perbedaan isolasi dna plasmid dan isolasi dna kromosom

7/25/2019 Perbedaan Isolasi DNA Plasmid Dan Isolasi DNA Kromosom

1/9

PERBEDAAN ISOLASI DNA PLASMID DAN ISOLASI DNA

KROMOSOM

1. Sumber DNA

Sumber DNA untuk isolasi DNA kromosom; bisa dari tanaman,

kultur mikroorganise, atau sel manusia.

Sumber DNA untuk isolasi DNA plasmid;hanya ditemukan pada

beberapa bakteri2. Prinsip isolasi DNA

Prinsip isolasi DNA kromosom yaitu memisahkan DNA kromosom

atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.

Prinsip isolasi DNA Plasmid yaitu DNA plasmid merupakan wadah

yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di

pisahkan dari DNA kromosom.

3. Prosedur er!a Isolasi DNA Prosedur kerja isolasi DNA kromosom

Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk

membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut

ditambahkan protease yang ber!ungsi mendegradasi protein" dan

#Nase yang ber!ungsi untuk mendegradasi #NA", sehingga yang

tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan

sampai suhu $%&' untuk menginakti!asi en(im yang mendegradasi

DNA DNase". )arutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol

dan bisa dilarutkan lagi dengan air Prosedur kerja isolasi DNA Plasmid

DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih ke*il daripada DNA

kromosom. +ntuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan

perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur isolasi DNA

kromosom. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan

detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid,

#NA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein

diendapkan dengan penambahan potasium. DNA protein

potasium yang mengendap dipisahkan dengan *ara sentri!ugasi.

Supernatan yang mengandung DNA plasmid, #NA dan protein yang

tersisa dipisahkan. emudian ditambahkan #Nase dan protese untuk

mendegradasi #NA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat

dipresipitasi menggunakan etanol". Produ #an$ di%asilan

Pada isolasi kromosomal produk DNA berupa pelet atau presipitat

sedangkan pada plasmid berupa supernatan, karena perbedaan

berat molekul ukuran plasmid kromosom".


2/9

&. 'abel Perbedaan/abel 0.1. 2asil isolasi DNA kromosomal bakteri 3.*oli berdasarkan

prosedur kerja manual/ahap 4ahan 2asilulti5asi Media )uria-4ertani broth ultur sel bakteri 3.*oli#esuspe

nsi

6% 7) 3D/A 8% mM DNA tersuspensi

)isis sel /ahap awal pelisisan dinding sel"9

:% 7) sukrosa 8m)/ahap pelisisan kedua membran sel"

9 1= 7) Na'l %,8 M, 1%,8 7) 3D/A

%,8 M, ,8 7) SDS %m)

Supernatan DNA, dan

natan berisi kontaminan

penyusun sel" dan (at-(at

sisa larutan pelisisan sel

Puri?kasi loro!orm /iga !asa9(asa A)as 9 DNA murni

dan air supernatan"In)er*asa 9 protein dan

(at-(at sisa atau sampah

(asa or$ani 9 kloro!orm

dan senyawa-senyawa

organik terikatPemekat

an DNA

3tanol Pelet atau presipitat DNA

kromosomal murni

/abel 0. . 2asil isolasi DNA plasmid bakteri 3.*oli berdasarkan prosedur

kerja dengan menggunakan spin *olumn

/ahap 4ahan 2asilulti5asi

har5esting"

Media )uria-4ertani broth ultur sel bakteri 3.*oli

#esuspensi

resuspenson"

%% 7) bu!er PD 1 dan #NAse DNA tersuspensi

)isis lysis" %% 7) bu!er PD Supernatan DNA, dan

natan berisi kontaminan

penyusun sel" dan (at-(at

sisa larutan pelisisan sel


3/9


4/9

Kultur bakteri sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu

4C selama 40 menit, lalu disuspensikan kembali pelet yang didapat dengan 60 L !"# 50

m$, dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 15

menit% 40 L arutan sukr&sa 25' dan 10,5 L !"# 0,5 $ p ( ) ditambahkan pada pelet

yang diper&leh, lalu ditambahkan dengan 1,5 L lis&*im 10 mg+mL dan diinkubasi pada suhu

-C selama 1 .am% !itambahkan 1) L /aCl 5 $, 10,5 L !"# 0,5 $, 22,5 L ! 20',

dn 1,5 L pr&teinaseK 5 mg+mL dan di&rte3% ediaan kemudian diinkubasi pada suhu 50C

selama 1 .am dan ditambahkan kl&r&f&rm 11 lalu dik&c&k perlahan selama 20 menit%

elan.utnya disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 0 menit%

upernatan dipindahkan larutan yang terlihat bening ke tabung baru yang berisi 23 &lume

etan&l dingin, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10%000 rpm selama 5 menit dan kemudian

ditambahka pelet dengan 0 L buffer "%

Isolasi DNA Plasmid dengan Metode Spin Column

"ahap 7% (aresting

1,5 mL kultur sel bakteri disiapkan dalam tabung mikr& 1,5 mL lalu disentrifuga pada

