latar belakang isolasi dna
Post on 13-Apr-2018
264 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
1/23
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Judul
Teknik Dasar Biologi Molekuler : Isolasi DNA
1.2 Latar Belakang
DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah maser molekul yang mengkode
semua in!ormasi yang dibuuhkan unuk "roses meabolisme dalam seia"
organisme# DNA meru"akan suau maeri geneik yang erbenuk dari dua kelom"ok
basa yang berbeda yang mengandung nirogen$ yaiu "urin dan "irimidin# Dua "urin
yang "aling banyak erda"a "ada DNA adalah adenin dan guanin$ dan "irimidin
umumnya adalah siosin dan imin# %urin dan "irimidin berisi bebera"a ikaan gandayang berhubungan# Molekul yang berisi ikaan ersebu mem"unyai "oensi unuk
hadir dalam se¨ah srukur kimia yang berbeda$ karena aom hidrogennya
mem"unyai kebebasan erenu# ('oodenough# **)#
Isolasi DNA yang digunakan bukanlah DNA genom melainkan DNA
"lasmid$ karena %lasmid memiliki suau kekhususan yaiu mudah disisi"i oleh gen
lainnya dan mam"u bere"likasi bebera"a kali dalam sau kali masa re"likasi$
menyebabkan ¨ahnya da"a berambah dengan sanga ce"a (+,c,e"ano-ski$
.//*)# Dari si!a khas iu$ "lasmid sering diman!aakan unuk men&adi 0ecor suau
gen aau unuk menghasilkan eks"resi gen yang besar$ se"eri "ada "roduksi insulin#
%en&elasan ersebu cuku" mendukung "emilihan DNA "lasmid dalam "ercobaan
dibandingkan DNA genom# Dalam mem"ela&ari DNA enu sa&a idak erle"as dari
adanya suau gen# %ada gen erda"a uruan basa nukleoida yang membenuk ranai
ganda yaiu DNA iu sendiri# (1eece$ ./.)#
Ada dua meode "ada "rakikum Isolasi DNa$ yaiu:
1. boiling: di"anaskan dalam air "anas yang mendidih2. 2ATD: secara kimia-i
3lekro!oresis dilakukan unuk memisahkan$ mengideni!ikasi$ dan "uri!ikasi
dari molekul DNA# 3lekro!oresis meru"akan cara "engamaan DNA dengan
banuan sinar ulra0iole# 2ara "emisahan dengan elekro!oresis inimeru"akan ala
"endukung yang sanga !undamenal dalam eknologi DNA rekombinan#
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
2/23
3lekro!oresis digunakan unuk "engamaan DNA dalam "enam"akan
!louresensinya#
1.3 Tujuan Praktikum
# 4nuk memisahkan DNA dari molekul asam nuklea.# Memahami "rinsi" ker&a dan kegunaan ehnik elekro!oresis5# Memahami cara memisahkan asam6asam nuklea dan molekul "roein
dengan menggunakan "eralaan elekro!oresis
BAB II
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
3/23
KAJIAN TE!I
2.1 I"#la"i DNA
DNA (asam deoksiribonuklea) adalah "olimer asam nuklea yang ersusun
secara sisemais dan yang memba-a in!ormasi geneik dari sel khususnya dan dari
mahluk dalam keseluruhannya dari sau generasi ke generasi berikunya# In!ormasi
geneik ersebu disusun dalam benuk kodon yang beru"a iga "asang basa
nukleoida dan menenukan benuk$ srukur$ mau"un !isiologi suau &asad
(Tri-ibo-o .//7: 7)# DNA memiliki dua !ungsi yang sanga "ening$ yaiu sebagai
auokaalis dan heerokaalis# DNA ber!ungsi sebagai auokaalis karena DNA
mam"u mensinesis dirinya sendiri +edangkan sebagai heerokaalis karena DNA
mam"u mensinesis molekul kimia-i lainnya se"eri 1NA$ "roein dan lain6lain
(8ol!e 7: 9.)#
DNA erdiri dari iga macam molekul$ yaiu gula "enosa$ gugus !os!a dan
basa nirogen# 'ula "enosa memiliki 7 aom 2 dan "ada DNA$ aom 2 nomor .
