polimorfosme mtdna

7/25/2019 Polimorfosme mtDNA

1/11

TUGAS TERSTRUKTUR

BREEDING AND EMBRYO MANIPULATION

Polimorfisme Mt DNA (DNA Mitokondria)

Oleh :

SONI ANDRIAWAN

NIM. 126080112011002

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2015


2/11

I. PENDAHULUAN

Masalah genetik akhir-akhir ini banyak mendapat perhatian dalam

hubungannya dengan masalah konservasi. Tolak ukur keberhasilan kegiatankonservasi dapat dilihat dari keanekaragaman genetik yang tinggi, sehingga

keberadaan organisme secara alami dapat dipertahankan dalam kurun waktu yang

panjang sehingga kepunahannya dapat dihindari. Dengan demikian factor

keragaman genetik menjadi indikator kunci yang utama (Soule 1983 ).

Menurut Frankham et al. (2002) genetika konservasi merupakan salah satu

dari aplikasi ilmu genetika yang bertujuan mempertahankan spesies sebagai

identitas dinamis yang memiliki kemampuan untuk mengatasi perubahan

lingkungan, dengan ruang lingkupnya mencakup manajemen genetika populasi

berukuran kecil, pemecahan masalah ketidakpastian taksonomi, penentuan unit

manejemen intraspesifik, dan penggunaan analisis genetik dalam kegiatan

forensik maupun dalam kajian biologi spesifik.

Salah satu jenis ikan yang hidup di ekosistem perairan rawa adalah ikan

betok (A. Testudineus Blok 1792). Ikan betok merupakan jenis ikan yang mampu

hidup dihampir semua tipe ekosistem perairan, bahkan ia hidup pada perairan

payau dengan salinitas mencapai 15 ppt (Slamat dan Hanafie, 2007). Ikan betok

mampu hidup dalam lumpur selama berbulan bulan tanpa mendapatkan

makanan dengan cara berhibernasi atau tidur sepanjang harinya. Di Kalimantan

Selatan pada khususnya, ikan betok merupakan jenis ikan yang sangat digemari

oleh masyarakat, selain rasa dagingnya yang gurih juga harganya tergolong mahal

yaitu mencapai Rp 50.000 80.000 yang berukuran 5 10 ekor/kg. Karena

harganya yang tergolong tinggi tersebut, maka jenis ikan ini di buru oleh para

nelayan sampai mengalami over fishing dan illegal fishing yang dapat

menyebabkan kerusakan habitat perairan rawa sehingga diperlukan suatu

konservasi genetik untuk melindungi ikan betok tersebut dari kelangkaan.

Keragaman genetik merupakan bagian dari keragaman hayati

(biodiversity) yang memiliki pengertian lebih luas, yakni keragaman structural

maupun fungsional dari kehidupan pada tingkat komunitas dan ekosistem,

populasi, spesies dan genetik (Soewardi, 2007). Keragaman genetik juga


3/11

merupakan kunci penting dalam memelihara keberlanjutan dan meningkatkan

produktivitas dari suatu spesies (Garg et al, 2009).

Keragaman genetik ikan dapat diidentifikasi dengan melihat karakter

fenotipe meristiknya yaitu dengan cara menghitung jumlah jari jari sirip yang

terdapat pada tubuh ikan tersebut. Upaya melihat keragaman polimorfisme

menggunakan DNA inti atau DNA mitokondria dengan metode PCR (Polymerase

Chain Reaction) dan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) dapat

dilakukan terhadap populasi ikan betok yang hidup di ekosistem perairan rawa.

Menurut Shui et al (2008) Tiga karakteristik penting mt-DNA untuk studi

keragaman genetik diantaranya yaitu : 1) Tingkat evolusinya cepat, berevolusi 5

10 kali lebih cepat dari DNA inti sel, 2) Menurun secara maternal dan terdapat

pada sel sitoplasma, 3) Tidak ada segregasi atau rekombinasi. Tipe mutasi

sederhana yaitu subtitusi basa atau mutasi panjang basa, mutasi terjadi terutama di

small non coding region, Jadi polimorfisme merupakan penanda genetic netral

(Wang et al, 2008). Mt-DNA D Loop (Displacement loop) merupakan daerah

yang mempunyai tingkat polimorfisme tertinggi (Li et al, 2009).

