laporan praktikum isolasi dna plasmid pet-32b(+) dan amplifikasi gen phor

7/25/2019 Laporan Praktikum Isolasi DNA Plasmid pET-32b(+) dan Amplifikasi Gen phoR

http://slidepdf.com/reader/full/laporan-praktikum-isolasi-dna-plasmid-pet-32b-dan-amplifikasi-gen-phor 1/24

LAPORAN GENETIKA (BI-2105)

ISOLASI DNA PLASMID pET-32b(+) DAN AMPLIFIKASIGEN phoR

Tanggal Praktikum : 30 Oktober 2015 – 13 November 2015

Tanggal Pengumpulan : 20 November 2015

disusun oleh :

Dhia Shofi S

10614032

Kelompok 9

Asisten :

Annisa Rizkia 10613016

Muh. Agung Saputra 10613040

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

BANDUNG

2015



BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isolasi DNA merupakan proses pemurnian DNA dari sampel

menggunakan kombinasi metode fisik dan kimiawi. Tujuan dilakukannya

isolasi DNA adalah untuk mendapatkan DNA yang benar-benar murni

untuk kemudian dilakukan investigasi lebih lanjut. DNA sendiri

merupakan materi genetik yang diwariskan dan bersifat spesifik pada

setiap individu dan dapat diaplikasikan pada kepentingan identifikasi

pelaku kejadian (kepentingan forensik), identifikasi penyakit, dan

penyisipan gene of interest untuk diamplifikasi (Dahm, 2008).

Salah satu DNA yang banyak digunakan untuk kepentingan ini

adalah DNA plasmid pada bakteri. DNA genom tidak digunakan untuk

proses amplifikasi dengan mesin PCR karena ukuran DNA genom lebih

besar dibanding DNA Plasmid. Selain itu, DNA plasmid juga bersifat

independen yang artinya bisa menduplikasi dirinya sendiri terlepas dari

kegiatan DNA genom. Selain itu, DNA plasmid lebih mudah ditransfer

dengan proses transformasi yang memungkinkan penyisipan gen ke

organisme lain seperti ke tanaman karena berukuran lebih kecil (Lipps,

2008).

Amplifikasi gen merupakan metode perbanyakan suatu gen dengan

cara polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi gen dengan metode

PCR bekerja spesifik yang bisa segera mengenali daerah sampel DNA

yang terkena translokasi. Amplifikasi gen dilakukan untuk menganalisis

suatu sampel gen dengan jumlah yang sangat sedikit. Amplifikasi gen

dapat digunakan untuk mengetahui agen penginfeksi dan diskriminasi

strain patogen dan non-patogen, diagnosis awal penyakit malignant seperti



leukemia dan limfoma, perbanyakan gen yang diinginkan, serta untuk

mengidentifikasi sampel DNA berumur ribuan tahun.

Elektroforesis adalah perpindahan materi dari katoda menuju anoda

didalam daerah elektrik. Faktor-faktor yang mempengaruhi perpindahan

partikel saat elektroforesis adalah ukuran DNA, konformasi DNA,

konsentrasi gel, dan jumlah muatan diberikan. Elektroforesis dilakukan

untuk memisahkan DNA dan protein. Contoh aplikasi dari elektroforesis

adalah untuk mengidentifikasi korban dan pelaku berdasarkan hasil band

DNA, melihat kecocokan DNA orang sehat dengan yang mengalami

mutasi. Selain itu, elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui

apakah gene of interest yang diisolasi berhasil diamplifikasi atau tidak

(Robyt & White, 1990).

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah :

1. Mengisolasi DNA plasmid pET 32 dengan metode alkali lisis

2. Mengamplifikasi Gen phoR dari DNA plasmid pET 32 yang diisolasi

dengan metode PCR

1. A1.



BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Plasmid

Plasmid merupakan molekul DNA kecil di dalam sel yang secara fisik

terpisah dari DNA kromosom dan bisa bereplikasi secara independen. Plasmid

biasanya ditemukan pada bakteri sebagai bentuk yang kecil, sirkular, double

stranded. Plasmid juga kadang ditemukan pada archaea dan organisme

eukariot. Plasmid bisa memiliki panjang dari 1 hingga 1000 kbp (Lederberg,

1952).

Plasmid digunakan sebagai vektor perbanyakan/ekspresi suatu gen. Gen

yang akan diamplifikasi disisipkan ke dalam plasmid. Setelah itu, plasmid

dimasukkan ke dalam bakteri melalui proses transformasi dan bakteri dikultur.

Selain untuk mengekspresikan gen tertentu, plasmid juga digunakan untuk

membuat protein dalam jumlah besar (Lederberg, 1952).