14%000 8 16%000 3 g selama 1 menit kemudian dibuang supernatan%

"ahap 77% 9esuspensi

200 L buffer :!1 pastikan 9/#se # telah ditambahkan ditambahkan kedalam

tabung mikr& kemudian di&rte3%

"ahap 777% Lysis"ahap 777% /eutrali*ati&n

!itambahkan 00 L buffer :! kemudian dib&lakbalik tabung 10 3 tanpa

menggunakan &rte3, kemudian disentrifug pada 14%000 8 16%000 3 g selama menit%

"ahap ;% !/#


5/9

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Kromosomal DNA Bakteri E.Coli

"ahap pertama setelah dilakukannya kultiasi yaitu resuspensi sel bakteri% etelah

disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada suhu 4C selama 20 menit, pelet yang didapat

Kemudian disuspensikan kembali dengan menambahkan 60 L !"# 50 $m, lalu

disentrifugasi kembali% :enambahan !"# ini untuk mencegah k&agulasi !/# sehingga

!/# didapat sebagai supernatan dan dapat dipisahkan dengan natannya%

"ahap selan.utnya pada is&lasi !/# kr&m&s&mal ditambahkan sukr&sa 25' dan 10,5 L

!"# 0,5 $ p ( )% ?ungsi penambahan !"# pada tahap ini yaitu untuk mengikat kati&n

kati&n dialen seperti $g2@dan Ca2@% Kedua i&n ini berfungsi sebagai k&fakt&r yang esensial

bagi aktiitas !nase dalam mencacah m&lekul !/#% elain itu, i&n $g dan Ca diketahui

berperan penting dalam memelihara integritas dan kestabilan membrane plasma bakterisehingga ker.a !"# .uga berfungsi membantu destabilisasi membran% edangkan $enurut

"riana, dkk% 2012 penambahan sukr&sa berperan dalam melisiskan dinding sel bakteri%

elan.utnya dtambahkan dengan lis&*im 10 mg+mL dan diinkubasi pada suhu -C selama 1

.am% :emberian lis&*im berfungsi untuk merusak dinding sel bakteri secara en*imatis%

edangkan inkubasi dan pengaturan suhu bertu.uan untuk meng&ptimalkan ker.a en*im

lis&*im%

"ahap lisis sel pada is&lasi !/# kr&m&s&m bakteri yaitu dengan ditambahkan /aCl,

!"# dan ! serta pr&teinaseK% :enambahan /aCl ini yaitu untuk menghilangkan

p&lisakarida yang mungkin terdapat pada sel bakteri% !"# berfungsi untuk mencegah

k&agulasi !/# dan men.aga struktur !/# sehingga tidak rusak% :r&teinaseK berfungsi

untuk mendenaturasikan pr&tein secara en*imatis, sehingga pr&tein terpresipitasi% !

merupakan salah satu .enis deter.en yang dapat mengikat atau menyelimuti pr&tein membran

sehingga terpisah dari bilayer lipid% !eter.en memiliki kemampuan melarutkan lipid sebagai

k&mp&nen membran sel, karena memiliki sifat amfipatik Lubis dan $eliana, 201% :r&ses

melarutkan atau memecah k&mp&nen membran sel tersebut dikenal dengan istilah s&lubilisasi

membran sel :rasety&, 200A%

"ahap selan.utnya yaitu tahap purifikasi atau pemurnian !/# yang diis&lasi% :ada

tahap ini ditambahkan kl&r&f&rm yaitu agar pelarut &rganik ini secara signifikan dapat

mendenaturasi pr&tein dan melarutkan k&mp&nen lipid, selain itu kl&r&f&rm .uga

menstabilkan *&na interfase yang berisi k&ntaminan !/#% :ada penambahan kl&r&f&rm ini

akan menghasilkan tiga fasa yaitu paling atas adalah !/# dan air, fasa kedua pr&tein dan

sisasisa k&ntaminan atau sampah dari sel yang disebut .uga *&na interfase, dan fasa ketiga


6/9

adalah kl&r&f&rm seta senya>asenya>a &rganik yang diikatnya sehingga disebut .uga fasa

