bab iii transfer embryo3

7/23/2019 BAB III Transfer Embryo3

1/36

Teknologi Reproduksi Ternak

Siti Darodjah Rasad, Lab. Reproduksi Ternak Fak. Peternakan UNPAD III-1

BAB III

TRANSFER

EMBRIO (TE)

3.1 Pendahuluan

Selama beberapa puluh tahun program IB telah menjadikan Genetic Progress

menyebar relative cepat dengan penggunaan frozen semen (semen beku). Pada

program IB sumbangan genetic (genetic progress) terutama dari pejantan karenabetina hanya menghasilkan satu pedet per tahun.

Dengan berkembangnya teknik transfer embrio, dimana betina dapat memberikan

banyak keturunan sehingga menghasilkan hasil genetik yang cepat sebagai

komplementer terhadap program IB.


2/36



Pada teknik TE diperlukan betina donor yang pada pelaksanaannya akan

mengalmi superovulasi dengan bantuan preparat FSH sehingga akan

mengakibatkan timbulnya berahi. Selanjutnya dilakukan perkawinan dengan

pejantan bermutu melalui program IB. Hasil perkawinan tersebut akan

menghasilkan embrio yang berkualitas 7 hari post IB.

Untuk lebih memperinci teknik TE tersebut dapat diperhatikan Schema di bawah ini :

Betina donor unggul Beberapa betina resipien

--------------------------------- Penyerentakan berahi ---------------------------------

Superovulasi

Berahi

IB dengan pejantan

Unggul

Koleksi embrio transfer embrio

(Blastosit)

setelah 2 3 bulan istirahat keturunan dengan mutu

kembali untuk TE genetic unggul

Pada proses koleksi embrio, dalam setiap koleksi dilanjutkan dengan identifikasi

embrio dengan tujuan untuk pembekuan embrio (konservasi embrio) atau untuk

segera ditransfer dalam bentuk embrio segar ke resipien.

Betina resipien terlebih dahulu mengalami proses Penyerentakan berahi dengan

betina donor dengan menggunakan hormon Prostaglandin.

Keberhasilan teknik TE ini sangat bergantung kepada :

1.Donor, sebagai produksi embrio transferable2.Resipien, dengan laju kebuntingan tinggi dan konsisten


3/36



3.Prosedur, jadwal, teknik dan peralatan4.Sumber daya manusia, harus terampil

3.2 Sejarah Transfer Embrio

Sejarah Transfer embrio dimulai pada tahun 1890 dengan dilakukannya teknik

Transfer Embrio pada Kelinci yang dilakukan oleh Heape. Kemudian pada tahun

1951 Willet dari USA mencoba melakukan TE pada Sapi dengan memanfaatkan

embrio dari Rumah Potong Hewan.

Pada tahun 1960 berhasil dilaksanakan koleksi embrio dan sekaligus transfer

embrio dengan cara teknik abdominal surgery. Selanjutnya tahun 1965 salah

seorang peneliti dari Jepang yaitu Prof. Sugie berhasil melaksanakan teknikBy

Pass Methodyaitu merupakan teknik non surgery method.

Pada tahun 1970 teknik TE mulai dikomersialkan di USA yang dilanjutkan akhir

tahun 1970 teknik TE dengan non surgery method dengan recovery 6 transfer

diterapkan di lapangan.

Awal tahun 1980 Bilton telah berhasil melakukanfreezing embrio, dan pada tahun

1989 telah lahir lebih dari 10000 Calf(anak sapi) di USA dan pada saat itu teknik

TE dimulai di negara-negara berkembang.

Pada tahun 1984 telah dilaksanakan program TE di Indonesia atas prakarsa Mentri

Koperasi dan Kepala Bulog saat itu yaitu Bustanil Arifin, di peternakan sapi

Cicurug Sukabumi. Saat itu pelaksanaan program TE tersebut dibawah

koordinasi team TE dari USA (Granada Texas) dengan teknik pembedahan

(surgery) padafossa para lumbal.

3.3 PRODUKSI EMBRYO IN VIVO

3.3.1 Managemen Donor

3.3.1.1 Seleksi Donor

Dalam seleksi donor hal yang perlu diperhatikan adalah :

Nilai genetik sangat diutamakan yang merupakan kemampuan memindahkanatau menurunkan nilai atau karakter yang baik

Harus berdasarkan kepada :o Superioritas genetik


4/36



o Kemampuan reproduksioNilai pasar atau ekonomi dari keturunannyao Kondisi kesehatan

Adapun seleksi untuk superioritas genetik ditujukan kepada :

Maternal breeding value Yearling breeding value Weaning breeding value Untuk sapi perah ditunjukkan dengan produksi susu yang tinggi Klasifikasi score yaitu berupa konformasi3.3.1.2 Kesehatan Ternak Donor

Kriteria calon betina donor adalah harus benar-benar sehat, karena apabila

kesehatan menurun akan mempengaruhi proses superovulasi yang akan menurun

juga sebagai akibat kondisi reproduksi yang menurun. Dengan demikian betina

donor mutlak sehat setelah melalui beberapa pengujian sebagai berikut :

1. Test darah2. Vaksinasi3. Kondisi reproduksi normal melalui pengujian dengan palpasi rektal

3.3.1.3 Makanan/Pakan Ternak Donor

Terdapat korelasi positif antara kondisi tubuh dengan pakan yang baik (rasional),

karena dengan kondisi pakan yang jelek akan mempengaruhi tingkat fertilitas

sehingga akan menurunkan tingkat fertilitas. Dengan demikian diperlukannya

kondisi tubuh yang optimal yang didukung dengan kondisi pakan yang baik dan

seimbang.