Perbedaan DNA plasmid dengan DNA genom ada pada ukuran, bentuk,

organisasi konformasi, dan kandungan yang dibawa. DNA plasmid memiliki

ukuran sekitar 1-1000 kbp, sementara DNA genom memiliki panjang 160-

12.200 kbp pada prokaryot. DNA plasmid berbentuk sirkular, sementara DNA

genom berbentuk linear pada eukaryot, namun bisa sirkular pada bakteri.

Organisasi dari DNA plasmid kebanyakan memiliki organisasi konformasi

supercoiled , sedangkan DNA genom memiliki organisasi konformasi

melingkar di sekitar histon. DNA genom mengandung informasi penting bagi

kehidupan organisme, sementara DNA plasmid mengandung informasi

tambahan bagi organisme tersebut (Tranbichler & Shapiro, 2006).

Pada percobaan isolasi DNA digunakan DNA plasmid pET-32b(+). DNA

plasmid pET-32b(+) memiliki panjang 5899 bp. Vektor ini memiliki peta

seperti pada gambar 2.1.



Gambar 2.1 Peta DNA Plasmid pET-32b(+) (LaVallie, et al., 1993)

Vektor ini memiliki beberapa sequence landmarks, yaitu T7 promoter

764-780 bp, T7 transcription start 763 bp, Trx•Tag coding sequence 366-692

bp, His•Tag coding sequence 327-344 bp, S•Tag coding sequence 249-293

bp, Multiple cloning sites, ( Nco I - Xho I) 158-217 bp, His•Tag coding

sequence 140-157 bp, T7 terminator 26-72 bp, lacI coding sequence 1171-

2250 bp, pBR322 origin 3684 bp, bla coding sequence 4445-5302 bp, f1

origin 5434-5889 bp (LaVallie, et al., 1993).

DNA Plasmid bisa muncul dalam bentuk - bentuk tertentu yang disebut

konformasi. Ada 5 tipe konformasi pada DNA plasmid yakni:

1.

Nicked open-circular DNA yang memiliki satu strand yang dipotong

(Kroll, et al., 2010)



2. Relaxed circular DNA yang memiliki bentuk sirkular utuh, tidak terpotong

sama sekali kedua strandnya, namun telah direlaksasi secara enzimatik

(tidak supercoiled ) (Kroll, et al., 2010)

3. Linear DNA yang memiliki ujung bebas, bisa jadi karena kedua strand

telah dipotong atau karena DNA linear in vivo (Kroll, et al., 2010)

4.

Supercoiled (covalently closed-circular ) dimana DNA memiliki kedua

strand yang tidak terpotong sama sekali dengan pilinan yang terintegrasi,

yang menghasilkan bentuk yang kompak (Kroll, et al., 2010)

5. Supercoiled denatured DNA, memiliki bentuk seperti supercoiled namun

memiliki area yang tidak berpasangan yang membuatnya jadi kurang

kompak yang bisa jadi terjadi karena suasana yang terlalu basa saat

preparasi plasmid (Kroll, et al., 2010)

Gambar 2.2 Konformasi Plasmid (Focosi, 2014)



2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction )

Polymerase Chain Reaction atau PCR merupakan suatu teknik untuk

mengamplifikasi satu atau beberapa copy dari sebuah DNA dengan prinsip

thermal cycling (Bartlett & Stirling, 2003). Thermal cycling merupakan siklus

pengulangan pemanasan dan pendinginan untuk reaksi pelelehan DNA dan

replikasi enzimatik DNA. Prinsip kerjanya adalah DNA dipanaskan atau

didinginkan pada temperature tertentu yang merupakan temperature efektif

untuk setiap proses enzimatiknya. Proses enzimatik itu terdiri dari beberapa

tahapan yakni: inisiasi, denaturasi, annealing, ekstensi, dan penyimpanan.

Tahap denaturasi, annealing, dan ekstensi dilakukan secara berulang kali

dalam suatu siklus dimana 1 siklus = elongasi + denaturasi + annealing +

elongasi sehingga dengan demikian jumlah gen yang akan diamplifikasi

meningkat berdasar deret eksponensial 2n dengan n merupakan jumlah siklus

(Logan, et al., 2009)

Gambar 2.3 Siklus PCR dengan Suhu Optimum (Viljoen, et al., 2005)



2.3 Elektroforesis

Elektroforesis merupakan metode pemisahan partikel-partikel bermuatan

di dalam medan listrik yang homogen. Pada elektroforesis terdapat beberapa

komponen yakni chamber elektroforesis, sumber tegangan, gel, dan materi

yang akan dielektroforesis (protein, RNA, DNA). Materi yang akan

dielektroforesis seperti DNA ditaruh pada well di gel elektroforesis (agarosa /

polyacrilamide gel) yang berada dalam chamber berisi buffer. Kemudian

chamber dihubungkan dengan sumber tegangan. Prinsip kerja dari

elektroforesis ini adalah sumber tegangan akan menghasilkan suatu medan

listrik homogen, di dalam medan listrik ini, DNA akan mengalami gaya gerak

listrik (ggl) karena muatan yang dimilikinya dan tempatnya yang berada di

dalam medan listrik. DNA akan bergerak ke arah kutub medan yang memiliki

muatan berlawanan dengannya (Robyt & White, 1990).

