setelah mempelajari pokok

bahasan di dalam bab ini mahasisa diharapkan mampu menjelaskan!

1. pengertian vektor kloning,

2. ciri-ciri plasmid,

3. ciri-ciri kosmid,

4. ciri-ciri bakteriofag, dan

5. ciri-ciri vektor kloning pada khamir dan eukariot tingkat tinggi.

4ntuk dapat mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini dengan lebih baik

mahasisa disarankan telah memahami pokok bahasan tentang dasar-dasar

teknologi DNA rekombinan dan konstruksi perpustakaan gen, yang masing-masing

telah diberikan pada #ab $0 dan 0.

Pengertian &an $a*am+ma*am ,ektor -loning

"ada #ab $0 antara lain telah dibicarakan baha transformasi sel inang dilakukan

menggunakan perantara vektor. 7adi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi

sebagai ahana atau kendaraan yang akan membaa suatu fragmen DNA masuk

ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen

DNA asing tersebut. 6ektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot,

khususnya 8. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu,

vektor CA3s dan C8ps dapat digunakan pada khamir. "lasmid )i, baculovirus, S69(,


13/21

dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot

tingkat tinggi.

Plasmi&

Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda

di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. "lasmid tersebar luas di

antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar % kb hingga

lebih dari


14/21

pengenalan 8co1 $, salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan,

terletak di luar marker. 5leh karena salah satu marker akan menjadi tempat

penyisipan fragmen DNA asing, maka 8co1 $ tidak dapat digunakan untuk

memotong p#1=


15/21

koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini

dilakukan menggunakan transfer koloni atau replica plating +lihat #ab 0.

"lasmid yang digunakan pada bakteri gram negatif seperti halnya p#1=


16/21

tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. 5leh

karena itu, DNA l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning.

Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi

syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA

l, yaitu

vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing,

vektor substitusi, yang untuk membaa fragmen DNA asing harus membuang

sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan

menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.

Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan

karena kemampuannya untuk membaa fragmen DNA asing hingga


17/21

ambar %%.


18/21

yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar %(( salinan. Salinan-

salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke

permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA 2%= akan terselubungi oleh

membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa

menyebabkan lisis. 5leh karena fag 2%= terselubungi dengan cara pembentukan

kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang

dapat disisipkan kepadanya. $nilah salah satu keuntungan penggunaan 2%= sebagai

vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l. *euntungan lainnya adalah

baha 2%= dapat digunakan untuk sekuensing +penentuan urutan basa DNA dan

mutagenesis tapak terarah +site directed mutagenesis karena untai tunggal DNA

2%= dapat dijadikan cetakan +templat di dalam kedua proses tersebut.

2eskipun demikian, 2%= hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya

yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya

pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat 2%= telah dikonstruksi untuk mengatasi

masalah tersebut.

-osmi&

*osmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA l

dengan plasmid. *emampuannya untuk membaa fragmen DNA sepanjang =

dna rekombinan dan vektor kloning

Documents