3.3.1.4 Siklus Berahi Donor

Salah satu kunci utama keberhasilan Transfer embrio (TE) adalah deteksi berahi,

dimana siklus berahi harus setepat mungkin. Hal-hal yang perlu diperhatikan

adalah lamanya siklus berahi harus normal dan teratur, karena apabila siklus

berahi abnormal akan berpengaruh terhadap proses superovulasi.


5/36


6/36



Selain itu visual observasi merupakan faktor utama yang perlu diperhatikan, yakni

melalui

a. Deteksi estrus pasca IB (Inseminasi Buatan) pada pagi dan sore hariselama 30 menit

b. Teknik TE yang harus dilaksanakan tepat waktu dengan timbulnya gejalaberahi yang akan menghasilkan grade berahi sinkronisasi

Intensitas pengamatan sebaiknya dilakukan satu hari sebelum dan sesudah berahi,

dan setiap hari dilakukan 5 kali pengamatan yaitu pada jam 06.00; 10.00; 14.00;

18.00 dan jam 22.00.

Pelaksanaan deteksi berahi dilakukan dengan hati-hati dan tepat, karena

keserentakan berahi antara resipien dan donor sangat berpengaruh terhadap

keberhasilan TE.Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa laju keberhasilan akan lebih baik

apabila resipien berahi dalam 1 (satu) hari donor.

Bagan berikut menunjukkan program TE yang dilaksanakan antara resipien dan

donor.

Hari

0 1 2 3 4 5

Donor FSH FSH FSH FSH IB KOLEKSI EMBRIOPG

FSH FSH FSH FSH IB

PG

Resipien PG PG - 1 0 + 1 TRANSFER EMBRIO

Gambar di bawah menunjukkan cara deteksi berahi pada Kambing dan Sapi

dengan menggunakan pejantan atau dengan menggunakan pewarna chain ball

marker


7/36


8/36



Pemberian PGF2, pada resipien sebaiknya satu hari lebih cepat dari pada donor,

hal tersebut disebabkan pada donor berahi akan timbul 36 60 jam setelah

penyuntikan PGF2, sedangkan pada resipien berahi timbul 48 96 jam setelah

penyuntikan PGF2,.

3.3.3.3 Superovulasi pada Donor

Pada sapi potong, superovulasi dilakukan 9 hari post berahi (9 14 hari post

berahi) dengan melakukan penyuntikan preparat hormon FSH sebagai berikut :

Hari ke 9 : Pagi 5 mg FSH i.m.

Sore 5 mg FSH i.m.

Hari ke 10: Pagi 4 mg FSH i.m.

Palpasi rectal, bila korpus luteum positif suntik dengan 15 mg PGF2,

secara i.m.

Sore 4 mg FSH i.m.

Hari ke 11: Pagi 3 mg FSH i.m.

15 mg PGF2, i.m.

Sore 3 mg FSH i.m.

Hari ke 12 : Pagi 2 mg FSH i.m.

Sore 2 mg FSH i.m.

Hari ke 13: Berahi pada donor dan resipien

Selanjutnya dilakukan IB pada donor pada 12 24 jam setelah standing heat,

dengan interval 2 kali IB yaitu IB pertama 12 jam post berahi dan IB ke dua 24

jam post berahi.

Pelaksanaan superovulasi pada sapi perah secara prosedural adalah sama dengan

pada sapi potong, hanya dosis FSH yang berbeda yaitu :

FSH I dengan dosis pagi dan sore sebanyak 6 6 mg

II dengan dosis 5 5 mg

III dengan dosis 4 4 mg

IV dengan dosis 3 3 mg


9/36



3.3.3.4 Inseminasi Buatan (IB)

Inseminasi Buatan umumnya dilakukan pada donor 12 24 jam pasca standing

heat karena dari hasil penelitian dihasilkan laju fertilitas yang cukup tinggi.

Adapun pelaksanaan IB dilakukan 2 kali sebagai berikut :

0 12 24

standing heat IB ke 1 IB ke 2

dosis semen dosis semen 2 x

1 x atau 2 x

Yang perlu diperhatikan adalah biasanya efek atau pengaruh superovulasi tersebut

memberikan kepekaan yang tinggi sehingga faktor kebersihan (hygiene) harus

diperhatikan dalam artian prosedur dilakukan dengan aseptik.

3.3.3.5 Koleksi Embrio (Embryo collection/Recovery)

Koleksi embrio dapat dilakukan 2 cara atau metode, yaitu :

1. Tanpa pembedahan (Non surgery/non operatif/Transcervical)2. Dengan pembedahan (Surgery/operatif ) pada Fossa Para Lumbal (kiri/kanan)

MetodeNon surgery lebih popular di Eropa, Jepang, Asia (Indonesia) dan Brazil,

sedangkan metode surgery biasa digunakan di USA.