Elektroforesis bisa memisahkan partikel-partikel karena perbedaan

kecepatan partikel tersebut dalam menempuh matriks elektroforesis (gel). Ada

beberapa hal yang dapat mempengaruhi kecepatan suatu partikel menempuhgel elektroforesis yakni:

a. Ukuran DNA

Ukuran DNA menentukan kecepatan pergerakan pada gel. Molekul

DNA yang lebih besar akan lebih tertahan pada gel, sementara molekul

yang lebih kecil lebih tidak tertahan sehingga akan menempuh gel lebih

cepat (Lucotte & Baneyx, 1993).

b. Konformasi DNA

DNA yang memiliki konformasi supercoiled akan bergerak lebih

cepat daripada DNA relaxed. Hal ini dapat terjadi karena DNA

supercoiled tergulung secara ketat sehingga lebih kompak dan

memudahkan untuk bergerak lebih cepat (Lucotte & Baneyx, 1993).

c.

Konsentrasi gel

Konsentrasi gel menentukan ukuran pori gel yang mempengaruhi

migrasi DNA. Jika konsentrasi gel semakin besar, pori pada gel akan



semakin kecil sehingga lebih menahan DNA dan mengurangi kecepatan

migrasinya. Agarose dengan konsentrasi tinggi baik untuk memisahkan

partikel DNA kecil, sementara agarose dengan konsentrasi tinggi untuk

memisahkan DNA berukuran besar (Lucotte & Baneyx, 1993).

d. Medan listrik yang diberikan

Pada voltase rendah, migrasi DNA proporsional dengan besarnya

tegangan yang diberikan, yakni semakin besar tegangan, semakin cepat

DNA bergerak. Namun, pada medan listrik yang meningkat, mobilitas

fragmen DNA berat akan meningkat secara diferensial, dan keefektifan

pemisahan menuruh dan resolusinya kemudian lebih rendah pada voltase

tinggi (Lucotte & Baneyx, 1993).



BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA, PCR, dan

elektroforesis terdapat dalam Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Alat dan bahan praktikum isolasi DNA, PCR, dan elektroforesis

Alat Bahan

Mikropipet Kultur Bakteru E. coli

Alat Sentrifugasi Microtube

Alat Vortex Tips

Timbangan analitik (ketelitian minimal

0.001 gram)Larutan I, II, dan III

Mesin PCR Et-OH 95%

Tabung Eppendorf Et-OH 70%Alat Pemanas TE Buffer/Air Deion

Alat Elektroforesis Horizontal DNA Hasil Isolasi

Sumber Arus PCR Mix

Primer

Agarosa

Buffer TAE

Etidium Bromida

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Isolasi DNA Plasmid

Kultur bakteri E.coli diambil sebanyak 1000 µL dengan mikropipet.

Kemudian kultur dimasukkan ke dalam microtube 1.5 mL. Setelah itu

microtube disentrifugasi dengan kecepatan maksimum selama 1 menit. Dari

hasil sentrifugasi akan didapatkan supernatan dan pellet. Bagian supernatant



dibuang kemudian pellet dikeringkan. Setelah itu, pelet ditambahkan 200 µl

solution I. Setelah itu microtube divortex, lalu ditambahkan 200 µL solution

II. Micortube kemudian dibolak-balik hingga larutan homogen. Setelah itu

ditambahkan 150 µL solution III dan dibolak-balik lagi hingga larutan

homogen. Berikutnya microtube kembali disentrifuga dengan kecepatan

maksimum selama 5 menit. Didapatkan kembali pellet dan supernatan dari

hasil sentrifuga. Supernatan hasil sentrifuga dipisahkan ke dalam microtube

baru. Setelah itu supernatan ditambahkan ethanol absolut bervolume dua kali

lebih banyak dengan volume larutan plasmid, kemudian divortex dan

didiamkan dua menit. Kemudian microtube disentrifugasi dengan kecepatan

maksimum selama 15 menit pada suhu ruang. Kembali didapatkan supernatan

dan pellet. Supernatan dibuang dan pellet ditambahkan 0.5 mL alkohol 70%

kemudian dibolak-balik hingga homogen dan disentrifugasi lagi dengan

kecepatan maksimum selama 5 menit pada suhu ruang. Setelah itu kembali

didapatkan supernatan dan pellet. Supernatan dibuang sementara pellet

disimpan sampai alkohol menguap. Setelah itu pellet ditambahkan 30 µL

nuclease free water kemudian divortex dan diinkubasi pada temperatur -20oC.