berikaan dengan aom # 'ugus !os!a "ada DNA berikaan dengan aom 2 nomor 7
melalui ikaan !os!oeser# 'ugus !os!a ersebu yang menyebabkan asam nuklea
bermuaan negai!# Basa nirogen yang menyusun asam nuklea ada dua macam$
yaiu basa "urin yang erdiri dari adenin dan guanin dan basa "irimidin yang erdiri
dari imin dan siosin# Basa "urin aau "irimidin adalah basa nirogen yang erika
"ada aom 2 nomor suau molekul gula melalui ikaan N6glukosidik# Ikaan
ersebu menghasilkan molekul yang disebu nukleosida# Nukleosida akan
bergabung dengan !os!a dan membenuk molekul yang disebu nukleoida
(Tri-ibo-o .//7:.;< +uryo .//7 : 766;.)# Nukleoida adalah +au kom"onen
"embangun (building block) DNA erdiri aas sau gula "enosa$ sau gugus !os!a
dan sau "asang basa (=e-is .//5: 9;669*)#
DNA erda"a dalam sel "rokario mau"un eukario# =okasi yang "aling
banyak mengandung DNA erda"a "ada bagian aki!ias geneik uama sel# +el
"rokario$ aki!ias geneiknya er&adi di seluruh sel sehingga DNA idak mem"unyai
em"a yang s"esi!ik dalam sel# +ebaliknya$ karena aki!ias "ada sel eukario er&adi
di dalam ini$ maka sebagian besar DNA erda"a dalam ini sel# DNA "ada sel
"rokario berbenuk lingkaran dan hanya ada sau uni# >leh karena iu$ "rokariobersi!a mono"loid karena hanya ada sau bahan geneik uama# DNA "ada sel
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
4/23
"rokario &uga idak dikemas dalam srukur yang &elas karena sel "rokario idak
memiliki ini sel (Tri-ibo-o .//7: 9;)# DNA "ada sel eukario berbenuk linear dan
memiliki "roein hison# 4kuran DNA eukario &uga lebih besar dibandingkan DNA
"rokario dan DNA eukario lebih ber0ariasi (1a0en ? @ohnson .//.: )#
+el "rokario memiliki "ula bahan geneik ambahan yang disebu DNA
"lasmid# Dalam keadaan normal$ kehadiran "lasmid "ada umumnya idak
di"erlukan oleh sel# @ika sel "rokario memba-a "lasmid$ maka genom sel ersebu
meli"ui sau kesauan gen yang ada "ada bahan geneik uamanya dan gen yang ada
"ada "lasmid ersebu# (Tri-ibo-o .//7: 9;)#
+el eukario memiliki DNA di dalam kromosom$ yaiu di ini sel dan ada
Bebera"a sel eukario memiliki DNA di luar kromosom$ yaiu DNA "ada
miokondria dan kloro"las# DNA nukleus berbenuk linear dan berasosiasi sanga
era dengan "roein hison$ sedangkan DNA miokondria dan kloro"las berbenuk
sirkular$ re"likasinya berlangsung secara inde"enden dan idak berganung "ada
re"likasi kromosom$ sera idak berasosiasi dengan "roein hison# >rganisasi gen
miokondria lebih miri" organisasi gen "ada bakeri# +elain iu$ DNA miokondria
dan kloro"las memiliki ciri khas$ yaiu hanya me-ariskan si!a6si!a yang berasal
dari garis ibu# al ini sanga berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki "ola
"e-arisan si!a dari kedua orangua (lug ? 2ummings : 57C5;)#
DNA dari sel "rokario mau"un eukario da"a di"eroleh dengan cara
mengisolasi DNA yang erda"a di dalam sel# Isolasi DNA adalah eknik yang
dilakukan unuk memisahkan DNA dari ,a yang lain di dalam sel# ungsi dari
"engisolasian DNA adalah menda"akan DNA murni dari dalam sel yang akandigunakan unuk "enganalisisan genoi" suau organisme (Tri-ibo-o .//7 5.)#
%ada sel eukarioik ermasuk anaman dan he-an bagian erbesar dari DNA
berada "ada nukleus yaiu organel yang di"isahkan dari sio"lasma dengan
membran# Nukleus erdiri dari / E keseluruhan DNA seluler# +isa DNA adalah
organel lain se"eri miokondria dan kloro"las# arena DNA erda"a "ada nukleus$
maka "erlu adanya meode "elisisan sel sam"ai "emanenan sel# Dimana meode
ersebu meru"akan bagian dari meode isolasi DNA (3lrod$ .//9)#
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
5/23
Terda"a organel6organel bermembran ganda di dalam sio"lasma$ ermasuk
miokondria baik "ada umbuhan mau"un he-an# >leh karena iu "erlu dilakukan
isolasi DNA "ada anaman dan he-an unuk mengeahui dan mem"ela&ari DNA dari
anaman dan he-an ersebu# +el eukarioik memiliki DNA lebih banyak$ lengka"
dengan kom"onen6kom"onen lain# DNA anaman dan he-an ersim"an dalam
nucleusyang erbungkus oleh membran# Isolasi DNA meru"akan langkah yang e"a
unuk mem"ela&ari DNA# %rinsi"nya ada dua$ yaiu senri!ugasi dan "resi"iasi#
+enri!ugasi meru"akan eknik unuk memisahkan cam"uran berdasarkan bera
molekul kom"onennya# Molekul yang mem"unyai bera molekul besar akan berada
di bagian ba-ah abung dan molekul ringan akan berada "ada bagian aas abung#
asil senri!ugasi akan menun&ukkan dua macam !raksi yang er"isah$ yaiu