Tahap Pelaksanaan

Adapun tahap pelaksanaan koleksi embrio terdiri dari :

1. Tahap persiapan hewan donor2. Tahap persiapan peralatan dan bahan3. Tahap pelaksanaan koleksi embrio

Tahap persiapan hewan donor

Hewan donor yang dapat digunakan adalah donor pada 7 8 hari post berahi dan

persiapan tersebut meliputi :

Ditempatkan dalam kandang pemaksa


10/36



Rambut pada pangkal ekor yang panjang diguntingo Lakukan pencucian dengan sabun antiseptiko Lakukan pembilasan dengan alcohol 70%

Lakukan anestise Epidural dengan menggunakan 2 5 ml LidocainChloride 2 %

o Pada ruang antar vertebra yaitu tulang sacrum terakhir tulang coccygea pertama

Faeces dikeluarkan dari dalam rectum hingga kosong Dalam rectum ada udara, dikeluarkan dengan menggunakan pompa isap Vulva dan vagina

o Dicuci bersih dan dikeringkan dengan handuko Sterilisasi atau desinfeksi dengan alkohol 70 %

Tahap persiapan alat dan bahan

Alat-alat yang diperlukan adalah :

Cervical expander, yaitu alat untuk membuka canalis cervicalis Mucus remover, yaitu alat untuk membersihkan canalis cervicalis dari

lendir atau mucus

Foley catheter (two way) berukuran 16 20 G (tergantung ukuran canaliscervicalis) terdiri dari 3 saluran yaitu :

o Saluran masuk media flushingo Saluran keluar media hasilflushingo Saluran penggembung balon kecil

Tabung media Tabung penampung hasilflushing embrio Injeksi spuit :

o Pengisap media hasilflushingo Penekan/pengisap balon padafoley catheter

Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan terdiri dari :

ModifiedDulbeccos Phosphat Buffered Saline (M-PBS) dengan komposisi:


11/36



- PBS (-) 9,8 g- Metal salt (NaCl dan Ca Cl2) 1,0 ml (PBS +)- Glucose/Dextrose 1,0 g- Sodium Pyruvate 0,036 g- Penicilline 100.000 IU- Streptomycin 100 mg- Bovine Serum Albumin (BSA) 3,0 mg

Larutan ini dibuat dalam volume 1 Liter.

Tahap pelaksanaan Koleksi Embrio

Teknik Transcervical

Pelaksana atau teknisi bekerja dengan tangan kiri di dalam rektum, yang

bertujuan untuk :

1. Estimasi jumlah korpus luteum, folikel dan ukuran ovarium2. Manipulasi atau menuntun pemasukan alat ke dalam cervix dan uterus3. Manipulasi pelaksanaan koleksi embrio

Cervical expander dimasukkan ke dalam vagina hingga ke dalam lumen cervix.Dianjurkan memakai mucous remover untuk mengeluarkan lendir yang

terdapat banyak di dalam lumen cervix.

Disesuaikan dengan ukuran lumen cervix, masukkan two way Foley catheterhingga masuk ke dalam cornua uteri

Catheter memanipulasi ke dalam uterus (cornua superovulasi terjadi). Balonterletak 5 cm di bawah bifurcatio uteri.

Hati-hati jangan sampai melukai pada saat memasukan catheter Pegang uterus dalam posisi lurus Isi balon catheter dengan udara 10 15 x sehingga ketegangan balon cukup Ketegangan balon sedemikian rupa sehingga menekan dinding uterus, sehingga

media flushing tidak akan masuk ke dalam corpus uteri

Hati-hati dalam memanipulasi ketegangan balon karena dapat menyebabkanruptura endometrium sehingga terjadi perdarahan. Volume udara balon untuk

Heiferadalah 12 16 ml, sedangkan untukCalves adalah 16 20 ml.


12/36



Melalui inlet tube masukkan media flushing (M-PBS) pada suhu 37 C dalambotol sebanyak 1 Liter.

Tekan uterus hingga mencapai ukuran seperti dalam keadaan bunting 40 60hari.

Uterus di masase dan diaduk media yang masuk, melalui pemijitan per rectalsehingga ova atau fertilized egg terlepas dari endometrium

Drainage atau pencucian sebanyak 8 10 kali sebanyak 400 500 ml peruterus

Hasil flushing kemudian dilakukan isolasi embrio dengan cara filtrasi (Emcon,Immuno system)

Diperoleh 40 50 mlflushing(70 Filter) dan tetap dalam filter Tuangkan ke dalam gelas petri (2 3 buah) Lakukan isolasi atau pencarian embrio dengan bantuan mikroskop stereoskopik

(invected microscope)

Untuk lebih jelasnya dapat diperhatikan gambar 13 dan 14 berikut


13/36



Gambar 13. Rangkaian proses panen (Flushing) Embrio pada Sapi dengan menggunakan Folley Catheter


14/36



3.3.3.6. Penanganan Embrio

Embrio hasil koleksi harus melalui beberapa tahapan penanganan yaitu :

Isolasi embrio atau unfertilized ova (UFO) Identifikasi embrio atau unfertilized ova (UFO) Manipulasi embrio atau unfertilized ova (UFO) Klasifikasi embrio atau unfertilized ova (UFO)

Untuk melaksanakan penanganan embrio hasil koleksi atau flushing tersebut

diperlukan tenaga sumber daya manusia yang terampil dan disarankan setiap

sample dikerjakan oleh dua orang teknisi terutama dalam hal penentuanidentifikasi dan klasifikasi embrio.