3.2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction )

Mula-mula DNA target diambil sebanyak 1 µL. Kemudian dimasukkan ke

dalam microtube dan diencerkan dengan air deion sampai total larutan 25 µL.

Setelah itu larutan ditambahkan PCR mix sebanyak 10 µL. Lalu larutan

dihomogenisasi dan kemudian disentrifuga. Setelah itu, microtube

dimasukkan ke dalam mesin PCR kemudian didenaturasi awal pada suhu 95 oC

selama 5 menit. Setelah itu DNA memasuki siklus denaturasi pada suhu 95 oC

selama 30 detik, annealing pada suhu 65oC selama 30 detik, dan pemanjangan

primer pada suhu 72oC selama 7 menit 45 detik. Siklus dilakukan sebanyak

25x.

3.2.3 Elektroforesis

Agarosa dicampurkan dengan buffer TAE dengan volume sama dengan

agarosa hingga konsentrasi akhir 0.3%. Setelah itu agarosa dididihkan di atas

pemanas kemudian didinginkan. Selanjutnya campuran agarosa ini dituangkan



pada cetakan gel yang telah diletakkan comb di atasnya. Kemudian agarosa

didiamkan hingga mengeras. Sebelum mendingin, ditambahkan etidium

bromide kedalam agarosa. Setelah agarosa mengeras, comb dilepaskan dari

cetakan gel. Setelah itu cetakan gel diletakkan pada tangki elektroforesis.

Selanjutnya tangki elektroforesis ditambahkan buffer TAE sampai 1 mm di

atas gel. Kemudian, DNA target diambil sebanyak 10 µL kemudian diletakkan

pada parafilm dengan mikropipet. Setelah itu, loading buffer diambil dengan

mikropipet sebanyak 2 µL kemudian diletakkan di parafilm tepat di atas DNA

target yang diambil. Selanjutnya kedua larutan diresuspensi dengan cara

menarik dan mengeluarkan kembali kedua cairan dengan mikropipet hingga

homogen. Setelah larutan homogen, larutan dimasukkan ke dalam well

agarosa pada tangki elektroforesis dengan mikropipet. Setelah itu, tangki

elektroforesis dihubungkan dengan generator 100V dan DNA dielektroforesis

selama + 25 menit. Selanjutnya, generator dimatikan dan pencetak gel

dikeluarkan dari tangki elektroforesis. Terakhir, hasil elektroforesis gen dapat

dilihat di bawah sinar UV.



BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil pengamatan untuk isolasi DNA plasmid pET-32b(+) ditunjukkan

pada gambar 4.1. Untuk hasil elektroforesis gen phoR yang telah di-PCR

ditunjukkan pada gambar 4.2.

Gambar 4.1 Hasil Foto Elektroforesis DNA Plasmid pET-32b(+) (dokumentasi pribadi,

2015)

Gambar 4.2 Hasil Foto Elektroforesis Amplifikasi Gen phoR (dokumentasi pribadi,

2015)

Kel 9

Kelompok 9



Gambar 4.3 Ukuran DNA Ladder 1 kb

4.2 Pembahasan

4.2.1 Metode Isolasi dengan Alkali Lisis

Dalam percobaan kali ini, digunakan metode alkali lisis untuk mengisolasi

DNA plasmid. Metode alkali lisis adalah metode pemisahan menggunakan

tiga larutan, yaitu larutan I, II, dan III yang masing-masing memiliki fungsi di

tiap tahap penambahan. Metode alkali lisis meliputi beberapa tahapan sebagai

berikut:

1. Sentrifugasi

Kultur bakteri yang telah dipanen dimasukkan ke dalam microtube kemudian

disentrifugasi. Dari hasil sentrifugasi akan didapatkan bagian pellet (bagian

padat) dan supernatan (bagian cair). Bagian pellet merupakan sel bakteri yang

akan diisolasi plasmidnya, sementara bagian supernatan adalah media tumbuh



bakteri tersebut. Supernatan dibuang sementara bagian pelletnya diambil agar

tersisa bagian sel bakterinya saja (Oswald, 2014).