su"ernaan "ada bagian aas dan "ele "ada bagian ba-ah# %resi"iasi meru"akan
langkah yang dilakukan unuk mengenda"kan suau kom"onen dari cam"uran
(Alber$ )#
Ada"un macam F macam meode yang digunakan dalam "roses isolasi
DNA :
# Teknik 1andom Am"li!ied %olymor"hic DNA (1A%D)
Teknik "engu&ian "olimor!isme DNA berdasarkan "ada am"li!ikasi dari
segmen6segmen DNA acak yang menggunakan "rimer unggal yang sekuen
nukleoidanya dienukan secara acak# %rimer unggal ini biasanya berukuran
/ basa# %21 dilakukan "ada suhu anealing yang rendah yang
memungkinkan "rimer menem"el "ada bebera"a lokus "ada DNA# Auran
sederhana unuk "rimer adalah erdiri aas *6.* susunan basa dengan
"ersenase 'G2 7/6;/E (+ubandiyah$.//;)#
.# Meode 2TAB
Menghasilkan "ia DNA yang berukuran ebal dan da"a memisahkan
DNA dari "olisakarida karena adanya "erbedaan karakerisik kelaruan
(di!!erensial o! solubiliy)# Disam"ing de"eroleh !ragmen DNA$ dengan
meode 2TAB &uga akan di"eroleh 1NA dengan "ia i"is yang erleak &auh
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
6/23
berada di ba-ah "ia DNA# eberadaan "ia 1NA erganung bahan yang
dieksraksi (%raseyo$ .//*)#
# %henol:chloro!orm
Mengunakan senya-a %henol6choloro!orm6isoamyl alcohol$ Meode
sandard unuk eksraksi DNA$ Akhir6akhir ini diinggalkan$ karena si!a
oksik "henol#
.# +aling >u
Menggunakan garam konsenrasi inggi (Na2l ; M)$ unuk
medenaurisasi "roein menggunakan %roeinase unuk denaurasi "roein
5# 'uanidine isohiocyanae
Meode ini lebih ce"a dibanding dua meode sebelumnya$ Thiocyanae
bersi!a oksik$ unuk lisis dinding sel$ Memerlukan chloro!orm unuk
denaurasi "roein#
# +ilica 'el
+ilica gel da"a mengika DNA dengan "eranaraan garamHbu!!er erenu
(NaI)$ 2e"a$ ea"i reco0ery DNA kurang (Barnum .//7)#
7# %21 (%olymerase 2hain 1eacion)
Meru"akan suau eknik "erbanyakan (am"li!ikasi) "oongan DNA secara
in 0iro "ada daerah s"esi!ik yang dibaasi oleh dua buah "rimeroligonukleoida# %rimer yang digunakan sebagai "embaas daerah yang
di"erbanyak adalah DNA unai unggal yang uruannya kom"lemen dengan
DNA em"lanya# %roses ersebu miri" dengan "roses re"likasi DNA secara
in 0i0o yang bersi!a semi konser0ai! ('iri$ .//)#
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
7/23
Taha"an "roses Isolasi DNA :
# Taha" Isolasi åan
Taha" "erama ini yang dilakukan adalah mengisolasi åan
yang ingin digunakan#
.# Taha" %elisisan dinding dan membran sel
aiu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara
"enggerusan (homogenasi)$ senri!ugasi dengan kece"aan lebih dari
/#/// r"m aau dengan menggunakan laruan "elisis sel aau bu!!er
eksraksi# Ini sel harus dilisiskan$ karena subsansi gen yang diinginkan
ada didalamnya# %enambahan laruan "elisis sel ini beru&uan unuk
melisiskan sel yang idak mengandung DNA agar sel yang mengandung
ini sel da"a diisolasi aau di"isahkan dari kom"onen6kom"onen sel
lainnya yang idak ber!ungsi#
5# Taha" %engeksraksian dalam laruan
+elan&unya su"ernaan yang erbenuk dibuang dan kemudian
dilakukan eksraksi di dalam laruan# al ersebu beru&uan agar dida"a
eksrak#
# Taha" %uri!ikasi
Taha" ini beru&uan unuk membersihkan hasil eksrak dari ,a6,a
lainnya# %ada laruan ersebu kemudian diberikan 1NAse dan diinkubasi
selama / meni "ada suhu ;7J2# al ersebu beru&uan unuk
mengo"imalkan ker&a en,im yang sanga di"engaruhi oleh em"eraur#
%enambahan 1NAse berguna unuk menyingkirkan konaminasi 1NAsehingga DNA da"a diisolasi secara uuh#
7# %resi"iasi
Taha" erakhir$ yaiu "resi"iasi beru&uan unuk mengenda"kan
"roein hison$ sehingga unai6unai DNA idak lagi menggulung (coiling)
dan berikaan dengan "roein hison$ yang menyebabkan DNA men&adi
erliha# Taha" "resi"iasi dilakukan dengan cara meneeskan laruan"resi"iasi "roein dan kemudian di0orex yang beru&uan unuk
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
8/23
menghomogenkan laruan# =aruan "resi"iasi "roein erdiri aas
amonium asea yang &ika berikaan dengan "roein mengakibakan
erbenuknya senya-a baru dengan kelaruan lebih rendah$ sehingga
menyebabkan "roein mengenda"# =aruan ersebu kemudian
disenri!ugasi kembali selama 7 meni dengan kece"aan 5#/// r"m#
%rinsi" uama senri!ugasi adalah memisahkan subsansi berdasarkan
bera &enis molekul dengan cara memberikan gaya senri!ugal sehingga
subsansi yang lebih bera akan berada di dasar$ sedangkan subsansi yang
lebih ringan akan erleak di aas ( au,iah$ .//)
'ambar # Taha"an %roses Isolasi DNA
2.2 Elektr#$#re"i"