II. PUSTAKA

2.1 DNA Mitokondria

DNA mitokondria merupakan salah satu bentuk DNA yang terdapat di

dalam sitoplasma. Mitokondria merupakan pusat dari sintesis energi di dalam sel.

Semua reaksi metabolisme sangat tergantung pada ketersediaan energi. Di dalam

mitokondria banyak sekali terjadi reaksi metabolisme, sehingga di dalamnya jugabanyak terdapat enzim-enzim yang mempengaruhi proses metabolisme dan

sebagian enzim itu dikodekan oleh DNA mitokondria (Sutarno, 1999). DNA

mitokondria banyak dijadikan penanda untuk mengetahui adanya variasi genetik,

karena selain mudah diekstraksi, DNA mitokondria mempunyai ukuran yang

relatif kecil sehingga mudah dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh (Shadel

dan Clayton, 1997). Selain itu DNA mitokondria mempunyai kecepatan mutasi


4/11

sepuluh kali lebih cepat dari DNA inti (Hecht, 1990; Rahman et al., 1993; Brown

et al., 1979 dalamIshida et al., 1994).

Polimorfisme pada DNA mitokondria diketahui mempunyai pengaruh

terhadap fenotipe, seperti keterlibatannya dalam berbagai penyakit degeneratif

(Wallace et al., 1995; Rahman et al., 1993), proses penuaan (Miquel, 1991;

Wallace et al., 1995; Linnane et al.,1992) dan sifat-sifat produksi (Lindberg,

1989; Sutarno et al., 2002; Ron et al., 1993; Schutz et al., 1994; Mannen et

al.,1998). Penelitian tentang variasi genetik DNA mitokondria sudah banyak

dilaporkan, tetapi penelitian tentang variasi genetik DNA mitokondria khususnya

pada fragmen D-loop sapi pedaging di Indonesia masih jarang dilakukan (Sutarno,

1999).

Analisis DNA mitokondria telah digunakan secara luas dalam mempelajari

evolusi, struktur populasi, aliran gen, hibridisasi, biogeografi dan filogeni suatu

spesies hewan (Moritz et al., 1987). Di samping itu, hal yang mendukung

penggunaan mtDNA sebagai penanda genetik salah satunya adalah karena

mtDNA terdapat dalam copyyang tinggi, sehingga memudahkan dalam

pengisolasian dan purifikasi untuk berbagai keperluan analisa genomnya (Duryadi

1994). Selain itu, laju evolusinya tinggi (yaitu 10x lebih cepat dibandingkan pada

DNA inti), diturunkan secara maternal (maternal inheritance) dan mempunyai

jumlah copytinggi. Basa-basa dari gen mitokondria ini dapat di buat copynya

dalam jumlah besar dengan mengamplifikasinya melalui Polymerase Chain

Reaction (PCR).

2.2 Struktur DNA Mitokondria

Sekitar 99% dari material genetik organisme eukariot terdapat dalam inti

dan sisanya 1% terdapat di dalam mitokondria. Mitokondria adalah organel di

sitoplasma tempat berlangsungnya respirasi. DNA mitokondria mengandung

sejumlah gen penting untuk respirasi dan fungsi lainnya. Secara fisik mtDNA ini

terpisah dari DNA lainnya, sehingga relatif lebih mudah untuk mengisolasinya

(berukuran relatif kecil yaitu hanya 16.000-20.000 pasang basa) dibandingkan jika

harus mengisolasi milyaran nukleotida dari genom inti (Wallace 1982).