Embrio hasil koleksi di tuangkan ke dalam cawan petri (petri dish) yang berskala

pada bagian alasnya sehingga memudahkan dalam pencarian embrio

Untuk lebih jelasnya dapat diperhatikan gambar peralatan untuk evaluasi embrio

di bawah ini

Gambar 14. Flushing (Panen) Embrio pada Sapi


15/36



Gambar 15. Cawan Petri berskala

Adapun prosedur pencarian embrio adalah :

1.Emrbio harus berada dalam fresh storage medium (M-PBS + 20 % Calfserum), buang sel-sel runtuhan dari uterus

2.Aspirasi embrio dengan pipetpasteur ( 200 250 m)3.3.3.7 Evaluasi Embrio

Embrio diklasifikasi dan disimpan dalam storage medium pada suhu 15 - 25 C

selama tidak lebih dari 5 jam. Selanjutnya dilakukan pemisahan embrio tersebut

menjadi 2 bagian sesuai dengan tujuannya yaitu untuk ditransplantasi atau

ditransfer ke betina resipien atau dilakukan pembekuan embrio (freezing embryo).

Dalam melakukan evaluasi embrio dengan menggunakan mikroskop dengan

pembesaran 100 200 kali dengan melihat criteria sebagai berikut :

Perkembangan sel (Cell stage development) Morphologi Kualitas embrio


16/36



Umumnya sebagian besar embrio terkoleksi pada tahap perkembangan yang sama,

dimana tahap perkembangan embrio tersebut terdiri dari :

3 hari post berahi : 4 8 sel 4 hari post berahi : 8 16 sel 5/6 hari :Morula 7 hari :BlastocystSelain itu ada cirri-ciri khas pada tahapan morula yang dapat dibedakan yaitu :

Morula merupakan embrio dengan jumlah sel 32 sel, dengan cirri-ciriblastomer individual dan sulit dibedakan satu dengan lainnya. Kondisi

Blastomer seperti massa dari sel- sel.

Compact Morula, ditandai dengan :o Blastomer individual menggumpal (agglutinated) membentuk massa

padat dari sel-sel

o Massa embrio mengisi 60 70 % ruangan perivitelline, dimana ruangperivitelline lebih besar dari tahapan morula

Blastocystdini (Early blastocyst) :o Memiliki ruangan berisi cairanBlastocoeleo Pada tahapan ini memungkinkan membedakan TrophoblastdanInner Cell

Mass (ICM)

o Ruangperivitelline sempit tetapi ada Blastocyst:

o Differensiasi jelas bagian luarTrophoblastoInner cell mass mengisi sebagian besar ruangperivitelline

Expanded Blastocysto Diameter keseluruhan meningkat (1,2 1,5 kali)oZona Pellucida menipis (1/2 kali), dan terkadang collapsedoInner cell mass jelas dan kompak

Hatched Blastocysto Merupakan embrio yang telah terlepas dariZona Pellucidao Bentuknya spheris dan lebih besaro Identifikasi pada saat ini lebih sulit


17/36



Gambar 16,17 dan 18 menunjukkan tahapan perkembangan Embrio Sapi

1 Sel

Inseminasi

2 Sel (28-32 Jam)

4 Sel (45-50 Jam)

8 Sel (60-70 Jam)

16 Sel (3 4 Hari)

Morula (5 7 Hari)

Blastocyst(7 8 Hari)Corona Uteri

Utero Tubal

Junktion

Oviduct

Ovarium

Gambar 16. Tahap Perkembangan embrio di dalam Uterus


18/36



Gambar 17. Tahap Perkembangan Embrio


19/36



3.3.3.8 Kategori Kualitas Embrio

Kualitas embrio ditentukan dengan parameter :

1.

Bentuk2. Warna3. Jumlah sel kompak4. Jumlah sel degenerasi dan terlepas (extruded)5. Jumlah dan ukuran vesicle

Morula

(5 Hari)

Blastocyst Dini

(7 Hari)

Expanded

Blastocyst

(8 Hari)

Hatched

Blastocyst

Blastocyst

(7 Hari)

KompakMorula

(6 Hari)

Gambar 18. Tahap Perkembangan Embrio


20/36



Adapun criteria dari kualitas embrio tersebut adalah sebagai berikut :

A Excellent (Istimewa)Embrio ideal, morphologi sempurna dalam perkembangannya pada setiap

tahapan (normal typical)

A Good(Bagus)Terdapat kelainan pada beberapa sel blastomer (extruded), bentuk tidak

seragam, terdapat beberapa vesicle (10 20 % tidak seragam dan tidak

beraturan)

C Poor (Kurang)Terdapat sejumlah besar blastomer extruded, degenerasi, ukuran berbeda dan

vesicle banyak. Tampak masih hidup (50 % tidak seragam dan tidak

beraturan)

D Non Transferable EmbryoSel degenerasi total, sel terlalu muda (2 32 sel) atau unfertilized ova (UFO)

Gambar-ganbar berikut adalah gambar dari berbagai embrio dalam berbagai tahap

perkembangan embrio :