2. Resuspensi

Pada tahap ini, pellet hasil sentrifugasi diresuspensi dengan larutan I yang

berisi Tris, EDTA, glukosa, dan RNase A. Fungsi dari EDTA adalah untuk

menangkap kation divalent seperti Mg2+ dan Ca2+ yang berfungsi dalam

aktivitas DNase dan mengintegrasikan sel bakteri. Dengan adanya EDTA,

aktivitas DNase untuk menghancurkan plasmid dapat dihambat serta dinding

sel diganggu kestabilannya. Glukosa berfungsi untuk menjaga tekanan

osmotik sehingga sel tidak meledak. Tris atau lengkapnya

tris(hydroxymethyl)aminomethane merupakan buffer pH dengan rumus

molekul (HOCH2)3CNH2. Tris memiliki pKa 8.07 pada suhu 25oC dan

memiliki range pH efektif antara 7.07 dan 9.07. Sementara RNase A berfungsi

untuk mendegradasi RNA tepat setelah sel lisis. Setelah itu, pellet divortex.

Tujuan dari proses ini adalah untuk menghomogenisasi pellet dengan larutan I

(Oswald, 2014).

3. Lisis

Pada tahap ini, ditambahkan larutan II ke dalam pellet. Larutan II berisi

basa natrium hidroksida (NaOH) dan detergent natrium dodecyl sulfat (SDS).

SDS berfungsi untuk melarutkan membran sel serta mendenaturasi protein-

protein dalam sel yang berfungsi kemudian untuk pemisahan protein dengan

DNA. Sementara itu, NaOH berfungsi untuk menghancurkan dinding sel,

namun fungsi utamanya adalah untuk mengganggu ikatan hidrogen diantara

basa-basa nitrogen DNA sehingga mengubah DNA double stranded menjadi

DNA single stranded. Setelah itu, microtube dibolak-balik untuk dibuat

homogen. Pada tahap ini, untuk menghomogenisasi larutan tidak digunakan

metode vortex karena jika microtube diguncang terlalu kuat, maka DNA

kromosomal yang sudah berada di luar sel bisa terpecah menjadi fragmen-

fragmen kecil sehingga bisa mengkontaminasi hasil plasmid (Oswald, 2014).



4. Netralisasi

Pada tahap ini larutan ditambahkan larutan III yang berisi potassium

(kalium) asetat (CH3COOK). Tujuan dari penambahan larutan II ini adalah

untuk mengurangi alkalinitas dari larutan karena potassium asetat bersifat

asam dalam air. Dalam kondisi ini, hubungan antara basa-basa DNA single

stranded bisa terbentuk kembali sehingga ssDNA bisa berenaturasi menjadi

dsDNA. Bagian ini merupakan bagian yang selektif. DNA plasmid akan

mudah untuk merenaturasi karena ukurannya yang kecil, sementara DNA

kromosomal akan sulit terenaturasi karena ukurannya yang sangat besar. Pada

bagian ini untuk menghomogenisasi tidak boleh digunakan metode vortex,

sehingga microtube hanya dibolak-balik saja secara manual. Tujuannya adalah

untuk mencegah putusnya DNA kromosomal menjadi fragmen-fragmen kecil

yang bisa terenaturasi. Selain berfungsi untuk mengasamkan larutan, K + dalam

potassium asetat berfungsi untuk menangkap ion dodecyl sulphate pada

larutan (Oswald, 2014).

dsPlasmid mudah larut dalam larutan, sementara DNA kromosomal, SDS,

protein terdenaturasi akan berinteraksi secara hidrofobik membentuk endapan.

Untuk mempermudah terbentuknya endapan, dilakukan sentrifugasi pada

larutan. Hasilnya adalah supernatan yang mengandung DNA genom dan pellet

yang mengandung DNA kromosom, SDS, dan protein terdenaturasi. Setelah

itu, supernatant dipisah dengan pellet dan diambil supernatannya (Oswald,

2014).

5. Pencucian

Bagian supernatant yang telah didapat dari proses netralisasi masih belum

mengandung DNA plasmid saja, tetapi masih mengandung garam-garam,

EDTA, RNase dan protein residual selular sehingga masih perlu dibersihkan.

Cara pembersihannya yaitu pertama-tama supernatan hasil sentrifugasi

ditambahkan isopropanol. Tujuan dari tahapan ini adalah untuk melarutkan

protein-protein sisa yang bersifat nonpolar, sementara DNA yang bersifat

polar akan tertinggal di bawah. Setelah itu, diinkubasi pada suhu -80oC,

tujuannya adalah untuk mempercepat reaksi isopropanol dengan campuran.