DNA mitokondria hewan mengandung gen-gen yang mengkodekan 13

polipeptida yang terlibat dalam reaksi fosforilasi oksidasi bersama-sama dengan


5/11

12S dan 16S RNA ribosom dan 22 transfer RNA yang diperlukan untuk ekspresi

mRNA (Hecht, 1990; Rahman et al., 1993; Eledath dan Hines, 1996; Shadel dan

Clayton, 1997; Sutarno et al., 2002). Di dalam DNA mitokondria juga terdapat

fragmen yang tidak mengkodekan protein yang disebut fragmen Displacement-

loop (D-loop). Menurut Andersson et al. (1982), fragmen D-loop mempunyai

panjang 1142 bp. Fragmen D-loop ikut bertanggung jawab atas terjadinya proses

transkripsi dan replikasi (Ron et al., 1993; Lindberg, 1989). Fragmen D-loop

berpengaruh terhadap fertilitas pada ternak (Sutarno et al., 2002), produksi susu

dan prosentase lemak pada susu (Ron et al., 1993; Schutz et al.,1994), dan

berpengaruh juga pada kesehatan ternak (Schutz et al., 1994).

Membran luar mengandung sejumlah

protein transpor (yang disebut porin) dan

enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis

lipid dan metabolism mitokondria. Porin ini

membentuk saluran berukuran relative besar

pada lapisan bilayer membran luar yang

memungkinkan lolosnya ion atau molekul

kecil berukuran 5 kDa atau kurang. Ion atau

molekul tersebut bebas memasuki ruang

antar membran namun sebagian besar tidak

dapat melewati membran dalam yang bersifat impermeabel (Lodish et al.,2000;

Artika, 2003).

Keunikan lain dari mtDNA yaitu memiliki laju mutasi yang lebih tinggi

dibandingkan dengan DNA inti yaitu laju mutasi menetap gen gen mtDNA 10 -

17 kali lebih cepat daripada yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif yang dikodeoleh DNA inti (Wallace, 1997).

2.3 Peranan Konservasi Genetik

Keanekaragaman yang dimiliki dalam suatu populasi inilah yang

berpengaruh pada kemampuan adaptasidalam menghadapi perubahan lingkungan

secara terus menerus. Selain itu berkurangnya populasi suatu spesies juga

dipengaruhi oleh terfragmentasinya suatu habitat yang akan mendorong terjadinya


6/11

penurunan genetika dalam populasi. Hal ini disebabkan oleh faktor gen flow

(putusnya aliran gen), inbreedingdan meningkatnya genetic drift antar populasi

(Frankham et al. 2002).

Perkembangan teknik molekuler seperti penemuan teknik Polymerase

Chain Reaction (PCR) yang mampu mengamplifikasi untai DNA hingga

mencapai konsentrasi tertentu, penggunaan untai DNA sebagai marker dalam

proses PCR, penemuan lokus mikrosatelit dan penemuan metode sekuensing

DNA telah menyebabkan ilmu genetik molekuler mempunyai pengaruh yang

sangat besar dalam studi biologi suatu populasi.

Memahami dan mempertahankan keragaman genetik suatu populasi sangat

penting dalam konservasi karena keragaman genetik yang tinggi akan sangat

membantu suatu populasi beradaptasi terhadap perubahan-perubahan yang terjadi

di lingkungan sekitarnya, termasuk mampu beradaptasi terhadap penyakit

penyakit yang ada di alam. Sebagai contoh, suatu populasi dengan keragaman

genetik yang rendah dapat kita umpamakan sebagai suatu kelompok ndividu yang

saling bersaudara satu sama lain. Sehingga dalam jangka panjang, perkawinan

yang terjadi di dalam kelompok tersebutakan merupakan perkawinan antar

saudara (inbreeding). Kejadian inbreeding ini akan menyebabkan penurunan

kualitas reproduksi dan menyebabkan suatu individu menjadi sensitif terhadap

patogen. Dengan mengetahui status genetiksuatu populasi, kita dapat merancang

program konservasi untuk menghindari kepunahan suatu spesies.