Gambar 19. Embrio tanpa zona pellucida


21/36



Gambar 20. Sel telur tanpa zona Pellucida

Gambar 21. Embrio tahap 16 Sel

Gambar 22. Embrio tahap 4 sel dengan zona Pellucida


22/36



Gambar 23. Embrio dengan zona Pellucida tidak normal

Gambar 24. embrio tahap 4 sel dengan zona yangnormal

Gambar 25. Sel telur manusia yang telah difertilisaasi


23/36



Gambar 26. Gaambar embrio manusia pada hari ke 3 pada

Tahap 8 sel

Gambar 27. Blastocyst hari ke 5


24/36



3.4 PRODUKSI EMBRYO IN VITRO

Teknik produksi embryo secara in Vitro terdiri dari beberapa tahapan yaitu :

1. Koleksi oocyte immature (oocyte yang belum masak) dari donor2.

Maturasi oocyte yang dikoleksi

3. Fertilisasi In Vitro4. Kultur embryo dibawah kondisi laboratorium (Inkubator CO2)Teknik ini merupakan satu potensi yang baik untuk pemanfaatan sapi dengan genetik

unggul dalam waktu yang simgkat

3.4.1 Koleksi Oocyte (Recovery of Oocytes)

Oocyte (sel telur) dapat dikoleksi atau diperoleh dengan dua (2) cara yaitu :

1. Koleksi dari induk sapi hidup (donor)2. Koleksi dari Ovarium yang berasal dari induk sapi yang dipotong di RPH (pemanfaatan

limbah induk sapi dari RPH)

1. Koleksi oocyte dari Induk sapi hidup (donor)Dari induk donor, sel telur yang belum masak (immature eggs/oocytes) dapat dikoleksi

melalui dua cara pula yaitu :

A. Koleksi oocyte melalui vaginal (Ovum Pick-Up Transvaginal)B. Koleksi oocyte melalui aspiraasi laparoskopi (laparoscopic aspiration)A. Koleksi oocyte melalui vaginal (Ovum Pick-Up Transvaginal/Transvaginal OPU)

Transvaginal OPU dapat dilakukan dengan atau tanpa bantuan alat USG, tetapi dengan

bantuan USG merupakan metode yang umum dilakukan. Dengan teknik atau metode

tersebut dapat dihasilkan 4 5 sel telur immatur dalam sekali percobaan tanpa adanya

stimulasi atau rangsangan hormonal pada ovarium. Sedangkan dengan stimulasi FSH

pada ovarium telah dapat dihasilkan 8 10 sel telur per percobaan.

Metode ini dapat dilakukan dalam 1 atau 2 kali per minggu dan dapat diulang untuk

beberapa minggu dengan resiko yang kecil pada kesehatan dan fertilitas donor. Metode ini

terutama ditujukan atau abaik dilakukan baik pada induk donor yang sangat responsif

terhadap stimulasi hormonal, ataupun yang tidak.


25/36



B. Koleksi oocyte melalui aspiraasi laparoskopi (laparoscopic aspiration)

Dengan metode aspirasi laparoskopi dapat dihasilkan 3 9 sel telur/percobaan pada induk

sapi dan sekitar 22 32 sel telur/percobaan pada sapi dara. Dengan metode ini, rataan

jumlah sel telur yang diperoleh lebih tinggi.

Kedua teknik tersebut di atas dapat dilakukan untuk koleksi sel telur selama periode

kebuntingan tanpa adanya efek yang yang berkepanjangan pada fertilitas ataupun

kesehatan reproduksi induk donor. Sebagai contoh, pada teknik transvaginal OPU, sel

telur dapat dikoleksi pada masa umur kebuntingan mulai 30 120 hari, setiap dua minggu

sekali dengan dihasilkan sekitar 60 buah sel telur selama 3 bulan periode kebuntingan.

Jika diasumsikan diperoleh 30% embryo yang diperoleh layak untuk ditransfer kelak dan

angka kebuntingan 50%, maka dapat dihasilkan 8 9 ekor anak sapi yang berasal dari sel

telur yang dikoleksi dari seekor induk bunting. Berarti secara teori, sangat dimungkinkan

untuk menghasilkan lebih dari 10 ekor anak dari induk bunting selama 13 bulan.

Meode ini dapat juga diterapkan untuk koleksi sel telur dara yang belum puber atau belum

dewasa kelamin (pre puberal), dimana produksi embryo dari ternak donor pre puberal ini

mempunyai potensi untuk mereduksi interval generasi dan meningkatkan mutu genetik,

walaupun kapasitas perkembangan dan pertumbuhan sel telur masih rendah dibandingkan

bila sel telur berasal dari donor yang telah dewasa kelamin. Dengan demikian masih

diperlukannya penelitian lebih lanjut untuk dapat diaplikasikan secara komersial

2. Koleksi dari Ovarium yang berasal dari induk sapi yang dipotong di RPH(pemanfaatan limbah induk sapi dari RPH)

Sumber sel telur untuk menghasilkan embryo dalam skala besar dapat diperoleh dari

Ovarium yang berasal dari induk yang dipotong di Rumah Potong Hewan (RPH).

Sehingga selain untuk tujuan produksi embryo in vitro, juga sebagai pemanfaatan limbah

dari RPH berupa pemanfaatan ovarium.