asil isolasi DNA yang dida"a idak da"a dikeahui secara langsung
menggunakan maa elan&ang$ sehingga di"erlukan adanya analisis erhada" "roduk
%21 ersebu menggunakan suau meode$ yakni meode elekro!oresis#
3lekro!oresis meru"akan meode sandar unuk analisis$ ideni!ikasi$ dan "uri!ikasi
!ragmen DNA dalam berbagai %21# 3lekro!oresis adalah eknik "emisahan
kom"onen aau molekul bermuaan berdasarkan "erbedaan ingka migrasinya dalam
sebuah medan lisrik#
3lekro!oresis "ada dasarnya beker&a berdasarkan migrasi aau "er"indahan
"arikel6"arikel bermuaan dalam lingkungan yang memiliki medan lisrik dan
kemudian er"isahkan oleh gel elekro!oresis em"anya ber"indah# +eluruh molekul
aau !ragmen DNA bermuaan negai!$ sehingga !ragmen DNA akan bergerak
menu&u kuub "osii! (anoda) dengan "er"indahan yang sama dalam medan lisrik#
ragmen DNA kemudian er"isahkan berdasarkan kemam"uan "ergerakannya dalammariks gel# Molekul DNA berukuran besar akan mengalami kesulian unuk
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
9/23
mele-ai "ori6"ori gel agarosa$ sedangkan molekul DNA berukuran kecil akan lebih
mudah mele-ai "ori6"ori gel ersebu# >leh sebab iu maka mobilias molekul DNA
dalam gel agarosa "ada konsenrasi gel yang sama akan berbeda berganung "ada
ukuran molekul aau !ragmen DNA sam"el#
Meode elekro!oresis yang banyak digunakan unuk menganalisis molekul
DNA adalah elekro!oresis horisonal menggunakan gel agarosa# onsenrasi gel
agarosa yang digunakan unuk elekro!oresis harus disesuaikan dengan "an&ang
am"licon yang dihara"kan# %engauran ka"ilarias gel elekro!oresis akan
meningkakan resolusi analisis hasil %21 secara signi!ikan$ dan hal ini menyebabkan
er&adinya "emisahan molekul DNA berdasar ukuran molekul secara sem"urna# asil
elekro!oresis DNA da"a dianalisis seelah melalui "e-arnaan menggunakan"e-arna DNA$ "e-arna DNA yang "aling banyak digunakan adalah ehidium
bromida# ragmen DNA yang elah di-arnai ersebu keika diamai diba-ah sinar
ulra0iole akan erliha sebagai "ia6"ia dalam gel elekro!oresis ber-arna oranye6
merah yang ber"endar#
Ala dan bahan besera !ungsi yang digunakan dalam aha"an elekro!oresis
adalah :
# Bu!!er elekro!oresis yang erdiri dari TA3$ memiliki daya ion dalam
laruan sebagai "engahanar lisrik.# =oading dye$ ber!ungsi unuk "embera agar idak keluar dari sumuran5# 3adium bromida$ sebagai "e-arna DNA yang akan menyisi" didalam gel
agarosa# 4K ransiluminaor$ unuk 0isualisasi "e-arna DNA dalam gel agarosa#7# ALuades$ sebagai "elaru#;# Baki agarosa$ sebagai ceakan gel agarosa9# TA3 (Trisbase)$ sebagai bu!!er sesuai "#*# Asam asea 'lasial$ sebagai elekroli garam## 3DTA (3ylen Diamine Tera Aseic Acid) sebagai "e6non aki! DNA#/# +isir elekro!oresis$ unuk membua sumuran "ada gel agarosa## Tangki elekro!oresis$ unuk angki DNA#.# Mikro"i"e$ unuk mengambil dan menghomogenkan sam"el DNA
dengan =oading dye#
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
10/23
'ambar #5 Ala 3lekro!oresis 'el Agarosa
(+enrabd$ ./.)
%embuaan 'el Agarose# /$ gram bubuk agarose dilarukan "ada 7/ ml Bu!!er TA3$
dengan cara di"anaskan$ diamkan "ada suhu 7/J2#.# 2eakan gel agarose di"asang "ada angki elekro!oresis#5# =aruan agarose diuangkan "ada angki elekro!oresis dan
didinginkan hingga mengeras## +eelah gel mengeras$ ceakan gel agarose da"a diambil$ dan gel
agarose sia" digunakan# 3lekro!oresis
# 'el agarose direndam dengan Bu!!er TA3#.# l loading dye dicam"ur dengan 5l "roduk DNA "ada "ara!ilm
yang elah ersedia dengan banuan mikro"i"e#5# 2am"uran ersebu dimasukan kedalam sumur "ada gel agarose## Tangki elekro!oresis kemudian diuu" dan dihubungkan ke
"o-er su""ly# Dokumenasi
# 'el agarose hasil elekro!oresis direndam dalam laruan 3Br
selama 7Meni#
.# Dilan&ukan dengan direndam dalam akuades selama 7 meni#5# emuadian gel agarose di0isualisasi dengan menggunakan 4K
ransiluminaor$ dan didokumenasikan
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
11/23
'ambar # asil Kisualisasi 'el Agarose menggunakan 4K Transiluminaor
(Biomed$ ./)
BAB III
%ETDE PENELITIAN
3.1 Jeni" Praktikum
%rakikum biologi molekuler mengenai isolasi DNA ini menggunakan meode
boiling$ dimana meode boiling ini menggunakan "emanasan aau em"eraure yang
digunakannya#
3.2 &aktu dan Tem'at
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
12/23
ari$ anggal : +elasa6amis$ 6 ebruari ./;
8aku : 5#//6;#// 8IB
Tem"a: =aboraorium 1ise %MI%A B 4%I
3.3 Alat dan Ba(an
Tabel 3.3.1. Alat
N#
.