III. METODE

3.2 Polymerase Chain reaction (PCR)

Langkah awal untuk menganalisis DNA adalah memecah genom DNA

menjadi fragmen-fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil. Secara alami DNA

dan protein merupakan suatu molekul polimer yang keberadaannya selalu terkait

dengan RNA. Sedangkan dalam menganalisis DNA kualitasnya (kemurniannya)

sangat menentukan untuk proses analisis selanjutnya. DNA murni dengan jumlah

memadai dapat diperoleh dengan cara mengisolasi DNA memakai prosedur

tertentu yang telah dijamin hasilnya baik, kemudian mengamplifikasinya memakai

mesin Polymerase Chain Reaction (PCR). Isolasi DNA adalah proses pemisahan


7/11

fragmen DNA target dari material sel yang diekstraksi, sedangkan amplifikasi

DNA adalah proses perbanyakan atau sintesis sekuen DNA target dari total genom

DNA. Metode PCR adalah pengganti dari penggunaan clonning untuk

memperoleh jumlah purifikasi yang lebih tinggi dari bagian spesifik pada DNA

genom.

3.2 Ekstraksi dan Pemurnian DNA

Ekstraksi dan pemurnian DNA genom dilakukan berdasarkan prosedur

AmershamPharmacial dengan menggunakan kit Genomic PrepTM Celldan Tissue

Isolation, yaitu melalui tahap penghancuran sel, eliminasi RNA, pengendapan

protein, pengendapan DNA dan hidrasi DNA. Kualitas dan kuantitas DNA diukur

dengan elektroforesis agarose 0,8% dengan pewarnaan etidium bromida dan

mesin kuantifikasi DNA.

3.3 Karakterisasi Genetik mt-DNA

Sampel dipilih secara representatif yang dapat mewakili populasi pada

habitat dengan persyaratan sampel; kondisi badan normal (sirip, sisik, utuh)

panjang dan beratnya seragam. Metode kerja analisis RFLP (Restriction Fragmen

Length Polymorphism), dilakukan beberapa tahap untuk mendapatkan data

polimorfisme fragmen dan situs restriksi yang meliputi ekstraksi mt-DNA,

amplifikasi (teknik PCR), restriksi serta elektroforesis dan visualisasi (Slamat,

Thohari dan Soelistyowati, 2011).

3.4 Ekstraksi mt-DNA

Ekstraksi mt-DNA terdiri beberapa tahap, yaitu tahap penghancuran sel,

tahap eliminasi RNA, tahap pengendapan DNA dan tahap hidrasi mt-DNA.

3.4.1 Amplifikasi mt-DNA Dengan Teknik PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR), secara garis besar terdiri dari tiga

tahap utama yaitu : 1) tahap denaturasi untuk memisahkan DNA menjadi utas

tunggal (single strain), 2) tahap annealing merupakan proses penempelan primer

DNA baru pada utas tunggal yang telah terpisah dan 3) tahap ekstensi yang

merupakan proses pemanjangan utas DNA baru (Baker dan Birt 2000).


8/11

Amplifikasi sekuens mitokondria Dloop dilakukan dengan metode PCR

menggunakan primer forward LHI 509 (5- CAT ATT AAA CCC GAA TGA

TAT TT3) dan reverse FH 1202 (5 - ATA ATA GGG TAT CTA ATC CTA

GTT T3) (Martin et al., 1992) dengan tahapan sebagai berikut: pre-denaturasi

pada suhu 94oC selama 2 menit, 33 siklus amplifikasi dengan dengan denaturasi

pada suhu 94oC selama 1 menit, annealing pada suhu 50oC selama 1 menit, dan

elongasi 72oC selama 2 menit; serta elongasi akhir pada 72oC selama 7 menit.

Pemotongan produk PCR dilakukan dengan menggunakan 7 jenis enzim restriksi,

yaitu Rsa I, Sac I, Msp I, Hae III, Nde II, Alu I dan Hinf I.