Sel telur dapat dikoleksi dari ovarium dengan dua cara yaitu :

1. Aspirasi folikel ovarium2. Slicing (sayatan) ovarium


26/36



Kualitas sel telur yang dihasilkan dengan metode ini, hampir sama dengan sel telur yang

berasal donor hidup, akan tetapi kelemahan dari metode ini adalah potensi genetik induk

tidak dapat diketahui dengan pasti.

3.4.2 Maturasi Oocyte (Oocyte maturation)

Segera setelah koleksi sel telur, sel telur tersebut disimpan pada media maturasi dan

diinkubasi selama 22 24 Jam untuk menstimulasi atau meramgsang pemasakan sel telur

dibawah kondisi laboratorium, dalam hal ini inkubasi di dalam inkubator CO2. Untk

mendapatkan kualitas embryo yang baik, maka dapat juga dilakukan co-cultur dengan sel

somatic. Kuiltur atau inkubasi selm telur umumnya dilakukan dalam satu kelompok 10

40 sel telur dalam satu cawan guna mendapatkan perkembangan yang baik.

3.4.3 In Vitro Fertilisaasi (In Vitro Fertilization)

Fertilisasi dilakukan dengan menggunakan semen beku. Pada metode ini, pertama-tama

silakukan pemisahan bahan pengencer dari sperma motil, segera setelah semen beku di

thawing. Cara pemisahan dapat dengan cara :

1. Pencucian langsung2. Swim-up centrifugasi3. Percoll gradient centrifugasi

Teknik selanjutnya adalah sperma ditempatkan di dalam mikrodrops yang telah berisi sel

telur kapasitasi dan larutan heparin. Inkubasi sel telur dengan sperma kapasitasi dilakukan

selama 6 24 Jam. Umumnya sekitar 30 buah sel telur dan 200.000 sperma diinkubasi

dalam sati mikrodrops untuk mendapatkan hasil fertilisasi yang optimal.

3.4.4 Kultur Embryo

Sel telur yang telah difertilisasi dicuci untuk dibebaskan dari sperma. Selanjutnya dikultur

5 7 hari untuk mengikuti perkembangan embryo hingga layak untuk ditransfer.

Fertilisasi dapat dikatakan berhasil dengan adanya pembelahan sel yang secara visual dapat

dilihat setelah 40 42 Jam setelah inseminasi.

Terdapat tiga sistem kultur embryo, yaitu :

1. Kultur embryo di dalam oviduct resipien sementara (domba dan kelinci).


27/36



Dengan metode ini, angka kebuntingan mencapai 60 70 % setelah embryo yang

dihasilkan dibekukan dan ditransfer pada resipien

2. In Vitro kultur zygote (sel telur yang telah difertilisasi) dengan somatik sel (contoh selepithel oviduct, sel granulosa) di dalam medium tertentu

3. In vitro kultur zygote dalam medium sederhana sepeti cairan oviduct sintetis tanpamenggunakan sel somatik

Pada ke tiga sistem di atas, embryo dikultur di dalam mikrodrops dengan dilindungi

dengan mineral oil. Angka kebuntinan untuk ketiga sistem tersebut mencapai 40 56 %.

Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa, kultur embryo di dalam mikrodrops atau dengan

sel somatik dapat meningkatkan produksi, daya tahan serta kualitas embryo. Tabel 2 di

bawah menunjukkan keberhasilan produksi in Vitro dengan metode Transvagianal OPU

Tabel 3. In vitro embryo production following transvaginal OPU.

Duration of

transport

(h)*

No. of

collections

No. of

oocytes (avg)

Oocyte

cleavage (%)

Transferable

embryos (%)

0 177 1771 (10) 1310 (74) 837 (47)

3 to 6 260 1944 (7.5) 1326 (68) 840 (43)

24 34 155 (6.5) 110 (71) 66 (43)

*Time for transporting eggs from farm to laboratory.Source: Bousquet.1997. Proc. Soc. Theriogenology. pp16-21.


28/36



Produksi embrio in Vitro

Bagan Produksi Embrio dan Pelaksanaan Transfer

Produksi embrio in Vivo

I Penyerentakan berahi superovulasi IB evaluasi konservasi embrio

Embrio embrio

Multiple Follikulo- MultipleGenesis Ovulasi

Ovarium Koleksi Oosit OositOosit Klasifikasi Maturasi

Fertiliasi Koleksi Konservasi

Embrio embrio

Penampungan

Semen/thawing Kapasitasi

Semen beku spermatozoa

II sinkronisasi 7 hari pasca berahi Transfer PKBBerahi embrio

Donor

Resipien


29/36



3.5 Teknik Transfer Embrio

3.5.1 Teknik transfer embrio pada Sapi dan Kerbau

Teknik transfer embrio (TE) pada Sapi dan Kerbau awalnya melalui proses

laparotomy atau metode surgery (dengan pembedahan)dengan anesthesia umum atau

local. Tetapi sejak tahun 1978, dilakukan metode tanpa pembedahan yakni transfer

embrio melalui transcervical.

Pada metode transcervical tersebut, mula-mula akan dilakukan palpasi rectal pada

resipien untuk mengetahui apakah pada ovarium terdapat Korpus luteum.

