his to teknik

7/23/2019 His to Teknik

http://slidepdf.com/reader/full/his-to-teknik 1/51

Histoteknik Dasar



Histoteknik adalah metoda membuat sajian histologi

dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian

proses hingga menjadi sajian yang siap untuk

dianalisis.

Sumber Jaringan:

1. Manusia

2. Hewan



Rangkaian Proses

1. Pengawetan (Fixation);

2. Dehidrasi (Dehydration);

3. Pembeningan (Clearing );

4. Pembenaman (Infiltration/Impregnation/Embedding );

5. Pengecoran (Blocking/Casting );6. Pengirisan Jaringan (Sectioning );

7. Pewarnaan (Staining );

8. Perekatan (Mounting );

9. Pelabelan (Labelling )



1. Pengawetan

Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses:

1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis

2. Pengawetan jaringan

3. Pengerasan jaringan

4. Pemadatan koloid

5. Differensiasi optik

6. Pengaruh terhadap pewarnaan

Cara melakukan fiksasi:

1. Supravital/intravital;

2. Merendam dalam larutan fiksatif.



Hal-hal yang harus diperhatikan dalam fiksasi

jaringan histologi adalah:

1.Tebal irisan.

2. Volume larutan pengawet.

3.Jenis larutan pengawet.



Kelompok Zat Pengawet

Formaldehyde Formaldehyde (Formalin), Paraformaldehyde, Glutaraldehyde,

Picrates Picric Acid Bouin’s Solution

Mercurials Helly ‘s Fluid (Zenker Formol)

Oxidizing Agents Osmium tetroxide

Alcohol Methanol, Alcohol (etanol)

Potassium Dichromate Muller



JENIS CAIRAN FIKSATIF

FORMALIN

MULLER

BOUIN

CARNOY

ZENKER FORMAL (CAIRAN HELLY)

ETANOL

ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN(TELLYESNICZKY)

dll



FORMALIN

Yg digunakan adalah bentuk monomer: dibuat denganmenetralkan/alkalis larutan

Mengakibatkan crosslink protein

Formal saline, formal calcium, 10% neutral bufferedformalin, buffer formalin sukrosa

Kelebihan dan kekurangan



Human, 10% Formalin, HE 612x



BOUIN

Mengandung asam pikrat, meledak kalau kering

Mudah dikenali saat pemotongan warna kuning

Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata

Jaringan mengalami pengerutan



Rat, Bouin’s Solution,HE, Testis 400x



Zenker Formol (Cairan Helly)

Mengandung merkuri klorida Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan

penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnyacenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengahmenjadi lunak karena underfixed

Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulangdan limpa, mitochondria.



Rat, Helly Fluid, HE 162x



Etanol

Cytological fixatives

Etanol 95%

Digunakan untuk Pap test, swab

Mempertahankan antigenisitas cocok IHC



LARUTAN CARNOY

mengawetkan substansia Nissl dan glikogen daya penetrasi yang cepat Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu

diagnosis perlu ditegakkan dengan cepat, misalnyauntuk diagnosis kanker pada saat pembedahan.Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2 jam,sedangkan potongan kecil selesai difiksasidalam 15 menit.

efek pengerutan: kuat



Mus musculus, Carnoy, Liver



Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuankhusus

• Tulang: dekalsifikasi formic acid 8%

• Kulit: teknik lendrum• Cuci dengan air kran mengalir/alkohol 90%

• Fenol 4% dalam akuades (v/v) selama 1 -3 hari



dehidrasi

Tahapan dehidrasi Cara I Alkohol 70% 3 hari ( 3x ganti) Alkohol 95% 3 hari ( 3x ganti) Alkohol 100% 3 hari ( 3x ganti)

Cara II Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari; Alkohol 95% 2 hari ( 2x ganti); Alkohol 100 % 2 hari ( 2x ganti).

Sukrosa 20% (untuk cryostat): Sukrosa 20% selama 2 hari; Metanol: jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti etanol;

Aseton : 3 x 20 menit.