Setelah itu, campuran disentrifugasi untuk mempercepat pemisahan DNA

dengan protein-protein sisa tersebut. Selanjutnya DNA dibersihkan dengan

etanol yang teruji efektif meningkatkan konsentrasi DNA dari 0.1 menjadi 0.5

M. Etanol mengubah struktur DNA sehingga molekul DNA beragregasi dan

mengendap dari larutan, sementara itu molekul-molekul organik dan garam-

garam terlarut pada etanol sehingga tetap berada pada fasa cair. Campuran ini

bisa dipisahkan dengan cara sentrifugasi dimana kemudian terdapat

supernatan dan pellet. Pellet inilah yang mengandung DNA sementara

supernatan hanya mengandung molekul-molekul organik lain dan garam-

garam. Pellet dipisahkan dengan supernatan (Oswald, 2014).

6. Penyimpanan

Pellet DNA yang telah didapatkan disentrifugasi quick spin pada tahap ini.

Tujuan dilakukan quick spin adalah untuk mengeringkan DNA. DNA yang

telah benar-benar kering kemudian dicampurkan dengan larutan TE pH 8.0.

TE atau tris-EDTA merupakan buffer pH yang komposisinya terdiri dari

10mM tris pH 8.0 dengan HCl, dan 1mM EDTA. Menurut penelitian, pada pH

8.0 ini DNA menjadi kurang aktif, sehingga pH ini efektif untuk penyimpanan

DNA. SEmentara itu EDTA berfungsi untuk mengikat kation metal seperti

magnesium dan kalsium yang mungkin masih tertinggal di larutan untuk

mencegah aktivitas enzimatis. Setelah itu, larutan disimpan pada temperatur -

20oC dengan tujuan untuk mengurangi aktivitas DNA sehingga DNA tidak

terdegradasi dan lebih tahan lama (Oswald, 2014).

Pada hasil percobaan, hasil elektroforesis isolasi DNA Plasmid pET-

32b(+) menyatakan bahwa DNA Plasmid berhasil diisolasi. Tetapi, panjang

dari DNA Plasmid pET-32b(+) tidak dapat dibaca karena tidak adanya gene

ladder yang dapat dijadikan acuan pembacaan panjang DNA. Dari literatur,

panjang dari DNA Plasmid pET-32b(+) adalah 5899 bp (LaVallie, et al.,

1993). Terlihat pula dari gambar, panjang dari DNA yang dielektroforesis

tidak sepanjang kelompok lain. Hal ini bisa disebabkan saat DNA dipipet,

DNA tidak seluruhnya terambil karena jumlahnya yang sangat sedikit. Saat

DNA ditaruh pada gel bisa saja masih terdapat DNA yang tertinggal pada tips



mikropipet ataupun gel tidak seluruhnya masuk ke dalam well namun ada

yang terlepas ke larutan buffer karena kurang berhati-hati dalam prosedur.

4.2.2 Amplifikasi PCR

Pada percobaan PCR digunakan beberapa reagen sebagai berikut beserta

fungsinya:

1. DNA target

DNA target merupakan DNA yang mengandung area yang akan

diamplifikasi atau dengan kata lain rantai DNA yang mengandung gene of

interest (Stock, et al., 2009).

2. Primer

Primer merupakan rantai nukleotida yang berfungsi sebagai starting point

untuk sintesis DNA yang komplemen dengan ujung 3’ dari sense dan

antisense DNA target. Primer digunakan untuk replikasi DNA sebab enzyme

yang mengkatalisis proses ini, DNA polymerase hanya bisa menambahkan

nukleotida baru pada strand DNA yang telah ada. Polymerase memulai

replikasi pada ujung 3’ dari primer. Primer yang digunakan untuk amplifikasi

gen biasanya memiliki panjang tidak lebih dari 30 nukleotida dan memiliki

ujung yang sama dari awal dan akhir fragmen DNA yang akan diamplifikasi

(Stock, et al., 2009).

3. Dream Taq polymerase

Dream Taq polymerase adalah DNA polymerase yang termostabil yang

diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus. Thermus aquaticus merupakan

bakteri yang hidup di air panas dan pintu-pintu hidrotermal sehingga DNA

polymerasenya tahan terhadap denaturasi pada suhu tinggi. DNA polymerase

ini digunakan untuk menambahkan nukleotida pada rantai DNA yang akan

direplikasi. Temperatur optimum untuk Taq ini adalah 75-80oC dan bisa

mereplikasi 1000 bp DNA dalam waktu kurang dari 10 detik pada temperatur

72oC (Chien, et al., 1976).