Selanjutnya dilakukan anesthesia epidural untukinduced to prevent straining selama

proses transfer berlangsung.

Embrio yang telah disimpan dalam straw (0,25 ml Straw) dalam keadaan steril

dimasukkan kedalam Transfer Gun (Cassou) dan dilindungi dengan plastik penutup

yang steril. Langkah selanjutnya Transfer Gun masuk ke dalam vagina dan melalui

cervix dengan bantuan tangan operator melalui palpasi rektal akan menuntun

Transfer Gun memasuki tanduk uterus bagian ipsilateral dengan Korpus Luteum.

Embrio didesposisikan ke dalam tanduk uterin.

3.5.2 Teknik transfer embrio pada Domba dan Kambing

Pada Domba dan Kambing umumnya transfer embrio dilakukan dengan cara

pembedahan atau laparotomy dibawah anesthesia umum atau local.

Dengan melakukan penyayatan midventral, embrio dapat ditransfer disertai satu

sedikit medium lansgung ke dalam oviduct, dimana ujung dari pipet kapiler yang

mengandung embrio disisipkan melalui infundibulum untuk mendesposisikan embrio

ke dalam ampulla.

Cara lain adalah apabila transfer embrio di arahkan langsung ke uterus, maka tanduk

uterus ditusuk dengan jarum tumpul, selanjutnya pipet kapiler disisipkan ke dalamlumen uterus. Proses tersebut dapat dilakukan dengan teknik laparoscopy.


30/36



3.6 Penanganan setelah Transfer Embrio

Setelah dilakukan transfer embrio, sebaiknya dilakukan pendugaan atau evaluasi

kebuntingan, dimana angka kebuntingan (Pregnancy rates) tidak dapat dikaitkan

dengan prosentase daya tahan embrio (embryo survival). Angka kebuntingan dandaya tahan embrio dapat dideteksi pada awal masa kebuntingan.

Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa dibawah kondisi ideal, lebih dari 80 %

embrio survive setelah ditransfer pada resipien yang telah mengalami Penyerentakan

berahi terlebih dahulu. Angka kebuntingan tertinggi pada Sapi, Domba dan

Kambing adalah melalui transfer satu embrio ke dalam masing-masing tanduk uterus

resipien. Sehingga kelahiran kembar sering terjadi.

Lain halnya pada Babi, melalui transfer 6 10 embrio pada masing-masing sisi akan

menghasilkan litter size normal, karena hanya sekitar 1,5 embrio yang ditransfer

yang akan menghasilkan keturunan yang sehat saat dilahirkan.

Tahap pelaksanaan transfer embrio dapat dilihat pada gambar berikut.


31/36



Tahapan pelaksanaan Transfer Embryo pada Sapi


32/36



Gambar 28. Tahap pelaksanaan Transfer embrio


33/36



3.7 Pembekuan Embrio

Kelebihan utama dari pembekuan embrio dibandingkan dengan pembekuan sperm atau

oocyt, adalah embrio mengandung komplet genom yang berasal dari pejantan unggul

(semen beku) dan betina unggul, dan embrio dapat ditransfer kepada induk resipien tanpadiketahui atau diketahui latar belakang genetik atau catatatn genetik dari resipien tersebut

serta tanpa adanya kehawatiran adanya resiko perubahan mutu genetik.

Pembekuan embrio sebaiknya di arahkan untuk ternak-ternak di pusat-pusat pembibitan,

dimana bertujuan penyebaran bibit unggul.

Proses pembekuan di awali oleh peneliti Audrey Smith pada tahun 1952 dalam

penelitiannya mengenai Efek temperatur rendah terhadap perkembangan ovum

mammalia, dan selanjutnya menghasilkan beberapa penelitian dengan pembekuan

embrio.

Beberapa penelitian telah berhasil dilakukan terutama tentang cryopreservasi embrio pada

berbagai spesies mammalia dengan berbagai variasi temperatur.

3.7.1 Prinsip dari CryobiologiPrinsip dari biofisik telah diaplikasikan pada cryopreservasi dari sel hidup dan jaringan

serta pada embrio. Embrio akan mengalami kerusakan selama proses pembekuan dan atau

pada proses thawing (pencairan kembali) melalui pembentukan kristal-kristal es intra

seluler atau melalui peningkatan konsentrasi cairan intra seluler yang berubah sehingga

terjadi dehidrasi sel selama pembekuan. Ini dapat disebut sebagai Efek Larutan (Solution

Effects).

Pada proses pembekuan cepat (penurunan temperatur cepat) dapat mengurangi kerusakan

akibat efek larutan, tetapi menyebabkan pembetukan krista es yang akan menyebabkan

kerusakan mekanik pada embrio. Dengan demikian tingkat atau angka pembekuan

optimum untuk jaringan sangat tergantung dari toleransi relatif dari kerusakan akibat

pembentukan kristal es dan akibat efek larutan.

Saat suspensi sel dibekukan dibawah 0 C, akan terbentuk kristal es ekstra seluler, akan

mengakibatkan konsentrasi larutan di dalam air. Membran sel akan akan beraksi untuk

menghalangi penyebaran kristal es ke dalam kompartemen intra selular.