3.4.2 Elektroforesis Sekuen mt-DNA Hasil restriksi

Elektroforesis berlangsung selama + 30 menit pada tegangan 100 volt,

pada suhu ruang. Selanjutnya pengamatan pita restriksi pada gel agarose diatas

lampu ultraviolet, dan didokumentasikan lewat kamera polaroid khusus.

Analisis variasi DNA dilakukan untuk melihat variasi genetik ikan kerapu

bebek dari populasi dan kelompok (cohort) umur yang berbeda. Keragaman

haplotipe (h) dalam suatu populasi dihitung menurut persamaan Nei dan Tajima

(1981):

h = 2n (1 - xi2) / (2n1)

i=1

Keterangan :

h = diversitas haplotipe

n = ukuran sampel

xi = frekwensi haplotipe sample ke-i

IV. DISKUSI

4.1 Keragaman Genetik

Digesti fragmen mt-DNA D Loop teramplifikasi menggunakan enzim

restriksi Rsa1, Hae111, Hind111 dan HincVI menunjukkan tipe restriksi

polimorfik, sedangkan digesti menggunakan enzim restriksi Mbo1 menghasilkan

tipe restriksi monomorfik. Situs restriksi dan ukuran fragmen hasil digesti mt-

DNA D Loop menghasilkan 11 tipe restriksi (genoti pe), yaitu Rsa1 menghasilkan


9/11

2 pola digesti (A, B), Mbo1 menghasilkan 1 pola digesti (A), Hae111 dengan 2

pola digesti (A, B), Hind111 dengan 4 pola digesti (A, B, C, D) dan HincVI

dengan 2 pola digesti (A, B). Jumlah seluruh komposit Haplotipe hasil digesti

mt-DNA D Loop menggunakan 5 enzim restriksi adalah 22 fragmen restriksi.

Rekapitulasi identifikasi genotip (site restriction) mt-DNA D Loop hasil digesti

dengan 5 enzim restriksi (Tabel 3).

Tabel 1pola restriksi mt -DNA D loop ikan betok

Komposit Haplotipe Total Mtn Tdh Pst

AAAAA 3 0,17 0,2

AAABA 8 0,17 0,4 0,5AAACA 5 0,17 0,4

BAAAA 2 0,32

BABDB 1 0,17

BAACA 3 0,5

Sample 22 6 10 6

Haplotype 5 3 2

Diversity Haplotype 0.9384 0,7111 0,6

4.2 Perbedaan Genetik Interpopulasi

Rerata jarak genetik Nei antara ketiga populasi berkisar antara 0,106 -

0,0684 (Tabel 4). Jarak genetik terkecil adalah antara populasi rawa tadah hujan

dan pasang surut (0,0684), dan yang terbesar jarak genetik antara rawa tadah

hujan dengan rawa monoton (0,1060).

Tabel 2Jarak Genetik Nei Berdasarkan 5 Situs Retriksi


10/11

Di lihat dari sisi keragaman genotipe terhadap lokus yang teridentifikasi,

maka keragaman genotype populasi ikan betok cukup rendah, ini dapat terlihat

hanya ada satu jenis lokus yang teridentifikasi pada saat amplifikasi mt -DNA.

Keragaman Haplotipe populasikan ikan betok di tigatipe ekosistem rawa (Tabel

3) menggambarkan bahwa terjadinya proses genetic drift atau hibridisasi yang

diperkirakan dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dan dorongan sexual yang

menyebabkan ikan betok bermigrasi ke lokasi perairan yang lebih baik.