4. dNTPs (deoxy-Nucleotide Tri-Phospates)

dNTPs merupakan suatu molekul yang mengandung suatu nukleosida

yang terikat pada 3 fosfat. Nukleosida merupakan suatu kompleks gula

pentose yang terikat pada satu basa nitrogen. Gula pentosa pada dNTPS

merupakan gula deoxyribosa yang merupakan gula ribosa yang kehilangan 1

atom oksigennya. dNTPs terdiri atas dATP (deoxyadenosine triphospate),

dTTP (deoxytimine triphopate), dGTP (deoxyguanine triphospate), dan dCTP

(deoxycytocine triphospate). dNTPs ini berfungsi sebagai building blocks

dalam replikasi DNA. dNTPs akan direkatkan ke ujung 3’ primer oleh DNA

polymerase dan saat proses tersebut berlangsung, dNTPs akan kehilangan 2

gugus fosfatnya (Alberts, et al., 2002).

5. Larutan buffer

Larutan buffer merupakan larutan yang mengandung campuran dari asam

lemah dan basa konjugasinya atau basa lemah dan asam konjugasinya. Larutan

buffer akan bergeser sangat sedikit pHnya ketika sejumlah asam atau basa

kuat ditambahkan ke dalamnya sehingga digunakan untuk mencegah

perubahan pH pada larutan. Larutan buffer digunakan untuk menjaga pH pada

suatu nilai yang hampir konstan. Pada percobaan digunakan tris-HCl yang

memiliki pKa 8.06 dan memiliki buffer range 7.5-9.0, pH larutan = 8.0

(Oswald, 2014).

6. MgCl2

Magnesium klorida (MgCl2) adalah suatu garam yang akan terurai menjadi

ion magnesium (Mg2+) dan ion klorida (Cl-) dalam air. Ion magnesium

berfungsi sebagai kofaktor enzim DNA polymerase (Oswald, 2014).

Pada amplifikasi gen, dilakukan tahapan-tahapan tertentu dalam suatu

siklus yang dinamakan siklus termal. Siklus termal untuk PCR terdiri dari

beberapa tahapan yakni:

1. Tahap inisiasi

Tahap ini diatur pada temperatur 94-96oC atau 98oC jika polymerase yang

sangat termostabil digunakan selama 1-9 menit (Logan, et al., 2009).



2. Tahap denaturasi

Tahap ini merupakan tahap siklus pertama yang terjadi pada temperatur

94-98oC selama 20-30 detik. Pada tahap ini terjadi DNA melting dimana

template DNA diganggu ikatan hidrogennya sehingga menghasilkan DNA

single stranded (Logan, et al., 2009).

3. Tahap annealing

Tahap ini terjadi pada temperatur 50-65oC selama 20-40 detik. Pada tahap

ini terjadi penempelan primer pada ssDNA template. Tahap annealing harus

berada pada temperatur yang cukup rendah untuk memungkinan hibridisasi

primer pada strand DNA, namun cukup tinggi agar hibridisasi bisa berjalan

secara spesifik, yakni primer hanya menempel pada area template yang

komplemen dengan primer. Jika temperatur terlalu rendah, primer tidak dapat

menempel dengan sempurna, namun jika terlalu tinggi, primer tidak dapat

menempel sama sekali. Biasanya temperatur untuk proses annealing adalah

sekitar 3-5oC dibawah titik leleh primer yang digunakan (Logan, et al., 2009).

4. Tahap ekstensi / elongasi

Temperatur tahap ini bergantung pada DNA polymerase yang digunakan,

Taq polymerase memiliki aktivitas optimum pada temperatur 75-80oC dan

biasanya temperatur yang digunakan adalah 72oC. Pada tahap ini, DNA

polymerase mensintesis strand DNA baru yang komplemen dengan template

DNA dengan menambahkan dNTPs dari arah 5’ ke 3’. Waktu ekstensi

berganung pada DNA polymerase yang digunakan dan panjang fragmen DNA

yang diamplifikasi (Logan, et al., 2009).

5. Elongasi final

Tahap ini biasanya dilakukan pada temperature 70-74oC selama 5-15 menit

setelah siklus PCR terakhir untuk memastikan setiap single stranded DNA

yang tersisa diekstensi secara utuh (Logan, et al., 2009).



6. Tahap penyimpanan

Temperatur tahap ini adalah 4-15oC untuk waktu yang tak terhingga. Tujuan

dari tahap ini adalah penyimpanan jangka pendek dari DNA yang telah

direaksikan (Logan, et al., 2009).

Gambar 4.4 menunjukkan proses molekuler yang terjadi pada siklus termal

PCR, sementara gambar 4.5 menunjukkan diagram siklus termal PCR.