Nama Alat Jumla(
# Tabung Mikro 7 buah.# 8aerbah buah5# +enri!uge buah# Korex buah7# ree,er buah;# Mikro"i"e buah9# @arum >se buah*# Ti"s +e"erlunya Tabung u0e . buah
/# +"ekro!oomeri buah# Micro-a0e buah.# Tray buah5# +haker buah
# Kisualisasi +inar 4K buah7# +arung Tangan non "o-der +e"erlunya
Tabel 3.3.2. Bahan
N#
.
Nama Ba(an Jumla(
# =aruan %B+ ml.# T3 x ;// l5# ALuabides +ecuku"nya# oloni Bakeri loo"7# Agarosa +ecuku"nya;# 3Br /$/. E +ecuku"nya9# Alkohol +ecuku"nya*# dd.> +ecuku"nya# eras %ara!ilm +ecuku"nya
/# =oading Dye +ecuku"nya# ALuades +ecuku"nya
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
13/23
3.) *ara Kerja
Diagram alur 3.4.1 Isolasi DNA
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
14/23
Bakeri dikulurdalam media "ada=A selama sekiar
; &am
loo" bakeridari medium agar
dimasukkan kedalam abung
mikro
Tabung mikroyang sudah berisiml %B+ dan
loo" bakeridihomogenkan
+us"ensidisenri!ugasi
selama 5 menidengan kece"aan
7/// r"m
+u"ernaan yangerbenukkemudiandibuang
%ellediambahkanbu!!er T3 x
sebanyak // Nldan di0orex
Tabung mikrodi"anaskan di
aas air mendidih(/6//o2)
selama / meni
Disenri!ugasi
selama 5 menidengan kece"aan7/// r"m
=ysa yang
erbenuk diambilsebanyak //Nl
Di"indahkan kedalam abung $7
ml yang baru
Diambahkanbu!!er T3 x
dingin sebanyak7//Nl
Disim"an dalam
!ree,er dengan suhu
6./>2
Tabung ku0ediserilkan dengan
alkohol6aLuabides6alkohol
Bagian sam"ing abungku0e dibersihkan
menggunakan keraskhusus "embersih ku0e
+am"el dimasukkan kedalam abung ku0e
Absorbansi sam"eldienukan dengan
s"ekrogoomeer "ada.;/6.*/ nm
Tabung ku0e yangelah erisi sam"el
dimasukkan ke dalams"ekro!oomeri
Dari hasil yangdida"akan dihiung
konsenrasi DNA dankemurniaanya
Diagram alur 3.4.2 Spektrofotometer
Diagram alur E.4.3 Elektroforesis
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
15/23
%ada aha" "ersia"andibuuhkan -aku
selama 76 97 meni
Agarosa danTA3HTB3
dicam"urkan
:omogenkan dimicro-a0e selama
($7 meni laludiunggu hingga
dingin
+eelah dinginmasukkan ke Tray
lalu diunggu selama7 meni hingga
erbenuk agarosa
%ada aha" runningdibuuhkan -aku
5/6;/ meni
=oading dyedieeskan "adakeras "ara!ilm
sebanyak ¨ah (7ees
Diambahkandengan sam"el dariseia" kelom"oknyalalu dihomogekan
dengan cara "i"eing
+eelah homogendimasukkan ke
dalam agar yangelah dibua
"roses runningber&alan selama 5.meni "ada */6(//
0ol
%ada aha""e-arnaanH0isualisasi
dibuuhkan -aku(/65/ meni
Agar direndam "ada3Br /$/. E selama
7 meni dan disim"an diaas shaker
1endam "adaaLuades selama (/6
(7 meni
Kisualisasi sinar 4K
BAB I+
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
16/23
HA,IL DAN PE%BAHA,AN
Dalam "rakikum kali ini kami melakukan Isolasi DNA genom dari isola M$
dan isola ># Teknik ini meru"akan eknik manual$ arinya bah-a eknik yang
digunakan hanya sebaas unuk mengeahui keberadaan DNA murni$ dan
kuaniasnya sa&a# Tidak sam"ai "ada "roses am"li!ikasi se"eri eknik %21 sehingga
dida"akan hasil eksrasi DNA# DNA isolasi dari kedua isola ini kemudian di analisa
secara kuaniai! erlebih dahulu dengan menggunakan s"ekro!oomeer yang
hasilnya meru"akan angka6angka ( quantity )# Meoda s"ekro!oomeri ini
meru"akan meoda dimana hasilnya akan menun&ukan ingka kemurnian dan
konsenrasi DNA# Menga"a s"ekro!oomeri da"a menun&ukan ingka kemurnian
dan konsenrasi dari suau DNAO arena basa nirogen dari DNA da"a menyera"
sinar 4K$ semakin inggi konsenrasi DNA dalam laruan$ maka sinar 4K akan
semakin ersera"# Biasanya "engukuran konsenrasi ini didasarkan "ada "engukuran
absorbansi# %embacaan absorbansi dilakukan "ada A.;/ dimana absorbansi .;/ ini
DNA akan menyera" cahaya yang "aling kua# 1umus konsenrasi DNA:
P DNA Q R A.;/ x akor %engenceran x 7/
A.;/ meru"akan absorbansi "an&ang gelombang DNA "ada .;/ m$
sedangkan !akor "engenceran disesuaikan dengan "engenceran yang kami lakukan$
karenasample yang kami ambil sebanyak nl$ diambah dengan ml aquabidest
maka "engencerannya adalah 7// kali$ dan menuruDr. Ir. Maftuchah, M.P., Dr. Ir.