Tingginya nilai polymorfisme terhadap nilai monomorfisme, di sebabkan

karena daerah mt-DNA D Loop merupakan daerah yang tidak berkode sehingga

tingkat mutasi pada daerah ini sangat tinggi (Tabel 2). Variasi beberapa jenis gen

tertentu yang dimiliki oleh ikan, merupakan upaya yang dilakukannya untuk

proses adaptasi terhadap kondisi lingkungan yang cenderung berfluktuasi sangat

ekstrim, terutama yang terjadi pada musim kemarau ataupun pada awal musim

hujan. Semakin tinggi nilai derajad polimorfismenya, maka semakin tinggi mutasi

yang terjadi di tingkat gen (Tabel 1). Kondisi habitat ekosistem perairan yang

berbeda beda, jenis makanan yang di dapatkan setiap hari dan tingginya tingkat

pencemaran lingkungan, di duga merupakan penyebab tingginya polimorfisme

ikan betok sebagai bagian dari adaptasi untuk environment survival .

Penstrukturan genetik digambarkan secara jelas berdasarkan distribusi

haplotipe pemisahan populasi ikan betok dari perairan rawa menjadi dua unit stok

populasi, yaitu stok populasi ikan betok yang berasal dari rawa monoton dan rawa

pasang surut, dan stok populasi ikan betok yang berasal dari rawa tadah hujan.

Fenomena ini semakin memperkuat indikasi bahwa po pulasi ikan betok yang

dianalisis berasal dari satu unit reproduksi, yang mana tipe habitat ekosistem

perairan rawanya saja yang berbeda.Di lihat secara giografis, populasi ikan betok yang berada di ekosistem

perairan rawa monoton masih dihubungkan oleh sungai besar (Sungai Barito),

walaupun jaraknya sangat jauh dan harus melewati daerah yang bersalinitas

rendah (daerah pasang surut payau), hal ini menunjukkan adanya keterkaitan

hubungan haplotype, dengan ikan betok yang berasal dari habitat ekosistem

perairan rawa pasang surut. Sedangkan ikan betok yang berasal dari ekosistem

perairan rawa tadah hujan, secara giografis terpisah oleh daratan, sehingga


11/11

hubungan keragaman haplotype terjadi sangat rendah. Kecendrungan ikan betok

yang bisa merayap di permukaan tanah basah untuk mencari lokasi yang memiliki

sumber pakan yang banyak atau untuk mendapatkan sumber air yang lebih

banyak, memungkinkan spesies ikan ini masih dalam suatu kerabat yang dekat.

Terbentuknya spesies simpatrik terjadi karena terpisah secara giografis yang luas

tetapi masih memungkinkan untuk saling berhubungan (Yu et al, 2009).

Untuk meningkatkan keragaman genetik ikan betok, dapat dilakukan

dengan cara introduksi individuindividu baru yang memiliki keragaman genetik

yang lebih tinggi kedalam populasi lokal. Proses introduksi ini dimungkinkan

untuk ikanikan yang telah berhasil di domestikasi. Apabila proses introduksi ini

tidak memungkinkan atau jumlahnya relatif sedikit untuk melakukan restocking,

maka upaya yang ditempuh untuk konservasi genetiknya adalah, membuat suatu

kawasan reservat yang dilindungi oleh Dinas Perikanan setempat bersama sama

dengan masyarakat sekitarnya.

Sumber Pustaka:

Frankham RJD et al. 2002. Introduction to conservation genetics. Cambridge

University Press. Cambridge.

Li LY, Xiao YK, Zi NY, Jie K, Shen M & Li MC. 2009. Genetic diversity

and historical demography of Chinese shrimp Feneropenaeus chinensis in

Yellow Sea and Bohai Sea based on mitochondrial DNA analysis. African

Journal of Biotechnology 8(7), pp. 1193-1202

Soewardi K. 2007. Pengelolaan Keragaman Genetik Sumber Daya Perikanan

dan Kelautan. Departemen Manajemen Sumber Daya Perikanan Fakultas

Perikanan dan Kelautan IPB. P 153.

Shui NB, Zhi QH, Tian XG & Zhen QM. 2008. Tandemly repeated sequence in

5end of mtDNA control region of Japanese Spanish mackerel

Scomberomorus niphonius. African Journal of Biotechnology 7(24), 4415-

4422.

Soule ME. 1983. Genetics and conservation. Benjamin/cummings publishing.

California.

polimorfosme mtdna

Documents