PEMBENINGAN (CLEARING )

Bahan yang digunakan :

Cedar wood oil;

Chloroform;

Benzene/benzol; Benzyl benzoat;

Methyl benzoat;

Xylene/xylol;

Toluene



Cedar Wood Oil

Keuntungan

Sifat clearing-nya paling baik.

Tak mengeraskan jaringan

Jaringan yang halus sangat baik.

Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan jaringanikat padat)

Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan)



Chloroform

Keuntungan : Paling sering dipakai

Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa menjadi keras)

Kerugian Titik akhir tak dapat dilihat dengan mata

Saat menjadi bening dan transparan tak jelas Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang

Lebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murahdari cedar wood oil .



Benzyl Benzoate

Metoda :

Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga jaringantenggelam. Jaringan menjadi bening dan transparan.

Benzyl benzoat II selama 2-3 jam. Benzol-Paraffin selama ½ - 1 jam. Campuran benzol

dan paraffin cair dengan perbandingan sama.

Masukkan ke dalam paraffin cair.



Methyl Benzoate

Metode :

Methyl benzoat I sampai jaringan tenggelam. Daya penetrasi lebih cepat dari benzol benzoat;

Jaringan mudah rapuh. Methyl benzoat II selama 1-2 jam.

Benzol-Paraffin. Campuran benzol dan paraffindengan perbandingan sama.

Masukkan ke dalam paraffin cair.



Benzene dan Xylene

Keuntungan Waktu clearing cepat : ½ - 1 jam. Benzene lebih lambat dari xylene tetapi kerapuhan jaringan lebih

berkurang dibanding xylene

Kerugian Karsinogenik

Metode Direndam dalam xylol 2 kali @ 1 menit hingga bening dan transparan Volume 50 – 1000 kali volume jaringan Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair



Toluene

Sama dgn xylene tetapi lebih lambat

Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi jaringan

Mudah menguap



PEMBENAMAN

Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening(clearing agent ) dari jaringan dan menggantikannyadengan paraffin.

Dilakukan dengan menggunakan paraffin oven

Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam jaringan sehingga saat dipotong dengan mikrotom jaringanakan robek.

Teknik Pembenaman Paraffin/ paraplast I selama 2 jam;

Paraffin/ paraplast II selama 1 jam; Paraffin/ paraplast III selama 2 jam.

Setelah pembenaman, proses dilanjutkan denganpengecoran (blocking).



PENGECORAN( BLOCKING/CASTING )

Alat Cetak : Besi potongan berbentuk L (Leuckhart) Susun 2 buah potongan besi si atas lembaran logam sehingga

membentuk ruang kubus; Tuangkan sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor;

Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris; Tuangkan paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya; Hindarkan terbentuknya air bubble. Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold ). Spatula untuk melekatkan blok paraffin. Beri label identitas jaringan saat blocking.



PENGIRISAN JARINGAN ( SECTIONING )

Persiapan:- Microtome knive vs Microtome blade (disposable)Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu.Rekatkan blok paraffin yang akan dipotong pada holder denganmenggunakan spatula atau scalpel blade yang panas. Letakkan holder berikut blok preparat pada tempatnya di mikrotom.

- Siapkan coated slides:Albumin (putih telur);Gelatin;SuperFrostPoly-L-Lysine

- Waterbath berisi air hangat 55oC;

- Sengkelit.



Teknik Pemotongan ketebalan + 5 – 10 m (disesuaikan kebutuhan)

Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arahpisau sedekat mungkin; Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis, Buang pita-pita paraffin awal yang tanpa jaringan; Setelah potongan mengenai jaringan, potong blok preparat

secara hati-hati; pindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di

dalam waterbath yang diatur pada suhu 55oC; Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan

paraffin ke kaca objek; Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan

sampai saatnya untuk diwarnai.



