dasar teori hplc

7/22/2019 Dasar Teori HPLC

http://slidepdf.com/reader/full/dasar-teori-hplc 1/9

TUJUAN

1. Mahasiswa dapat mengoperasikan kromatografi HPLC dengan baik sesuai dengan SOP

2. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.

3. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual

pengoperasian HPLC.

DASAR TEORI

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang

biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC

berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap

zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya

merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa

senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam

tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan

mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu

senyawa.

HPLC adalah alat untuk mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif

maupun secara kuantitatif. HPLC sendiri singkatan dari High Performance Liquid

Chromatography. Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi kandungan antibiotik

pada susu dan daging udang, terutama kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula

untuk kegiatan perikanan lainnya.

Kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography,

HPLC) Metode pemisahannya didasarkan pada perbedaan keseimbangan distribusi

komponen sampel antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir).

Tekanan tinggi diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah

absorpsi, partisi, pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al.

spektrofotometr ik (absorpsi sinar UV atau “tampak”, fluorometri, penggunaan senyawa

pendar/fluoresen, senyawa elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi)

http://id.wikipedia.org/wiki/Molekul

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Afinitas&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Padat

http://id.wikipedia.org/wiki/Padat

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Afinitas&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Molekul



Prinsip kerja HPLC

Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan

dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi

pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara

solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam

akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat berinteraksi dengan

fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen

campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk

kromatogram.

Kromatografi HPLC ini digunakan untuk mengidentifikasi suatu sampel secara

kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara

kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.

Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan

standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan

secara kuantitatif adalah:



1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan

larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.

4. Berdasarkan area kromatogram

5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam

kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen

dalam sample.

Instrumen alat

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk

memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase

gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem

kromatografi cair seperti ini :

a. Fasa gerak

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.

Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju

detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam

HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.



Persyaratan fasa gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan

dianalisis.

2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat

mengganggu interpretasi kromatografi.

3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).

6. Sesuai dengan detector.

Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:

a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak

non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang

dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana

atau i-propileter.

b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa

gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.

Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k‟ pada rentang yang sesuai. Untuk

cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k‟

antara 2-5.

b. Pompa

Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk

mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.

Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:

1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)

2. Keluaran bebas pulsa

3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit

4. Bahan tahan korosi

Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

a) Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan

piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung

dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,

sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang

telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.



b) Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi

pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung

tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c) Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah

dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan

(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

c. Injector Sample

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang

mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari

tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)

internal atau eksternal.

Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)

kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila

tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan

ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.

Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik

diputar dari posisi load (“pengisap”) ke posisi inject (“suntik”). Karena sampel akan mengalir

ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik



harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus

diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi

penyuntikan (inject) berlangsung cepat.

Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada

keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan

memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen itu

cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik

pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :

1. Injeksi syringe

Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan

tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari

2-3% dan sering lebih jelek.

2. Injeksi „stop-flow‟

Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara,

sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung

kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.

3. Kran cuplikan

Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran

fasa gerak perlu dua langkah:

a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”, cuplikan

masih berada dalam loop

b) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak

membawa cuplikan ke dalam kolom.

d. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom

merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses

pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan

kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat

(10 -100 μl/menit).



b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika

digabung dengan spektrometer massa.

c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis

kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom

konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,

silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan

silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat

dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-

reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus

fungsional yang lain.

Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi

silanisasi) :

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena

mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun

tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.

Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang

tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang

bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

e. Detektor

Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap

golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap

golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam

KCKT adalah

a) Detektor Universal

Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)

S i O H + + H C lC l S i R

C H 3

C H 3

S i O RS i

C H 3

C H 3



Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor

UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang

digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.

Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena

sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di

analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada

panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang

gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor

dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang

gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini

juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat

melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.

Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,

termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks

bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak

(non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan umumnya digunakan

dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien.

Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :

Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan

bebaskan dari gas terlarutnya.

Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor

stabil.

Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah

detektor indeks bias pada urutan terakhir.

Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner diameter)

yang besar tapi pendek.

Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.

Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.

Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui kolom,

Detektor Spektrometer Massa

Detektor Spektrometer Inframerah



b) Detektor Selektif

Detektor Fluoresensi

Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap energi

pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan tereksitasi dankemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar (ground state) dengan

memancarkan energi pada panjang gelombang yang lebih panjang.

Detektor Konduktivitas Listrik

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan

polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut

yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Adapun

persyaratan detektor yaitu: cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak

cuplikan, respon linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel

2. Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat

kecil

3. Stabil dalam pengoperasiannya

4. Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak

f. Rekorder

Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan

puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif

dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah

peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara

membandingkan waktu retensi (r t) analit atau sampel dengan waktu retensi standar.

Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi

peak dengan metode standar kalibrasi.

dasar teori hplc

Documents