Aris Winaya dalam bukuAnalisis !eknik Dasar "iologi Molekuler
#$ merupakan konstanta dari hubungan %.$ & #$ g untai
ganda D'A murni.(
+edangkan unuk rasio kemurnian DNA$ dida"akan dengan membandingkan
Absorbansi .;/ dengan Absorbansi .*/# +e"eri yang elah di"a"arkan sebelumnya$
"ada absorbansi .;/ ini DNA akan menyera" cahaya yang "aling kua$ sedangkan
"ada absorbansi .*/$ biasanya digunakan unuk mengukur adanya konaminan lain#
Maka dari iulah$ "erbandingan rasio Absorbansi .;/ dengan Absorbansi .*/
digunakan unuk menda"akan hasil DNA murni# Beriku adalah rumus unukmenda"akan ingka kemurnian DNA:
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
17/23
Purity=A260
A280
Beriku adalah hasil "engukuran konsenrasi dan kemurnian DNA dengan
s"ekro!oomeri mengguakan sinar 4K dari ; kelom"ok:
Ta-el 1. Ha"il Pengamatan ,'ektr#$#t#metri
Kel#m'#k I"#lat A2/ A20/ DNA
mgml
urit!
A2/A20/
"ragmen
DNA
1% /$//. /$//5 7/ /$;9
6 /$//. /$//5 7/ /$;9
2% /$// /$//; ..7 $7
S /$// /$//* .7/ $.7
3% /$/*; /$/97 .7/ $ 6 /$// /$/** .7// $5
)% /$/9 /$//5 .7 $*;
6 /$/*9 /$/9 .97 $/
4% /$/ /$/*/ ..97 $5
6 /$ /$/5 .997 $
% /$/7 /$/*. .597 $;
6 /$ /$/7 .997 $;
Dari abel diaas$ kia da"a mengeahui bah-a hasil konsenrasi DNA
kelom"ok 5 dan 7 memiliki konsenrasi yang "aling inggi dianara kelom"ok lain
yakni .997 mgHml dan .7// mgHml# Namun hasil 0isualisasi gel agarose
menggunakan sinar 4K$ hasil isolasi DNA kelom"ok 5 dan 7 idak menun&ukan
erbenuknya !ragmen DNA$ hal ersebu &ika dikaikan dengan nilai kemurnian yang
dida"akan kelom"ok ersebu kecil yaiu $ dan $5 "ada isola > dan
kemungkinan masih erda"a konainan lain se"eri "roein# +esuai dengan eori
menuru ambrook dan *ussel +$$%) dalam -inasih Prayuni $$$ bah-a:
/asil isolasi D'A genom memiliki tingkat kemurnian yang baik 0ika
angkanya berkisar pada %, 1 ,$. 2ika 3%, maka itu menun0ukan adanya
kontaminasi dari protein. 2ika 4,$ maka itu meun0ukan adanya kontaminasi
*'A.