Gambar 4.4 Proses molekuler siklus termal PCR (NIH History, 2010)



Gambar 4.5 Siklus PCR dengan Suhu Optimum (Viljoen, et al., 2005)

Pada hasil percobaan, didapatkan bahwa hasil elektroforesis PCR dari gen

phoR berada di sekitar 500bp. Selain itu, terlihat bahwa tidak ada zat lain yang

berada di bawah DNA yang dielektroforesis. Ini tidak sesuai dengan literatur

yang menunjukkan bahwa panjang protein dari gen phoR adalah 1740 bp

(Seki, et al., 1988). Hal ini bisa disebabkan karena DNA tidak seluruhnya

terambil ataupun masih tertinggal dalam microtube. Lalu, saat DNA ditaruh

pada gel bisa saja masih terdapat DNA yang tertinggal pada tips mikropipet

ataupun gel tidak seluruhnya masuk ke dalam well namun ada yang terlepas ke

larutan buffer karena kurang berhati-hati dalam prosedur. Selain itu, dapat

pula terjadi karena konsentrasi primer yang diberikan tidak terlalu tepat

sehingga DNA tidak tertranslasi secara benar.



BAB V

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan dari percobaan ini adalah:

1. Vektor DNA Plasmid pET-32b(+) berhasil diisolasi. Hasil elektroforesis

tidak dapat dibaca karena tidak adanya gene ladder yang dapat dijadikan

acuan pembacaan panjang DNA. Seharusnya didapatkan panjang 5899 bp.

2. Pada percobaan dapat dilihat bahwa gen phoR berhasil diamplifikasi. Hasil

elektroforesis menunjukkan band yang didapat adalah 500 bp, sementara

jika berhasil seharusnya didapatkan panjang basa 1740 bp.



DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B. et al., 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland

Science.

Bartlett, J. & Stirling, D., 2003. A Short History of the Polymerase Chain

Reaction. Methods in Molecular Biology, Volume 226, pp. 3-6.

Chien, A., Edgar, D. & Trella, J., 1976. "Deoxyribonucleic Acid Polymerase from

the Extreme Thermophile Thermus aquaticus". Journal of Bacterium, 127(3),

pp. 1550-1557.

Dahm, R., 2008. "Discovering DNA: Friedrich Miescher and the Early Years of

Nucleic Acid Research". Human Genetics, 122(6), pp. 565-581.

Focosi, D., 2014. NUCLEIC ACID ANALYSIS IN VITRO.

http://www.ufrgs.br/imunovet/molecular_immunology/invitrocellfree_nucleicacid.html. Diakses tanggal 16 November 2015.

Kroll, J., Klinter, S., Schneider, C. & Steinbuchel, A., 2010. "Plasmid Addiction

Systems: Perspectives and Applications in Biotechnology". Microbial

Biotechnology, 3(6), pp. 634-657.

LaVallie, E. et al., 1993. "pET-32a-c(+) Vectors". Bio/Technology, Volume 11, p.

187 – 193.

Lederberg, J., 1952. "Cell Genetics and Hereditary Symbiosis". Physiol, 32(4), p.

403 – 430.

Lipps, G., 2008. Plasmids: Current Research and Future Trends.. Norfolk:

Caister Academic Press.

Logan, J., Edwards, K. & Saunders, N., 2009. Real-Time PCR: CurrentTechnology and Applications.. Norfolk: Caister Academic Press.

Lucotte, G. & Baneyx, F., 1993. Introduction to Molecular Cloning Techniques.

New York: Willey-Blackwell.

NIH History, 2010. Polymerase Chain Reaction Test.

https://history.nih.gov/nihinownwords/assets/images/archive/polymerasechai

n_lg.jpg. Diakses tanggal 16 November 2015].

Oswald, N., 2014. The Basics: how Alkaline Lysis Works.

http://bitesizebio.com/180/the-basics-how-alkaline-lysis-works/. Diakses

tanggal 16 November 2015.

Robyt, J. F. & White, B. J., 1990. Biochemical Techniques Theory and Practice.

Waveland: Waveland Press.

Seki, T., Yoshikawa, H., Takahashi, H. & Saito, H., 1988. "Nucleotide Sequence

of the Bacillus subtilis phoR Gene". Journal of Bacteriology, 170(12), pp.

5935-5938.

Stock, S. P., Vandenberg, J., Glazer, I. & Boemare, N., 2009. Insect Pathogens:

Molecular Approaches and Techniques. Oxfordshire: MPG Books Group.

Tranbichler, M. & Shapiro, L., 2006. Chromosome Organization and Segregation

in Bacterial. Journal of Structural, 156(2), p. 292 – 303.

Viljoen, G. J., Nel, L. H. & Crowther, J. R., 2005. Molecular Diagnostic PCR

Handbook. USA: Springer.

laporan praktikum isolasi dna plasmid pet-32b(+) dan amplifikasi gen phor

Documents