Pewarnaan ( Staining)



Pertimbangan Pewarnaan

Unsur yang akan didemonstrasikan

Pigmen pengganggu

Mis: melanin → bleaching

Fixing fluid/fixatives Muller fluid → jaringan dicuci dgn air mengalir selama 24 jam

Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo



Jenis Pewarnaan

Hematoxylin & Eosin (Rutin)

Khusus PAS, PTAH, Impregnasi perak

Sudan → lipid

Sitologik Pap test

Blood smear

Swab mucosa

Imunohistokimia



Hematoxylin dan Eosin

Paling banyak digunakan → rutin

HE dapat menunjukkan sebagian besar strukturhistologi

Demonstrasi nuklei adalah penting Variasi dalam hasil



Hematein (oxidized hematoxylin) adalah zat warna

Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam)

Hematoxylin mewarnai nuclei

Afinitas hematein thd nuclei adalah jelek bila tanpa mordant. Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA

Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead

Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhirpewarnaan

Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant



Natural ripening vs artificial ripening

Artificial ripening: penggunaan mordant (Al, Fe, atauPb)

Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru(blueing) bila diperlakukan dgn alkali lemah (air kranatau lithium carbonate)

Methods are

regressive Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm

Counterstain (IHC)



Hematoxylin

Penggunaan Pewarnaan Nuclei Struktur selain nuclei

Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan

nuclei1. Dellafield (1885)2. Ehrlich (1886)3. Heidenhains (1896)4. Harris (1900)

5. Mayer (1903)6. Weigert (1904)7. Carazzi (1911)8. Cole (1943)



Haematoxyllin Mixtures

Connective tissue Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin

Elastic fibers Verhoeff’s method

Myelin Kultschitzky

Loyez

Spielmeyer

Weigert

Copper and lead Mallory

Parker

Mucin Mayer’s mucihematein



PEWARNAAN ( STAINING )

Formula Hematoxylin Mayer Haematoxylin kristal 1 gr Akuades 1000 ml Sodium Iodate 0,2 gr Ammonium/potassium alum 50 gr

Citric acid 1 gr Chloral hydrate 50 gr

Cara pembuatan Hematoxylin Mayer Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades. Tambahkan hematoxylin dan campurkan secara baik (aduk). Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.



Eosin

Zat warna xanthene

Ikatan Van der Waals

Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin

Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk

membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan serabut jaringan ikat yang berbeda

Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol

Jenis eosin Eosin Y (yellowish), water soluble

Eosin B (Bluish) Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)



Eosin Y

water soluble Paling banyak digunakan Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein (basa) Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat

metakromatik Terdapat dalam 2 bentuk Monomer: merah Dimer : oranye-merah

Hasil pewarnaan

Sitoplasma: merah Eritrosit : oranye-merah Nukleus piknotik: ungu Nucleolus: merah



Eosin

Formula Eosin Eosin-alkohol Stok 1%

Eosin y ws 1 gr

Distilled water 20 ml

Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml Working Eosin Solution Eosin-alkohol stok 1 bagian

Alkohol 80% 3 bagian

Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.



Mewarnai Preparat

Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit); Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) – 95% (2 menit) – 90%(2 menit)

– 80% (2 menit) – 70% (2 menit) – air kran (3 menit); Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri klorida

mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam. Deposit merkuridapat dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan diinkubasi dalam larutaniodine 0,5% dalam etanol 70% selama 5 – 10 menit. Irisan dibilas dengan air

lalu diinkubasi dalam sodium thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicucidengan air kran mengalir.

Inkubasi dalam larutan hematoxylin Mayer selama beberapa menit; Cuci dalam air mengalir selama 15-20 menit; Observasi di bawah mikroskop, Counterstaining dengan eosin working

solution selama beberapa menit. Dehidrasi dalam serial alkohol dengangradasi meningkat

Inkubasi dalam xylol 2x2 menit. mounting dengan entelan/balsam kanada. labelling



Acid Alcohol Rinse

Mengurangi warna biru hematoxyllin (todifferentiate nuclear staining)

0.25 % acid rinse

Akuades 975 ml HCl 25 ml

HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)



Blueing

Air kran (yang alkalis)

Jakarta: pH air kran adalah 7.8

Lithium carbonate

Lithium carbonate……………….... 0,5 gr Akuades……………………………… 1000 ml

Campurkan dengan baik.



T ER IM A K AS IH

his to teknik

Documents