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
18/23
Berbeda dengan hasil konsenrasi yang dimiliki oleh kelom"ok dan $
konsenrasinya "aling rendah dibanding dengan em"a kelom"ok lainnya yaiu 7/
mgHml dan .7 mgHml dengan kemurnian masing6masing /$;9 dan $*;# Dan
keberadaan !ragmen DNAnya sama6sama idak erliha &uga sama se"eri kelom"ok
$ 5$ $ 7$ dan ;# Ini bisa er&adi karena adanya !akor human error, kesalahan er&adi
keika sedang mengisolasi DNA$ salah saunya keika "engambilan bakeri aau
isola dari dalam =aminar mengunakan >se. %engambilan isola kurang banyak
sehingga mengakibakan konsenrasi DNA erlalu sediki$ selain iu$ keika seelah di
lakukan +enri!ugasi$ dan melakukan "embuangan su"ernaan$ se"erinya "elenya
iku erbuang keika diambil aau disedo oleh micropipet# Bahkan keika "erama
kali akan melkukan "rakikum$ kurangnya si!a steril yang dimiliki oleh "rakikan$
yang menyebabkan adanya konaminan "ada ala aau bahan yang akan di isolasi#+elain hal ersebu$ aha" homgenisasi yang kece"aannya idak konsan bahkan
erlalu kencang$ yang menyebabkan rusaknya DNA# Maka dari kesalahan6kesalahan
ersebu da"a disim"ulkan bah-a sebagian besar hasil Isolasi DNAnya dinyaakan
idak berhasil#
Terda"a hal yang menarik yang da"a kia ulas dari abel di aas# ia da"a
meliha hasil "engukuran yang dilakukan oleh kelom"ok . dan # Dari hasil
konsenrasi DNAnya$ masing6masing memiliki konsenrasi ..7mgHml dan .7mgHml
dengan kemurnian masing6masing adalah $7 dan $*;# @ika dikaikan dengan eori
eori sebelumnya menuru +ambrook$ dan eori lainnya$ maka kelom"ok memiliki
ingka konsenrasi dan kemurnian yang sanga baik$ maka seharusnya !ragmen DNA
bisa erliha# Ta"i kenyaaannya$ &usru hasil dari kelom"ok . lah yang !ragmen DNA
nya erliha# Menuru kami$ ini er&adi karena adanya !akor human error&uga$ da"a
dibukikan dengan adanya hasil kemurnian "ada kelom"ok dengan ingka
kemurnian yang sama yaiu /$;9 "ada isola M mau"un > nya# Iu dilakukan dengan
kali kalibrasi dengan menggunakan blanko# Ta"i "ada saa kelom"ok selan&unya
melakukan s"ekro$ dilakukan kalibrasi ulang a"i hasil kalibrasi "ada ala idak
menun&ukan angka nol# @adi da"a di"asikan hail s"ekro!oomeri selan&unya
kurang 0alid karena idak dilakukannya kali kalibrasi sa&a#
+elan&unya !ragmen DNA$ dalam abel di aas$ hanya kelom"ok . yang
erliha !argmen6!ragmen DNA nya$ dan kelom"ok lainnya idak erliha# arenamemang sebelumnya hasil isolasi DNAnya idak berhasil# ragmen DNA meru"akan
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
19/23
hasil 0isualisasi yang berasal dari analisis kualiai! hasil isolasi DNA# asil ini
berasal dari eknik 3lekro!oresis# elekro!oresis ini memiliki !ungsi unuk
mengeahui keberadaan DNA ersebu$ dengan menggunakan gel agarose$ yang hasil
akhirnya gel agarose ersebu di-arnai menggunakan 3Br ( 3dium Bromide )#
3dium bromide adalah suau molekul yang da"a mendeeksi DNA dengan cara
molekul ini disisi"kan dianara basa !ragmen double helix DNA dan diika oleh basa
nirogen dari DNA ersebu$ yang kemudian memanulkan cahaya diba-ah sinar 4K#
@ika dengan sinar lainnya edium bromide akan rusak$ maka dari iu "roses ini
dilakukan di ruang gela"# %enggunaan sinar 4K ini &uga mem"ermudah unuk
meliha !ragmen DNA yang kecil agar da"a didokumenasikan dan !ragmen DNA
yang erbenuk da"a di0isualisasikan# +elain iu$ gel agarose yang kami gunakan
adalah berkisar anara E 6 .E sa&a# arena semakin "eka kosenrasi gel agarose
maka akan semakin mem"ersuli "ergerakan aau la&u dari molekul DNA# Ini sesuai
dengan eori yang disam"aikan olehDa5is, dkk + %667 %# ) bah-a dalam "roses
eleko!oresis erda"a bebera"a !akor yang mem"engaruhi la&u "ergerakan dari
molekul DNA$ salah saunya adalah konsenrasi gel# Da5is, dkk + %667 %# )
mengaakan:
emakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuatsehingga sukar untuk dile8ati molekul9molekul D'A. -onsentrasi agarosa
yang lebih tinggi memudahkan pemisahan D'A yang berukuran kecil,
konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan D'A dengan
ukuran yang lebih besar.