Penambahan agen cryoprotektan seperti Glyserol atau dimethyl sulfoxide pada pembekuan

medium memberikan hasil pembekuan dengan temperatur rendah. Hal tersebut


34/36



disebabkan tidak adanya dehidrasi sel dan akibat dari hilangnya efek larutan, sehingga

embrio dapat dibekukan dengan cukup lambat untuk menghindari pembentukan kristal es

yang besar.

Temperatur kritis dengan pembekuan lambat untuk menghasil angka survival optimal

adalah dari 4 - - 60 C selama pembekuan, dan dari 70 - - 20 C selama pemanasan

kembali.

Embrio mammalia dapat dibekukan untuk waktu lama di dalam larutan jika sesuai dengan

temperatur pembekuan dan tidak ada lagi kejadian aktivitas biologi. Larutan Nitrogen

pada temperatur 196 C adalah cocok untuk kondisi tersebut. Embrio Sapi, Domba dan

Tikus dapat tahan pada pencairan kembali yang cepat (rapid thawing) pada pembekuan

lambat dengan proses terminasi pembekuan paa temperatur 30 dan 50 C dan

kemudian langsung disimpan ke dalam larutan Nitrogen cair pada temperatur 196.

3.7.2 Teknik Pembekuan embrio (Cryopreservasi Embryo)Berbagai variasi teknik pembekuan embrio digunakan untuk cryopreservasi dan thawing

embrio Sapi, Domba, Babi dan Kuda. Ada beberapa kriteria yang harus diperhatikan

dalam teknik pembekuan atau cryopreservasi yakni,

Embrio yang akan dibekukan harus dalam kategori Excellent (Istimewa) Embrio berada pada tahap pembelahan yang benar (Cleavage) Embrio ditransfer dalam keadaan steril, segar tersimpan dalam media kultur hingga

saat digunakan

Jika embrio disimpan dalam medium lebih dari 2 Jam sebelum ditransfer, embrioharus ditransfer ke dalam medium segar setiap 2 jam.

Embrio diisap ke dalam mikro pipet dengan sedikit volume medium (kurang dari 0,2ml medium) untuk mencegah kontaminasi.

3.7.3 Kultur dan penyimpanan pada Temperatur 0 dan 37 CSegera setelah dilakukan panen embrio, embrio disimpan dalam media kultur (culture

medium) pada temperatur 37 C. Perkembangan embrio in vitro sangat lambat

dibandingkan in vivo. Embrio akan berkembang dalam 2 3 hari atau lebih.

Embrio dapat disimpan di dalam kultur media untuk beberapa jam antara waktu koleksi

hingga transfer pada temperatur 15 25C. Jika embrio dibekukan pada 0 dan 10 C atau


35/36



transfer ke dalam oviduct Kelinci, maka dapat disimpan dan bertahan untuk beberapa hari

dengan sedikit mengalami penurunan daya tahannya. Terkecuali embrio Babi tidak dapat

survive pada pembekuan di bawah 15 C.

Beberapa medium yang umum digunakan untuk kultur embrio, yakni :

1. Tissue Culture Medium (TCM 199)2. Dulbeccos phosphat-buffered saline (PBS)

TCM 199 biasa digunakan untuk koleksi embrio, sedangkan media untuk penyimpanan

mengandung 25 mMHEPES bufferdan 10 20 % Calf serum yang telah di filtrasi dengan

menggunakan Millipore-filtered dan di inaktifkan dengan pemanasan selama 30 menit

pada temperatur 56 C.

3.7.4 Prosedur pembekuan Embrio (Embrio Cryopreservation) Medium yang digunakan adalah modifikasiDulbeccos PBS, dengan suplemen bovine

serum albumin (BSA)

Cryopotectant agen ditambahkan pada setiap step pada temperatur 0 C dan 20 C. Embrio dibekukan secara cepat pada 0 C dengan derajat kecepatan pembekuan

1C/menit hingga - 7 C. Pada titik beku dilakukan seeding, yakni pembentukan

kristal es kecil pada medium. Seeding akan meminimalkan fluktuasi temperatur

sebagai akibat panas yang terbentuk.

3.8 Bahan Bacaan

1. Buku Wajib (BW) :

1. Hafez, E.S.E. 2000. Reproduction In Farm Animals. 7th Ed. Lippincott Williams &Wilkins

2. Toelihere, M. R. 1985. Fsisologi Reproduksi Pada Ternak. Penerbit Angkasa Bandung3. Partodihardjo, S. 1987. Ilmu Reproduksi Hewan. Mutiara Sumber Widya. Jakarta

2. Buku Anjuran (BA) :

1. Peters, A.R., and Ball, P.J. 2004. Reproduction in Cattle. 3rd ed. Blackwell Science, Inc.2. Bearden, H.J., J.W. Fuquay and S.T. Willard. 2004. Applied Animal Reproduction.

Sixth Edition. Pearson. Prentice Hall. New Jersey.

3. Rasad, SD. 2004. Teknologi Reproduksi Ternak. Buku Ajar (unpublish)


36/36


3.9 Tugas dan Latihan

1. Jelaskan tahapan proses transfer embrio

2. Jelaskan faktor-faktor apa yang penting diperhatikan dalam teknik TE pada sapi ?

3.Jelaskan prinsip pembekuan embrio ?4.Jelaskan prosedur pembekuan embrio ?

bab iii transfer embryo3

Documents