&rganik% ?ase ini memisahkan !/# dengan k&ntaminannya sehingga !/# yang didapat

merupakan !/# murni, selain itu .uga memudahkan pengambilan !/# yang terdapat di fasa

paling atas akibat adanya penambahan kl&r&f&rm%

"ahap berikutnya adalah pemekatan !/#% Cara sederhana dan murah untuk

memisahkan !/# dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi etan&l% :r&sedur dasarnya

adalah etan&l abs&lut ditambahkan ke larutan !/#% :r&ses presipitasi etan&l umumnya dapat

dibantu dengan penambahan garam% etelah perlakuan itu, !/# akan terpresipitasi dan dapat

dipeletkan dengan sentrifugasi% elan.utnya pelet !/# dicuci dengan etan&l -0'% Kemudian

pelet dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air atau buffer tris !"# "%

Lalu disimpan pada suhu 20C, suhu ini mendukung !/# dalam bentuk presipitat%

Isolasi DNA Plasmid Bakteri E.coli

$et&de yang digunakan dalam is&lasi !/# plasmid E.coli yaitumet&de spin c&lumn%

$et&de ini merupakan met&de yang lebih mudah dilakukan karena larutanlarutan yang

digunakan sudah tersedia dalam bentuk campuran :! c&lumn sehingga penger.aan pun lebih

cepat, akan tetapi met&de ini relatif mahal% :ada met&de ini terdiri dari - tahap yaitu

haresting, resuspensi&n, lysis, neutrali*ati&n, !/# binding, =ash, dan !/# eluti&n%

$et&de spin c&lumn merupakan m&difikasi dari met&de alkalin lisis dan penggunaan 9/#se

untuk memper&leh sel yang terlisiskan dengan sempurna dan meminimalisir k&ntaminan

gen&mik >>>%geneaid%c&m%

:ada tahap pertama yaitu harvesting step, ini sama dengan met&de kultiasi sel

bakteri pada met&de manual% Karenanya disebut tahap pemanenan atau haresting% :ada

tahap ini kultur sel bakteri yang dibutuhkan yaitu 1,5 mL karena merupakan pr&sedur standar

dalam penger.aan met&de spin c&lumn%

"ahap selan.utnya yaitu tahap resuspensi&n, dengan menambahkan :! 1, dan

sebelumnya telah ditambahkan 9/#se% "ahap in sama dengan tahap resuspensi pada met&de

manual dengan k&mp&sisi "ris!"# dan gluk&sa, sebagai tahap a>al perusakan dinding sel

bakteri%

"ahap ketiga yaitu tahap Lysis, dengan menambahkan bufer :! 2% "ahap ini sama

dengan tahap manual pelisisan sel bakteri, yang biasanya menggunakan ! dan /aB(%

:ada tahap ini berbeda dengan tahap lisis pada is&lasi kr&m&s&m% !imana terdapat perusakan

!/#se, yang dikha>atirkan dapat merusak !/# plasmid% ! merupakan garam deter.en

ani&nik, yang ketika dilarutkan dalam air akan berdis&siasi men.adi i&n /a@dan dan d&desil

sulfat% !&desil sulfat adalah m&lekul deter.en berantai hidr&f&bik pan.ang dengan gugus

sulfat bermuatan negatif pada salah satu u.ungnya% !&desil sulfat akan berikatan dengan


7/9

bagian interi&r lipid bilayer pada membran sehingga mengakibatkan lisis sel% K&mp&nen

selular bakteri termasuk !/# dan 9/# akan keluar dan larut dalam% 7&n deter.en d&desil

sulfat .uga mendenaturasi pr&tein yang ada dalam lisat, dengan .alan memutuskan ikatan

katan n&n k&alen terutama ikatan hidr&gen pada pr&tein, sehingga kembali ke struktur

primernya, sebagai rantai linier p&lipeptida% (al ini membuat pr&teinpr&tein en*im

kehilangan aktiitas en*imatiknya, termasuk en*im !nase yang dikha>atirkan merusak !/#

plasmid% :ada tahap ini larutan akan berisi asam nukleat !/# dan 9/# dan debris sel yang

terdapat dalam k&mpleks d&desil sulfatlipidpr&tein% ementara itu, /aB( yang bersifat basa

membuat seluruh m&lekul !/# berutas ganda baik !/# kr&m&s&mal maupun plasmid

mengalami denaturasi men.adi utasutas tunggal% 7tulah mengapa met&de ini disebut sebagai

met&de lisis basa alkaline lysis% :ada tahapan ini, !/# kr&m&s&mal terpisah sempurna

men.adi utasutas tunggal terpisah sedangkan utas tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran

tetap terhubung, seperti dua cincin yang saling bertautan% Karakter ukuran dan struktur kedua