Beriku adalah hasil "engamaan elekro!oresis yang kami lakukan:
5am-ar 1. Ha"il Elektr#$#re"i" menggunakan ,inar6U+
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
20/23
Transiluminaor (Dokumenasi %ribadi$ ./;)
R onrol$ R ulky
Berdasarkan gambar di aas$ maka da"a disim"ulkan bah-a hanya konrol
dan !ragmen dari DNA kelom"ok . yang da"a erliha# ragmen DNA yang idak
da"a erbenuk dalam gel agarose mungkin er&adi karena adanya kesalahan6
kesalahan yang elah di&elaskan sebelumnya# Aau memang karena konsenrasi
DNAnya erlalu kecil# eika konsenrasi DNA yang dida"akan dari analisis
kuaniai! +"ekro!oomeri erlalu kecil$ erkadang idak akan erbaca oleh hasil
analisis kualiai! berdasarkan 3lekro!oresis# ang kemudian erbuki "ada bebera"a
kelom"ok yang idak erliha !ragmen DNAnya raa6raa mereka memiliki
konsenrasi DNA yang sanga rendah# Maka da"a kami sim"ulkan$ erda"a
hubungan anara keiga "roses "rakikum yang kami lakukan$ keika Isolasi DNA
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
21/23
idak berhasil$ "asi hasilnya akan mem"engaruhi salah sau analisis nya$ bisa
kuaniai! aau kualiai!# @ika diambil conoh$ keika konsenrasi aau kemurniannya
erlalu rendah$ maka analisis kualiai! idak akan er0isualisasikan# Dikarenakan
3br yang erika oleh basa nirogen menyebabkan "ia "ia idak da"a
er0isualisasikan#
DA7TA! PU,TAKA
-
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
22/23
Albers$ B#$ Bray$ @# =# dan 1o!!$ M# # %#le8ular Bi#l#g9 #$ T(e *ell# 'arland
%ubkishing: Ne- ork#
2am"bell$ A# N#$ @# B# 1eece ? =# '# Michell# .//.# "iologi. 3d#ke67 &ilid # er&
dari"iology.7h ed$ oleh =esari$ 1# 3rlangga# @akara: xxi G 5* hlm#
2am"bell$ A# N#$ @# B# 1eece ? =# '# Michell# .//5#"iologi. 3d#ke67 &ilid .# er&
dari"iology.7h ed$ oleh =esari$ 1# 3rlangga# @akara: xxii G / hlm#
2am"bell$ N#$ e al# .//9 Biology : 3igh 3diion# 2ali!ornia : %earson
2heng$ =#$ hang D# # .//*# Molecular 'eneic %ahology# Ne- @ersey : umana
%ress
Da0is$ =#$ M# uehl$ ? @# Baey# #"asic methods Molecular biology# .nd
ed# A""leon ? =ange$ Nor-ola P Diakses : ebruari ./; Q
Dr# Ir# Ma!uchah$ M#%#$ Dr# Ir# Aris 8inaya dalam Analisis Teknik Dasar Biologi
Molekuler# P>nlineQ Tersedia: h"s:HHbooks#google#co#idHbooksO
idRMr!+2UAAUBA@?"gR%A;7?l"gR%A;7?dLRabsorbansiG.;/Gadal
ah?sourceRbl?osRAui&k7?sigRdoA;-ULD1uxe,2g;D=
y>%k?hlRen?saRV?0edR/ah43-&g72hL0=AhV3naDh
IU;A3IMDA2W0Rone"age?LRabsorbansiE./.;/E./adalah?!R!alse
P Diakses : ebruari ./; Q
lug$ 8# +# ? M# 1# 2ummings# # :oncept of genetics. h ed# %renice all$
Ne- @ersey: ix G 995 hlm#
=e-is$ 1# .//5# /uman genetics :oncepts and applications# The Mc'ra-6ills
2om"any$ Inc#$ Boson: x0iii G 7 hlm#
1a0en$ %## ? '#B# @ohnson# .//.#"iology# ;h ed# Mc'ra-6ill
1eece$ @# B#$ e al# ./.# 2am"bell Biology 2once" and 2onnecions : 2once" and
2onnecion# 2ali!ornia : %earson
+ambrook dan 1ussell (.//: A*#./6A*#.) dalam %rayuni inarsih# .//*# IsolasiDNA 'enom %adi (;rynlineQ Tersedia :
h":HHlib#ui#ac#idH!ileO!ileRdigialH..;6BI>#//6/*6IsolasiE./dan6
Analisis#"d!P Diakses : ebruari ./; Q
+ans!ield$ 8# D dan +# =# 3lrod#$ .//9# +chaumXs >ulines Teori dan +oal6+oal
'eneika$ 3disi eem"a# Ter&emahan Damaring Tyas 8# dan A# +a!iri#
%enerbi 3rlangga$ @akara#
https://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttp://lib.ui.ac.id/file?file=digital/124126-BIO.010-08-Isolasi%20dan-Analisis.pdfhttp://lib.ui.ac.id/file?file=digital/124126-BIO.010-08-Isolasi%20dan-Analisis.pdfhttp://lib.ui.ac.id/file?file=digital/124126-BIO.010-08-Isolasi%20dan-Analisis.pdfhttp://lib.ui.ac.id/file?file=digital/124126-BIO.010-08-Isolasi%20dan-Analisis.pdfhttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=falsehttps://books.google.co.id/books?id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adalah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DLyOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDhIQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=false -
7/24/2019 Latar Belakang Isolasi DNA
23/23
+ubandiyah$ +# .//;# %olymerase 2hain 1eacion unuk Deeksi aau Ideni!ikasi
%aogen Tumbuhan# Bebera"a Meode 3ksraksi DNA# %elaihan dan
8orksho" Ideni!ikasi DNA dengan A"likasi %21# Malang# hlm# 567
+uryo$ # .//7. =enetika strata %# h# 3d# 'ad&ah mada 4ni0ersiy %ress$
ogyakara: x0i G 5 hlm#
Tri-ibo-o$ # .//7#"iologi Molekular# 3rlangga$ @akara: xiii G .; hlm#
4ni0ersiy o! 4ah# .//7# DNA 3xracion !rom 8hea 'erm.(O): 5 hlm#
8ol!e$ +# =# 5#Molecular and cellular biology. 8ods-orh
top related