.enis !/# inilah yang men.adi dasar pemisahan !/# plasmid dari !/# kr&m&s&mal%

"ahap selan.utnya adalah tahap neutrali*ati&n atau netralisasi% :ada tahap ini

ditambahkan bufer :! , sedangkan pada met&de manual tahap netralisasi ini dilakukan

dengan menambahkan s&dium asetat p( 5,5% 7&n K@bebas yang berasal dari p&tasium asetat

pada larutan 777 akan menetralkan muatan negatif dari k&mpleks k&mpleks d&desil sulfat

lipidpr&tein terdenaturasi, membentuk p&tasium d&desil sulfat K! yang tidak larut dan

terpresipitasi bersama lipid membran dan pr&tein yang terdenaturasi% La.u presipitasi K!

dapat ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es 4&C%

#sam asetat pada s&dium asetat ini berfungsi menetralkan suasana basa yang

diciptakan &leh i&n hidr&ksida dari /aB( yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya%

Ketika p( larutan kembali netral, ikatanikatan hidr&gen antar basa utas tunggal !/#

terbentuk kembali, sehingga m&lekul tersebut dapat berenaturasi men.adi !/# berutas

ganda% :r&ses renaturasi inilah yang men.adi tahap seleksi bagi plasmid% Dtasutas tunggal

sirkular !/# plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat

berenaturasi sempurna membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan sedangkan

!/# kr&m&s&mal yang berukuran .auh lebih besar dari plasmid tidak dapat berenaturasi

sempurna, membentuk struktur kusut tak beraturan yang terperangkap dan ikut terpresipitasi

bersama k&mpleks K!lipidpr&tein% Bleh karena itu, pencampuran pada tahap lisis sel

harus dilakukan dengan perlahan% :eng&c&kan yang kuat misalnya &rte3 akan


8/9

mengakibatkan m&lekul !/# kr&m&s&m akan terp&t&ng men.adi fragmenfragmen yang

kecil yang dapat ikut berenaturasi seperti halnya !/# plasmid, dan mengk&ntaminasi !/#

plasmid%

"ahap kelima yaitu tahap !/# binding, dimana pada tahap ini :! c&lumn

ditempatkan pada c&llecti&n tube 2 mL, dan supernatan pada tahap !/# eluti&n dituangkan

kedalamnya% edangkan pada met&de manual tahap ini merupakan tahap purifikasi atau

pemurnian !/# plasmid yang diis&lasi% ash dan

sebelumnya telah ditambahkan etan&l% "ahap ini sama dengan tahap pemekatan !/# pada

met&de manual% :emekatan !/# bertu.uan memisahkan !/# dari larutan sehingga

diper&leh k&nsentrasi yang lebih tinggi% Cara sederhana dan murah untuk memisahkan !/#

dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi etan&l% :r&sedur dasarnya adalah etan&l

abs&lut ditambahkan ke larutan !/#% :r&ses presipitasi etan&l umumnya dapat dibantu

dengan penambahan garam% etelah perlakuan itu, !/# akan terpresipitasi dan dapat

dipeletkan dengan sentrifugasi% elan.utnya pelet !/# dicuci dengan etan&l -0'% Kemudian

pelet dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air atau buffer tris !"# "%


9/9

"ahap terakhir yaitu tahap !/# elusi&n, pada tahap ini ditambahkan bufer elusi lalu

disentrifugasi untuk mendapatkan !/# murni yang akan digunakan pada tahap purifikasi

!/# di tahap kelima% #gar didapat !/# plasmid yang benar2 murni maka sebelum

dipurifikasi, !/# telah dimurnikan pada tahap ini% tahap ini lah yang membedakan dengan

met&de manual% :ada met&de manual, purifikasi langsung dilakukan setelah tahap netralisasi

tanpa sebelumnya ada perlakuan khusus untuk mempersiapkan !/# sebelum memasuki

tahap purifikasi%

I. KESIMPULAN

Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA kromosomal dan lasmid dari bakteri

Escherechia coli yaitu telah dilakukan isolasi DNA kromosomal dan plasmid dari bakteri

E.coli, dengan hasil sebagai berikut:1. Pada isolasi kromosomal produk DNA berupa pelet atau presipitat sedangkan pada

plasmid berupa spernatan, karena perbedaan berat molekul (ukuran plasmid

kromosom!.

. Penggunaan spin column pada isolasi DNA plasmid lebih e"esien #aktu dan tenaga

dibandingkan dengan metode manual isolasi DNA kromosomal bakteri E.coli.

DA!"A# P$S"AKA

$a""ar, %abrani. &''. )ioteknologi *olekul. Kimia +*PA universitas Pad-ad-aran.

)andung.

$ader,%% 1AA%)iology% =m% C n :ublishers% L&>a

"riana, 9ian, ?arris ?athin dan !effy :aradithya% 2012% aporan Praktikum: solasi dan

Pemurnian DNA Plasmid% 7:

perbedaan isolasi dna plasmid dan isolasi dna kromosom

Documents